MICROBIOLOGIE LP 9 ( saptamana 05 09. 01.

2009)
REACTII DE AGLUTINARE
Principiu,
Aglutinare directa,
Coaglutinare,
Hemaglutinare,
Latexaglutinare,
Inhibarea hemo- si latex aglutinarii,
Reactii calitative si cantitative
* PRINCIPIU
Reactia de aglutinare face parte din reactiile antigen anticorp !AgAc", in care,
antigenele sunt de natura corpusculara !cellule bacteriene" sau sunt fixate pe suprafata
unor particule corpusculare !celulare sau anorganice"#

In functie de mecanismele care intervin in reactie, aglutinarea poate fi de mai multe
tipuri$
directa !bacteriana",
indirecta,
pasiva !artificiala",
aglutinare mixta,
hemaglutinare.
In aglutinarea bacteriana, forma agregatelor !aglutinatelor" depinde de locali%area
antigenelor in structura bacteriei$
- aglutinare somatica &'( !Ag ', de suprafata",
- aglutinare flagelara &H( !Ag H, present in structura flagelilor, flagelina",
- aglutinare tip &)i( !Ag )i de invelis, la Salmonella typhi"
* APLICATII
a) I!"nt#$#%a&"a s# t#t&a&"a ant#%'&p#('& a)(*t#nant# sp"%#$#%# n"%*n's%*t#+ #n
p&","nta *n'& ant#)"n" %*n's%*t" (A% n"%*n's%*t#+ A) %*n's%*t")
- *iagnosticul serologic !serodiagnosticul" al unor afectiuni acute, prin evidentierea
Ac specifici !Ig +", determinati in dinamica, in pre%enta unor suspensii bacteriene
cunoscute sau Ag standard,
- *iagnosticul serologic retrospectiv al unei infectii in antecedente !Ig, specifici",
- -videntierea unei stari de imunitate umorala, de protectie,
- -videntierea unei stari de hipersensibilitate umorala,
- .estarea eficacitatii unor vaccinuri#
/
-) I!"nt#$#%a&"a ant#)"n"('& n"%*n's%*t" (%'&p# m#%&'-#"n#) #n p&","nta *n'&
ant#%'&p# %*n's%*t# (s"&*&# a)(*t#nant" p&"pa&at" p" an#ma(")+ #n %a!&*(
!#a)n'st#%*(*# -a%t"&#'(')#% (A% %*n's%*t#+ A) n"%*n's%*t")
- Identificarea serologica a microorganismelor patogene i%olate din produse
patologice, in cadrul unor boli infectioase acute sau cronice,
- Identificarea serologica a microorganismelor patogene i%olate de la personae care
lucrea%a in industria alimentara, industria farmaceutica, de copii batrani, spitale,
pentru depistarea purtatorilor sanatosi de bacterii patogene,
- Identificarea serologica a unor microorganisme i%olate din mediul exterior !aer,
alimente, apa, suprafete inerte etc",#
* TE.NICA REACTIEI
a) IDENTI/ICAREA 0I TITRAREA ANTICORPILOR 0PECI/ICI
NECUNO0CUTI+ IN PRE1ENTA UNOR ANTIGENE CUNO0CUTE
(!#a)n'st#% s"&'(')#%)
D#a)n'st#%*( p'at" $# *n t"st %a(#tat#2 (a)(*t#na&"a p" (ama)
evidentia%a pre%enta anticorpilor in serul de cercetat,
metoda rapida si simpla, ca si tehnica,,
aplicatii$ diagnosticul brucelo%ei, tifosului exantematic,
D#a)n'st#%*( p'at" $# s# *n t"st %ant#tat#2 (a)(*t#na&"a #n t*-*&#)
permite atat evidentierea anticorpilor, cat si titrarea lor in serul de examinat,
una dintre cele mai utili%ate reactii de aglutinare in tuburi este Reactia 0idal
!Anali%a serica calitativa A1C", in dfiagnosticul serologic al febrei tifoide si a
febrelor paratifoide A si 2, pentru identificarea anticorpilor antitifici anti('(, anti
&H( si anti &)i(#
a) 1. A)(*t#na&"a p" (ama
1e foloseste ca metoda calitativa, orientativa, de screening#
Reactiile positive la aglutinarea pe lama se confirma prin reactia cantitativa, de
aglutinare in tuburi#
* Mat"&#a(" n"%"sa&"$ serul de cercetat, antigenul cunoscut, ser fi%iologic 3,456,
lame de sticla curate, degresate, pipeta Pasteur#
* T"3n#%a &"a%t#"# pe lama de sticla se depune o picatura de ser de cercetat !ser de
bolnav" peste care se adauga o picatura de Ag cunoscut#
- 1e omogeni%ea%a cu ansa bacteriologica,
- *aca in serul bolnavului exista anticorpi specifici antigenului utili%at, in /-7 min
se formea%a grun8i de aglutinare stabili, iar lichidul se clarifica#
- Pre%enta grun8ilor specifici de aglutinare indica o reactie po%itiva#
- In ca%ul in care suspensia ramane omogena, reactia se considera negative#
- Reactia po%itiva pe lama trebuie confirmata prin reactia cantitativa in tuburi,
efectuata in dinamica, pentru cunoasterea titrului anticorpilor pre%enti#

9
a) 2 A)(*t#na&"a #n t*-*&#
Mat"&#a(" n"%"sa&"$ ser de cercetat, Ag cunoscut !cultura bacteriana de /4- 93
ore sau germeni omorati cu formol, fenol sau alcool", ser fi%iologic 3,456, tuburi
de aglutinare, stative, baie de apa 59: C, thermostat de 7;: C#
T"3n#%a !" (*%&*$
- pe stativ se asea%a tuburile de aglutinare in numar de 5-< si un tub = +artor de Ag
!ser fi%ioloc > Ag$ nu apare reactie de aglutinare, in lipsa Ac$ + negative al reactiei",
- 1erul de cercetat se adauga cate 3,5 mL, diluat / /3 in tuburile /, 9# *in tubul 9
se trec 3,5 mL in tubul 7 s#m#d *in ultimul tub se arunca 3,5 mL#
- Pentru aglutinarea cu Ag &'(, sistemul se lasa la thermostat 7;:C sau la baie de apa la
59:C, timp de 93 ore, dupa care se face citirea reactiei#
- Pentru aglutinarea cu antigene &H(, tuburile se lasa 9 ore la 53:C sau ?- 5 ore la 7;:C#
- Pentru aglutinarea cu Ag &)i( se lasa 93 ore la 7;:C#
- C#t#&"a a)(*t#na&## se face cu ochiul liber sau cu lupa#
* In tuburile cu reactie po%itiva se formea%a un depo%it cu grun8i mai mici sau mai mari
!in functie de tipul Ag$ &'(, &H(, &)i(", iar lichidul se clarifica#
* In tuburile cu reactie negativa si in tubul +artor, lichidul ramane omogen, opalescent,
fara grun8i#
* La agitarea depo%itului grun8ii se suspenda in lichid$
- la a)(*t#na&"a !" t#p 4O5 sa* 46#5+ grun8ii sunt mici, se disloca greu@ la agitare nu se
distrug, sediment redus, grun8i fini ca firele de nisip,
- in ca%ul aglutinarii tip &H(, grun8ii sunt sub forma de flocoane mari, pufoase, se disloca
si se distrug usor, la agitare, &fulgi de %apada(,
- reactia po%itiva se notea%a cu !>", numarul de plusuri exprimand intensitatea reactiei !>,
>>, >>>, >>>>"#
* T#t&*( ant#%'&p#('& %"a ma# ma&" !#(*t#" (a %a&" s" ma# '-s"&2a apa&#t#a
a)(*t#na&##.
ANALI1A 0ERICA CALITATI6A REACTIA 7IDAL
T*- N&. 1 2 8 9 5 : ;
0"& !"
%"&%"tat
!#(*at 1<10
0+9 0+2 0+1 = = = =
0"& !"
%"&%"tat
!#(*at
1<100
= = = 0+9 0+2 0+1 =
0"&
$#,#'(')#% = 0+2 0+8 = 0+2 0+8 0+9
Ant#)"n
4O5 sa*
4.5
0+: 0+: 0+: 0+: 0+: 0+: 0+:
D#(*t#a
$#na(a
1<25 1<50 1<200 1<250 1<500 1<1000 =
C#t#&# p"nt&* a)(*t#na&"a 4.5 !*pa 2 '&" (a 52>C s# 80 m#n (a t"mp %am"&"# +
p"nt&* a)(*t#na&"a 4O5 !*pa 29 '&" (a 52>C s# 80 m#n (a t"mp %am"&"#.
7
-) IDENTI/ICAREA ANTIGENELOR 0PECI/ICE (%'&p# -a%t"&#"n#)
NECUNO0CUTE IN PRE1ENTA UNOR ANTICORPI (s"&*&# a)(*t#nant")
CUNO0CUTI
Identificarea serologica a microorganismelor patogene se reali%ea%a prin 9 metode$
-) 1. M"t'!a a)(*t#na&## p" (ama
- este un test calitativ,
- utili%at in diagnosticul bacteriologic de urgenta,
- utili%at curent pentru identificarea serologica a enterobacteriilor#
Mat"&#a(" n"%"sa&"
- cultura bacteriana de identificat,
- seruri aglutinante cunoscute,
- sol AaCl 3,456,
- lame curate, decontaminate, degresate,
- ansa bacteriologica, pipete Pasteur,
C*(t*&a -a%t"&#ana !" #!"nt#$#%at
- provine dintr- o singura colonie, deci este cultura bacterina pura,
- cultura tanara, de /4- 9? ore,
- cultura tip &1( !cultura &R( este autoaglutinabila si da reactii fals positive"#
0"&*&#(" a)(*t#nant" %*n's%*t"$
- se obtin prin imuni%area animalelor de laborator, fata de microorganisme sau
antigenele lor,
- pot fi polivalente, cand contin toti anticorpii fata de un anumit germene,
- sau monovalente, cand contin un singur tip de anticorp#
T"3n#%a &"a%t#"#
- pe lama curatata si degresata se pune o picatura de ser aglutinant si la o distanta
suficienta !a nu se amesteca picaturile" o picatura de ser fi%iologic 3,456,
- in ambele picaturi se suspenda si se omogeni%ea%a cu ansa bacteriologica, aceeasi
cultura bacteriana de identificat,
- se inclina lama in sus si in 8os, pentru a se amesteca cele doua componente$ Ag-
Ac,
- in ca%ul unei reactii !>", in picatura formata din ser aglutinant !Ac" si Ag
corespun%ator, apar grun8i fini de aglutinare, in /-7 min, cu clarificarea lichidului,
- in ca%ul unei reactii negative, picatura ramane lactescenta, omogen opalescenta,
- picatura de ser fi%iologic !in care s-a suspensionat cultura de identificat"
repre%inta martorul de cultura$ daca cultura bacteriana e de tip &1(, suspensia este
omogena,
- daca in picatura martor, de ser fi%iologic si in picatura de testat !Ag Ac" apar
grun8i de aglutinare, cultura bacteriana este autoaglutinabila si reactia de
aglutinare este fals po%itiva$ testul nu are valabilitate#
?
%) 2. M"t'!a a)(*t#na&## #n t*-*&#
- metoda este folosita pentru confirmarea reactiei de aglutinare po%itiva pe lama sau
- in reactii incerte de aglutinare pe lama,
- tehnica de lucru este identica cu cea a diagnosticului serologic,
- deosebirea$ componenta necunoscuta este repre%entata de Ag !cultura bacteriana
de identificat",
T"3n#%a !" (*%&*$
- in serii de tuburi se fac dilutii duble din fiecare ser aglutinant$ /93, /?3, /43,
//<3B" in volum de 3,5 mL ser fi%iologic 3,456,
- dilutia de practica pana la titrul maxim al fiecarui ser indicat pe fiola, de catre
producator,
- se adauga in fiecare tub volum egal de suspensie bacteriana !de identificat",
etalonata nefelometric,
- tubul martor +artor de cultura- efectuat pentru a exclude o aglutinare spontana
!tulpina autoaglutinabila" contine numai suspensia bacteriana in ser fi%iologic,
- se agita prin omogeni%are, se incubea%a la 7;:C, timp de 9 ore !pentru
recunoasterea unui Ag flagelar", 93 ore !pentru Ag somatic"#
Int"&p&"ta&"a &"a%t#"#
* R"a%t#" !" a)(*t#na&" #n t*-*&# (?)
- aparitia de aglutinate sedimentate la fundul tubului, lichidul supernatant ramanand clar,
- gradul de po%itivitate se notea%a cu > sau >>, >>>, >>>>, in functie de marimea
depo%itelor si clarificarea supernatantului,
- in tubul +artor si tubul cu reactie negativa, suspensia ramane omogen opalescenta,
- serul care aglutinea%a pana la dilutia cea mai mare, in raport cu titrul aglutinant, indica
specia careia ii corespunde bacteria de identificat,
Ap(#%at## p&a%t#%"
- #!"nt#$#%a&"a -a%t"&##('& pat')"n" !#n )"n*&#(" Salmonella, Shigella,
Escherichia coli "t%.
REACTIA DE COAGLUTINARE
- este o reactie serologica, in care Ac !Ig" este legat prin fragmentul Cc de proteina
A a tulpinii de Staphylococcus aureus CoDan I, si reactionea%a prin fragmentul
Cab !ramas liber" cu Ag corespun%ator, specific, corpuscular, formand complexe
Ag- Ac,
- reactia po%itiva se traduce prin aparitia unei aglutinari vi%ibile macroscopic,
* In practica se aplica pentru$
- identificarea de specie si serotip a tulpinilor de Str.pneumoniae si Haemophilus
influenzae,
- decelarea Ag poli%aharidice solubile direct din prelevat clinic,
- identificarea grupurilor serologice A, 2, C, ,, C, de streptococ beta hemolitic#
5
REACTIA DE AGLUTINARE PA0I6A
- este mai sensibila, poate evidentia cantitati foarte mici de Ac,
- in reactie se foloseste un antigen solubil, fixat pe un support particulat, care
aglutinea%a vi%ibil in pre%enta Ac omolog,
- ca suport, se utili%ea%a particule insolubile, inerte !latex" sau hematii umane
animale,
Reactia de hemaglutinare pasiva$
- absorbtia Ag pe hematii se poate reali%a prin contact direct- fixare spontana dupa
ce hematiile au fost tratate cu substante chimice- fixare chimica sau prin fixare
imunologica,
- reactia de hemaglutinare pasiva = aplicatii$ serodiagnosticul in sifilis, tifos
exantematic, boli autoimmune !autoanticorpi"#
REACTIA DE LATE@ AGLUTINARE
Anticorpii sunt cuplati pe suprafata unor particule de polistiren = latex !substanta
chimica inerta", care permit vi%uali%area mai buna a reactiei de aglutinare Ag- Ac#
Coarte larga utili%are$
- decelarea Ag- lor solubile direct din produs patologic$ LCR, sange ser, urina etc,
- decelarea Ag specifice din cultura bacteriana de identificat !identificare
bacteriana"$ Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae,Neisseria meningitides,
- serogruparea streptocicilor beta hemolitici,
- reactie pe lama intre latex- Ac si Ag specific, reactie rapida, sensibila, pentru
diagnostic direct de identificare bacteriana$ specie, serogrup, serotip etc#
A 6"&#$#%a&"a "$#%#"nt"# st"&#(#,a&## *m"!"
- test chimic$ 2A, = Chemo1trip /7?:C$ utili%at la fiecare ciclu de sterili%are,
- test biologic$ 2A, = 2io1trip !Bacillus stearothermophilus"$ lunar,
<