SPECTROFOTOMETRIE

Proprietatea substanelor de a absorbi selectiv radiaiile electromagnetice st

la baza spectrofotometriei de absorbie i este folosit pentru identificare,
determinarea puritii i dozare.
Spectrele de absorbie se obin la trecerea unui fascicul de radiaii continue
prin substana de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia.
Cantitatea de energie absorbit este n funcie de structura i de numrul
moleculelor i al atomilor substanei cu care interacioneaz fasciculul de
radiaii.
n funcie de domeniile spectrale n care are loc absorbia luminii se
deosebesc : spectrofotometria n ultraviolet (185 400 nm) ; spectrofotometria n vizibil (400 800
nm) ; spectrofotometria n infrarou (peste 800 nm).
Spectrele de absorbie n domeniul ultraviolet i vizibil, numite i
spectre electronice, se datoresc tranziiilor dintre nivelele energetice ale
strilor electronice ale moleculelor.
Spectrele de absorbie n domeniul infrarou se datoresc tranziiilor de
rotaie, de vibraie i de rotaie-vibraie ale moleculelor.

Doz r i l e s pect r of ot omet r i ce n domeni ul ul t r avi ol et i vi zi bi l s e bazeaz
pe ms ur ar ea l umi ni i abs or bi t e at unci c nd es t e respectat legea Bouguer
LambertBeer, care stabi l este relaia dintre lumina absorbit, structura
i concentraia n substana de analizat a soluiei i grosimea stratului
absorbant, pentru o anumit lungime de und exprimat n nanometri.
I = I0 10
-cl
n care :
I = intensitatea luminii transmise ;
Io = intensitatea luminii incidente ;
= constant caracteristic fiecrei substane;
c = concentraia n substana de analizat a soluiei (% m/V) ;
1 = grosimea stratului absorbant (n centimetri).
Absorbanta (A) (densitatea optic, extincia) unei soluii este logaritmul zecimal al
inversului transmitanei (T) (transmisiei) respectiv logaritmul zecimal al
raportului dintre intensitatea luminii incidente (I0) i intensitatea luminii
transmise (I) i este proporional cu concentraia n substana de analizat a
soluiei (c) i cu grosimea stratului absorbant (1).
A = lo g 1/T = lo g Io /I = c1
I
Transmitana (T) (transmisia) este raportul dintre intensitatea luminii transmise (I)
si intensitatea luminii incidente (I0).
T = I/Io
Absorbtivitatea (a) este raportul dintre absorbanta soluiei substanei de analizat
(A) i produsul dintre concentraia soluiei substanei de analizat (c) exprimat
n grame pe litru i grosimea stratului absorbant (1) exprimat n centimetri.
A
a = --- --
c 1
Absorbtivitatea molar (s) (coeficient molar de extincie) este o msur a absorbiei luminii la
o anumit lungime de und, ntr-un strat cu gro simea de 1 cm al soluiei
substanei de analizat cu concentraia de 1 mol/l. Absorbtivitatea molar este
independent de concentraia n substana de analizat a soluiei i variaz cu
lungimea de und.
= a.M

in care :
= absorbtivitatea molar ;
a = absorbtivitatea soluiei substanei de analizat;
M = masa molecular a substanei de analizat.
Absorbanta specific (A 1%\cm ) (extincia specific) la o anumit lungime de und
reprezint absorbanta corespunztoare unui strat de soluie cu grosimea de 1 cm,
care co nine 1 g substan n 100 ml i este o co nstant caracteristic fiecrei
substane.




Cunoscnd valoarea absorbantei specifice se poate calcula concentraia n
substana de analizat, conform formuiei :

C = A / A 1%\cm


Spectrele de absorbie n ultraviolet i n vizibil se obin grafic prin
reprezentarea absorbantei sau a transmitanei n funcie de lungimea de und.
Spectrofotometrul de absorbie n ultraviolet i vizibil se compune din urmtoarele pri
principale : sursa de radiaii, monocromatorul, suportul pentru cuve, detectorul,
amplificatorul i nregistratorul.
Sursa de radiaii este constituit, de obicei, dintr-un be c cu filame nt de
wolfram, pentru domeniul vizibil i dintr-o lamp de hidrogen sau deu-teriu,
pentru domeniul ultraviolet.
Monocromatorul i cuvele snt confecionate din sticl, pentru domeniul
vizibil, i din cuar, pentru domeniul ultraviolet.
Pentru determinrile spectrofotometrice se folosesc dou cuve identice : o
cuv n care se introduce soluia substanei de analizat (soluia-prob) i o cuv
n care se introduce lichidul de compensare constituit din solventul sau amestecul
de solveni i reactivi folosii la prepararea soluiei-prob.
Concentraiile soluiilor se aleg astfel nct valorile absorbantelor s fie
cuprinse ntre 0,30 i 0,70, cnd se obine o precizie satisfctoare a
determinrilor.
Abaterea admis fa de lungimea de und prevzut n monografia
respectiv este de 2 nm.
Determinrile se efectueaz n cuv de 1 cm i la temperatura de 20 0,5 C,
dac nu se prevede altfel.
In tehnica de lucru se prevede concentraia soluiilor, natura solventului i,
atunci cnd este necesar, condiiile de pH n care se efectueaz determinrile.
Dac n monografia respectiv nu se prevede lichidul de compensare,
determinarea se efectueaz folosind ca lichid de compensare solventul de la
prepararea soluiei-prob

VALIDAREA SPECTROFOTOMETRIEI DE ABSORBIE N UV - VIS


Absorbanta A a unei soluii este logaritmul zecimal cu semn schimbat al mrimii inverse
a transmitanei T, pentru o radiaie monocromatic i ea se exprim prin ecuaia :
A =log (l/T) =log (Io/I); T = I / I 0
I
0
=intensitatea luminii monocromatice incidente
I =intensitatea luminii monocromatice transmise

Absorbanta msurat (A) este proporional cu grosimea " b " a stratului de soluie
traversat i deci i cu concentraia " c " a substanei determinate, deci a analitului, n acord cu
ecuaia:
A = .c.b
= absorbanta molar, b se exprim n cm, iar c este concentraia n moli / L.
Expresia A 1% \ cm reprezint absorbanta specific a unei substane dizolvate i se
raporteaz la absorbanta unei soluii cu 1 procent (m/V) la o grosime de 1 cm, la o lungime de
und determinat deci :

A 1%\ cm = 10. /Mr


In general (dac nu sunt alte indicaii) absorbanta se msoar la lungimea de und sau
n intervalul lungimii de und prescris n metoda de analiz i la o grosime de 1 cm la 20
1C, pentru determinarea lui A 1%\ cm . Msurtorile se fac n raport cu acelai solvent
sau cu acelai amestec de solveni.
Absorbanta datorat solventului msurat n raport cu aerul i la lungimea de und sau n
intervalul lungimii de und prescris, nu trebuie s fie mai mare de 0,4 dar este bine s fie mai
mic de 0,2. Apoi se traseaz spectrul de absorbie al substanei reprezentnd grafic valorile
absorbantei (sau ale funciilor acestora) n ordonat, n funcie de lungimile de und (sau
funciile ei) n abscis.
Dac monogafia d o singur valoare pentru poziia maximului de absorbie se admite c
valoarea obinut poate s se abat (ndeprteze) cu 2 nm.

Spectrofotometrele UV - VIS utilizate n aceast metod includ un sistem optic ce poate
furniza lumin monocromatic n regiunea spectral 200 - 800 nm i un dispozitiv potrivit de
msurare a absorbantei.

VALIDAREA SPECTROFOTOMETRULUI

Controlul lungimilor de und: se verific scala acestora, utiliznd maximele de
absorbie ale unei soluii de perclorat de holmiu (R) sau un filtru de oxid de
holmiu (R). Maximele de absorbie i toleranele:
Tabel I
Lungimea de und (nm) Toleranta (nm)
241.2 1
287,2 1
361,5 2
416,2 3
536,3 3

Controlul fidelitii: se verific scala lungimilor de und, utiliznd un filtru de
oxid de holmiu. conform instruciunilor date de fabricant, sau cu ajutorul
absorbantei i toleranelor date n tabel; se pot utiliza radiaiile unei lmpi de
descrcare cu deuteriu sau a unei lmpi cu vapori de mercur de joas presiune.

Controlul absorbantei se efectueaza dup asigurarea c aparatul satisface
controlul absorbantei n UV; se utilizeaz o soluie de bicromat de potasiu 60,06
g%0 n acid sulfuric 0,01 N.
Se msoar absorbanta la lungimile de und indicate n tabelul nr. II, care d valoarea
exact a absorbantei pentru fiecare lungime de und, precum i toleranele admise.



TABEL II
Lung.
und nm
Absorbanta Tolerana max,
235 0,728 0,743 0,753
257 0,865 0,860 0,870
313 0,292 0,287 0,297
350 0,640 0,635 0,645



Pentru controlul absorbantei n vizibil se utilizeaz o soluie de sulfat dublu de cobalt
i amoniu proaspt preparat: 2,110 g %o n acid sulfuric 1 % (v/v). Se msoar absorbanta
soluiei la lungimile de und indicate n tabelul nr. III. n care se d pentru fiecare lungime de
und, valoarea exact a absorbantei i toleranele admise.

Tabel III

Lung. und
nm
Absorbanta Tolerana max.
400 0,026 0,021 0,031
450 0,152 0,147 0,157
500 0,326 0,321 0,331
510 0,346 0,341 0,151
550 0,146 0,141 0,151
600 0,022 0,017 0,027






Pentru controlul fidelitii se utilizeaz trei filtre gri care acoper o gam de absorbante
cuprinse ntre 0,2 i 1,2 ; se utilizeaz valorile date de fabricant sau determinate cu ajutorul
unor fotometre sau spectrofotometre potrivite. Tolerana maxim este de 0,005 uniti de
absorbant.

Metodologici de validare a unui spectrofotometru trebuie includ
detectia limitei de lumin parazit, la o lungime de und dat, cu ajutorul
soluiilor sau al filtrelor potrivite; de ex. absorbanta unei soluii de KC1 (R) 1,2
% (m/V), msurat la o grosime de 1 cm crete n mod abrupt ntre 220 nm i
200 nm i este superioar la 2 uniti, la o lungime de und cuprins ntre 198 mn
i 202 nm atunci cnd ea se compar cu apa distilat ca lichid de compensare
Puterea de rezoluie a aparatului; cnd monografia cere s se efectueze
msurarea puterii de rezoluie a aparatului, se nregistreaz spectrul unei soluii
de toluen (R) 0,02 % (v/v) n hexan (R). Raportul minim ntre absorbanta la
minimul de 266 nm este indicat n monografie.
lrgimea fantei spectrale (mai ales pentru analiza cantitativ) pentru a evita
citirile eronate, atunci cnd instrumentul are o fant cu lrgime variabil; n
general fanta trebuie s fie ngust n raport cu semilrgimea bandei de absorbie,
dar n acelai timp ea trebuie s fie suficient de larg pentru a obine o valoare
mare pentru Io. (Lrgimea fantei este cea care, cu toat diminuarea ei nu
modific citirea absorbantei).

Validarea metodei spectrofotometrice

In procesul de validare a spectrofotometriei este necesar supravegherea liniei de
baz, pentru care se nregistreaz, n cel puin dou reprize, spectrul solventului prescris n
monografie, n intervalul de lungimi de und prescris; spectrele obinute nu trebuie s
difere unul de altul cu mai mult de 0,01 uniti dc absoran.

Trebuie verificat i grosimea cuvelor, deoarece tolerana acestui parametru este de
0,005 cm. Pentru verificarea acestei tolerane se umplu cuvele cu acelai solvent n care se
afl proba de analizat iar lichidul de compensare trebuie s prezinte aceeai transmitan.
Dac nu este aa trebuie s se fac corecia corespunztoare; o mare atenie trebuie s se
acorde cureniei cuvelor.


ETAPELE DETERMINARII

1. Stabilirea lungimii de unda la care absorbanta este maxima
2. Stabilitatea culorii
3. Volumul de reactiv de culoare
4. Curba de calibrare
5. Sensibilitatea metodei
6. Influenta interferentilor