1

VALIDAREA METODELOR ANALITICE

Furnizarea unor rezultate analitice corecte, care ndeplinesc anumite cerine de calitate,
reprezint elementul esenial n cadrul activitii de testare a produselor alimentare. De aceea,
laboratorul trebuie s fie capabil s i desfoare activitatea n conformitate cu toate
standardele naionale sau internaionale n domeniu (SR EN ISO/CEI 17025:2005), cel mai
important aspect tehnic fiind reprezentat de utilizarea unor metode analitice adecvate.
Prin aceasta se nelege necesitatea ca laboratorul s foloseasc metode validate oficial, dac
acestea sunt disponibile, sau cel puin metode n cazul crora s-a demonstrat capacitatea
obinerii unor rezultate sigure i repetabile.
Alte activiti pe care laboratorul trebuie s le implementeze n vederea obinerii unor
rezultate de calitate sunt:
asigurarea trasabilitii; n acest scop echipamentele vor fi verificate metrologic (i.e.
etalonate/calibrate n funcie de specificul fiecruia) sau n cadrul controlului intern de
calitate; tot n acest context, este necesar asigurarea i monitorizarea condiiilor de
mediu pentru a exista certitudinea c parametri mediului ambiant n care se efectueaz
analizele nu afecteaz stabilitatea reactivilor, a materialelor de control, a probelor
biologice i buna funcionare a echipamentelor;
efectuarea controlului intern al calitii (internal quality control/IQC sau inhouse
quality assurance); IQC reprezint un set de proceduri aplicate continuu n cadul
laboratorului n vederea evalurii activitilor desfurate i a rezultatelor furnizate; se
demonstreaz, practic, c metoda funcioneaz n limitele prestabilite, iar rezultatele
sunt destul de sigure pentru a fi oferite beneficiarilor; n cadrul acestui proces se
utilizeaz MR-uri, n situaia ideal acestea fiind i certificate; materialele de control
vor parcurge ntregul proces analitic la care sunt supuse probele necunoscute, sau doar
o parte a acestuia; rezultatele obinute n cadrul acestei activiti pot fi utilizate i
pentru procesul de validare i estimare a incertitudinii de msurare;
participarea la comparri/studii de comparare interlaboratoare
denumite i
experimente de evaluare prin cooperare (SR ISO 5725-1:1997); acest tip de
activitate constituie un control extern al calitii sau un mod de evaluare a competenei
laboratorului. Utilizarea unor metode precise i exacte i implementarea msurilor de
asigurare a calitii vor permite laboratoarelor s furnizeze rezultate corecte, de
ncredere icomparabile la nivel internaional.
Validarea reprezint confirmarea prin examinare i furnizarea unor dovezi obiective care
demonstreaz ndeplinirea cerinelor specifice unui anumit mod de utilizare intenionat (SR
EN ISO/CEI 17025:2005). A valida o metod nseamn a investiga dac este atins scopul
acesteia, reprezentat de obinerea unor rezultate analitice cu un nivel acceptabil de
incertitudine.
Validarea metodelor este legat de :
procedura de autorizare de ctre Comisia European a comercializrii evenimentelor
de transformare;
acreditarea de ctre laboratoarele de testare a metodelor utilizate.

Procesul de evaluare a performanei metodelor propuse de notificatori se desfoar n dou

faze:
prima faz presupune evaluarea datelor i materialelor incluse de notificator n dosarul
oficial; prin materiale se nelege matrici derivate din alimentele, ce conin
evenimentul de transformare/identificare pentru care se solicit autorizarea;
faza a doua corespunde procesului de validare deplin a metodei printr-un studiu de
comparare interlaboratoare; probele testate n cadrul studiului sunt reprezentate de
materialele menionate anterior.
Ca n cazul oricrui proces de validare este necesar n primul rnd specificarea criteriilor
de performan a metodei sau a criteriilor de acceptabilitate pe care aceasta trebuie s le
ndeplineasc pentru a putea fi inclus ntr-un proces de validare deplin (full validation) (faza
a doua).
n cea de-a doua faz, transferabilitatea i performanele metodei sunt evaluate n
cadrul unui studiu de comparare interlaboratoare desfurat n conformitate cu principiile
descrise de Uniunea Internaional de Chimie Pur i Aplicat (International Union of Pure
and Applied Chemistry/IUPAC) i ISO (ex. ISO 5725). Studiul va include cel puin 12
laboratoare naionale de referin din cadrul UE (vezi Anexa II a Regulamentului 1981/2006),
iar evaluarea rezultatelor se va face conform criteriilor ENGL (vezi ENGL, 2008). La sfritul
procesului de validare metodele sunt publicate pe site-ul CRL-GMFF (vezi CRL-GMFF,
2009b), fiind disponibile pentru alte laboratoare de testare.
n cazul n care metodele deplin validate i standardizate nu sunt disponibile sau nu
pot fi implementate, se va opta pentru alte tipuri de metode: metode standardizate folosite n
afara domeniului lor de aplicare, metode standardizate extinse sau modificate, metode
nestandardizate, metode proiectate/dezvoltate de laborator (SR EN ISO/CEI 17025:2005).
n aceste situaii este necesar s se demonstreze c metodele sunt adecvate pentru
utilizarea intenionat (SR EN ISO/CEI 17025:2005), iar aceasta va fi fcut printr-o validare
in-house efectuat n conformitate cu criteriile acceptate la nivel internaional (ex. ISO 5725)
(Recomandarea 2004/787/EC), testarea tuturor parametrilor de performan fiind necesar cel
puin n cazul metodelor dezvoltate de laborator.
Parametri validrii
Parametri de performan ai metodelor de testare OMG, care stau la baza procesului de
validare sunt (ENGL, 2008; el et al., 2008; Trapmann et al., 2007; SR EN ISO 24276:2006;
el et al., 2006; Germini et al., 2004; SR ISO 5725-1:1997):
aplicabilitatea
practicabilitatea
specificitatea/selectivitatea
sensibilitatea
robusteea
limita de detecie (LOD);
limita de cuantificare (LOQ);
nivelul critic
exactitatea
justeea
raza dinamic

repetabilitatea sau precizia intradeterminare (ntre probe diferite analizate n

paralel);
reproductibilitatea sau precizia interdeterminri;
incertitudinea de msurare
Aplicabilitatea se refer la scopul n care este utilizat metoda i presupune
identificarea matricei, analitului, concentraiilor i a tipului de studiu efectuat.
Practicabilitatea reprezint uurina efecturii operaiilor, din punct de vedere al
numrului de probe analizate n unitatea de timp i a costurilor, astfel nct s fie atinse
criteriile de performan solicitate i s fie ndeplinit scopul specificat.
Specificitatea este proprietatea unei metode de a rspunde n exclusivitate la
caracteristicile analitului investigat.
Sensibilitatea reprezint modificarea rspunsului unei metode analitice, raportat la
modificarea corespunztoare a concentraiei unui standard (calibrator). Proprietatea se refer
la curbele de calibrare, concretizndu-se prin modificarea pantei acestora (SR EN
ISO 24276:2006).
Robusteea reprezint msura capacitii metodei de a nu fi afectat semnificativ de
modificri reduse, deliberate, ale condiiilor experimentale descrise n procedur. Modificrile
variaz n funcie de metod De exemplu, pentru real-time PCR trebuie luai n considerare
urmtorii factori: diferite modele ale thermal cyclerului, concentraiile reactivilor, profilul de
timp i temperatur (ENGL, 2008).
LOD este cantitatea sau concentraia (de obicei exprimat ca numr de copii ale
secvenei int) minim a analitului, care poate fi detectat cu certitudine ntr-o prob
analizat, dar nu neaprat i cuantificat. Aceast proprietate trebuie determinat n cadrul
unui studiu interlaboratoare sau prin alte metode corespunztoare de validare (ex. validare inhouse) (ENGL, 2008; SR EN ISO 24276:2006). La acest nivel metoda trebuie s permit
detectarea analitului n cel puin 95% din cazuri, rata de apariie a rezultatelor fals negative
fiind deci 5% .
LOD trebuie s fie sub 1/20 din concentraia int; aceast concentraie int este
reprezentat de pragul relevant pentru cerinele legislative, adic 0,9%, caz n care LOD-ul
trebuie s fie < 0,045%; n cel puin 95% din cazuri; metodele cantitative trebuie s detecteze
prezena analitului la nivelul LOD, asigurnd 5% rezultate fals negative; considerente
referitoare la acest parametru sunt incluse i n SR EN ISO 24276:2006;
LOQ reprezint cea mai redus cantitate sau concentraie (de obicei exprimat ca
numr de copii ale secvenei int) a analitului dintr-o prob test care poate fi determinat
cantitativ, cu un nivel acceptabil de precizie i acuratee (ENGL, 2008; Foti et al., 2006;
SR EN ISO 24276:2006). Acest parametru trebuie determinat n cadrul unui studiu
interlaboratoare sau prin alte metode corespunztoare de validare.
Berdal i Holst-Jensen (2001) fac distincia ntre trei tipuri de limite de detecie i
cuantificare:
absolute, definite anterior; se determin cu ajutorul diluiilor seriale;
relative, i.e. cele mai mici procente de material MG care pot fi detectate,
respectiv cuantificate; limitele relative se determin ca raport ntre limitele
absolute de copii ale secvenei MG int i numrul maxim de copii int pentru

gena de referin, care corespunde cantitii totale de ADN; astfel, dac avem o
limit absolut de 50 copii, ce corespunde unei cantiti de aproximativ 0,06 ng
ADN, limita relativ va fi de 0,03% ntr-o cantitate de
200 ng ADN total; limita de cuantificare poate fi determinat i ca multiplu al limitei absolute
(i.e. rLOQ = 3 rLOD);
practice i.e. limitele funcionale pentru proba analizat; limitele practice se
bazeaz pe coninutul msurat (estimat) al taxonului i limitele absolute; sunt calculate prin
extrapolare lund n considerare probabilitile distribuiilor unor cantiti mici de copii ale
secvenei; modele de determinare a limitelor practice sunt prezentate de Waiblinger et al.
(2006) i Berdal i Holst-Jensen (2001).
LOQ trebuie s fie sub 1/10 din valoarea concentraei int; aceast concentraie int
este reprezentat de pragul relevant pentru cerinele legislative, adic 0,9%, caz n care LODul trebuie s fie < 0,09%; considerente referitoare la acest parametru sunt incluse i n SR EN
ISO 24276:2006;
LC este cea mai redus valoare msurat care demonstreaz, cu un grad suficient de
ncredere, c analitul este prezent (i.e. concentraia > 0)
Exactitatea reprezint gradul de concordan ntre un rezultat obinut prin testare i
valoarea de referin acceptat (teoretic).
Justeea, denumit i exactitate a mediei reprezint gradul de concordan ntre
valoarea medie a unei serii de rezultate obinute prin testare i valoarea de referin acceptat
(teoretic). Msura justeei este exprimat de eroarea de justee, denumit i bias (ENGL,
2008; Trapmann et al., 2007; SR EN ISO 24276:2006), parametru care reprezint diferena
ntre media rezultatelor i valoarea de referin acceptat (NMKL, 1997, n Trapmann et al.,
2007; SR ISO 5725-1:1997) i se determin cu formula:

Repetabilitatea reprezint precizia n condiii de repetabilitate. Condiiile de

repetabilitate presupun obinerea unor rezultate independente n urma analizei unor probe test
identice, utiliznd aceeai metod, n acelai laborator, cu acelai echipament, de ctre acelai
operator i ntr-un interval scurt de timp (SR EN ISO 24276:2006; SR ISO 5725-1:1997).
Germini et al. (2004) au determinat acest paramentru ca raport ntre numrul de rezultate
corecte obinute i numrul total de analize efectuate n condiii de repetabilitate.
Abaterea standard a repetabilitii reprezint abaterea standard a rezultatelor
obinute n condiii de repetabilitate. Aceasta este o msur a dispersiei distribuiei rezultatelor
n condiii de repetabilitate. Tot n acest scop pot fi utilizai termenii varian a
repetabilitii i coeficient de variaie a repetabilitii (ENGL, 2008; ISO/FDIS, 2006, n
Trapmann et al., 2007; SR EN ISO 24276:2006; SR ISO 5725-1:1997).
Limita de repetabilitate (r) este valoarea sub care este situat, cu o probabilitate de
95%, diferena absolut dintre dou rezultate obinute n condiii de repetabilitate (SR ISO
5725-1:1997).
Reproductibilitatea reprezint precizia n condiii de reproductibilitate. Condiiile

de reproductibilitate presupun obinerea rezultatelor n urma analizei unor probe test identice,
utiliznd aceeai metod n laboratoare diferite, cu echipamente diferite sau de ctre operatori
diferii (SR EN ISO 24276:2006; SR ISO 5725-1:1997).
Abaterea standard a reproductibilitii (reproducibility standard deviaition/RSDR)
reprezint abaterea standard a rezultatelor obinute n condiii de reproductibilitate. Aceasta
este o msur a dispersiei distribuiei rezultatelor n condiii de reproductibilitate. Tot n acest
scop pot fi utilizai termenii varian a reproductibilitii i coeficient de variaie a
reproductibilitii (ENGL, 2008; ISO/FDIS 3534-1, 2006, n Trapmann et al., 2007; SR EN
ISO 24276:2006; SR ISO 5725-1:1997).
Limita de reproductibilitate (R) este valoarea sub care este situat, cu o probabilitate
de 95%, diferena absolut dintre dou rezultate obinute n condiii de reproductibilitate (SR
ISO 5725-1:1997).