III.

METODE DE ANALIZ BAZATE PE

INTERACIUNEA RADIAIILOR
ELECTROMAGNETICE CU MATERIA
Aprofundarea unor noiuni predate la curs
III.4. SPECTROMETRIA DE ABSORBIE N ULTRAVIOLET I
VIZIBIL (UV/VIS)
A. ABSORBIA RADIAIILOR DIN DOMENIUL UV-VIS I FACTORII DE
CARE DEPINDE ACEASTA
Energia necesar schimbrii distribuiei electronilor implicai n legturi chimice
(efecte electronice) este de ordinul a civa electronvoli i, n consecin, fotonii absorbii
sau emii n timpul unui astfel de fenomen sunt din regiunea ultraviolet i vizibil situat ntre
190 i 700 nm (~1-7 eV). Culoarea perceput de ochiul uman este rezultatul unor tranziii
electronice produse n urma absorbiei radiaiei din domeniul VIS.
Grupele de atomi la nivelul crora are loc absorbia radiaiilor UV-VIS poart
numele de cromofori. Termenul cromofor a fost utilizat prima dat pentru legturile
nesaturate ntre grupe de atomi, eseniale pentru producerea culorii, dar n timp, studiile de
absorbie a radiaiilor s-au extins n regiunea ultraviolet, iar termenul s-a generalizat,
incluznd toate gruprile care absorb n UV-VIS. Exist ns cromofori care absorb n
regiuni inaccesibile spectrofotometrelor uzuale (sub 190 nm) i de aceea analiza acestora
este deseori imposibil.
Tabelul 1. Cromofori conjugai i auxocromi
Compus

max [nm]

Cromofor

Eten
Butadien
Crotonaldehida
Sulfanilamida n soluie alcalin

C=C
C=C-C=C
C=C-C=O
HN O2S-C6H4-NH2

Sulfanilamida n soluie de HCl

H2NO2S-C6H4-N H3

185
217
217
251
218
265

max
-1
-1
[M cm ]
8000
21000
16000
16300
12700
1080

Deplasarea lungimii de und a maximului de absorbie, max, i modificarea

intensitii benzii de absorbie a unui cromofor, exprimat prin coeficientul molar de
absorbie max (termen care va fi definit ulterior), sunt determinate de ambianele atomice din
molecula din care face parte (tabelul 1), interaciunea cu solventul, deplasarea echilibrelor
de ionizare n soluie etc. (figura 1). Variaiile mici de temperatur nu modific spectrele
electronice n soluie. Pentru a descrie aceste influene i modificri spectrale se lucreaz
cu cteva noiuni specifice:
+
grupare auxocrom grupare saturat de atomi, -OH, -NH2, -S-, -Cl, -N H3, care
ataat unui cromofor modific lungimea de und max la care are loc absorbia i
intensitatea maximului de absorbie
deplasare batocrom spre rou deplasarea maximului de absorbie la lungimi de
und mai mari (energii de excitaie mai mici)
deplasare hipsocrom spre albastru - deplasarea maximului de absorbie la lungimi
de und mai mici (energii de excitaie mai mari)
efect hipocrom scderea intensitii absorbiei

efect hipercrom creterea intensitii absorbiei

Ambiana atomic
(efecte electronice)

Interaciunea cu
solventul

Deplasarea echilibrelor
de ionizare, etc.

max
max
Figura 1. Influena unor factor asupra benzii de absorbie a unui cromofor

Efect
batocrom

Absorbie

Absorbie

n figura 2 sunt prezentate schematic deplasrile unei benzi electronice de

absorbie.

Efect
hipercrom

Lungime de und

Absorbie

Absorbie

Lungime de und

Efect
hipsocrom

Lungime de und

Efect
hipocrom

Lungime de und

Figura 2. Tipuri de deplasri ale unei benzi de absorbie

( iniial, final)

Corelarea absorbiei n UV-VIS cu structura este mai mult empiric, foarte muli
compui avnd spectre electronice asemntoare, de aceea, pentru identificarea complet
a structurii unui compus, msurtorile spectrofotometrice n UV-VIS trebuie s fie corelate
cu alte tipuri de date spectrale i/sau teste chimice. Totui spectrometria UV-VIS reprezint
o tehnic accesibil i relativ ieftin care permite obinerea unor informaii legate de detalii
structurale (configuraie, formarea complecilor i determinarea raportului lor de combinare
etc.), de regul dup prelucrarea matematic a spectrelor (derivatele spectrelor), aplicarea
unor metode chemometrice etc.

B. LEGEA BEER-LAMBERT

Msurarea gradului de absorbie a unei radiaii cu o anumit lungime de und de

ctre o substan n soluie este guvernat de legea Beer-Lambert (figura 3):
A = log (I0/IT) = a l c
unde:
A - absorban
a - absorbtivitate sau coeficient de absorbie a unei substane ntr-un solvent dat
l - lungimea cuvei n care se afl soluia
c - concentraia substanei
I0 intensitatea radiaiei incidente, IT intensitatea radiaiei transmise
Indicele inferior se refer la faptul c mrimile depind de lungimea de und la care se
lucreaz. Lungimea de und de lucru este aleas, de regul, lungimea de und
corespunztoare maximelor de absorbie max (pot fi msurate astfel cantiti mici de
substan, iar influena temperaturii asupra A la max este minim).
Denumirea i valoarea lui a depind de modul de exprimare a concentraiei. Dac c
se exprim molar (numr de moli per litru de soluie), a se noteaz i se numete
-1
absorbtivitate molar (coeficient molar de absorbie). Unitatea de msur a lui este l mol
-1
cm . n analiza farmaceutic, concentraiile i cantitile sunt de regul exprimate n grame
sau miligrame i mai puin sub form de moli i, din aceast cauz, pentru determinri
cantitative se lucreaz cu absorbana specific:
A1%
1cm

care este absorbana unei soluii cu concentraia 1 g / 100 ml, msurat n cuva de 1 cm.
-1
-1
Unitatea de msur a absorbanei specifice este dl g cm . Dac se cunoate absorbana
specific la max, se msoar absorbana soluiei prob la aceeai lungime de und n cuva
de 1 cm, iar concentraia, exprimat n g/100 ml, va fi:
A
c = 1%
A 1cm
Cuv cu soluia
prob

IT

I0
c
l

Figura 3. Absorbia luminii de ctre o soluie

Proporionalitatea direct dintre A i c stipulat de legea Beer Lambert se

respect pe anumite domenii de concentraii i, de aceea, este important ca n determinrile
cantitative s se demonstreze c pe domeniul de concentraii de lucru exist liniaritatea A
c (coeficientul de corelare r > 0,99 vezi laboratorul de EAI corespunztor).
n practica spectrometriei de absorbie se mai lucreaz cu noiunea de transmitan,
T, sau transmitan procentual, T%, definite ca:
T=

IT
I0

T% =

IT
100
I0

relaiile dintre absorban i transmitan fiind urmtoarele:

A = 2 logT%

A = logT

C. APLICAII ALE SPECTROMETRIEI UV-VIS N ANALIZA

CANTITATIV
DETERMINRI CANTITATIVE DIN PROBE CARE CONIN
UN SINGUR ANALIT
n cel mai simplu mod, dozrile spectrometrice n UV-VIS se pot realiza preparnd
proba sub forma unei soluii ntr-un solvent transparent (nu absoarbe n domeniul spectral n
care se lucreaz) i msurnd absorbana acesteia la o lungime de und adecvat.
Determinarea concentraiei se face apoi prin:

Calcularea cu ajutorul absorbanei specifice pornind de la legea Beer-Lambert

Compararea absorbanei soluiei prob cu cea a unei soluii standard a
analitului de interes din prob; soluia standard este obinut n acelai mod ca
proba, iar concentraia acesteia este egal cu cea ateptat n prob metoda
standardului extern

Raportarea absorbanei soluiei prob la o scar de absorbane obinut cu o
serie de soluii standard ale analitului de interes; soluiile standard sunt
preparate n acelai solvent ca soluia prob, iar concentraiile acestora sunt
situate ntr-un domeniu care include concentraia ateptat n prob - metoda
standardelor externe sau metoda curbei de calibrare
Caracteristicile acestor metode:
- Lungimea de und este, n general, selectat la un maxim de absorbie (max) deoarece
astfel efectele variaiilor de temperatur i ale erorilor de setare ale scalei lungimilor de
und sunt minime.
- Ideal, concentraia trebuie s fie ajustat aa nct absorbana soluiei s fie aproximativ
0,9, valoare n jurul creia acurateea i precizia sunt optime. Atunci cnd se utilizeaz
metoda curbei de calibrare, concentraiile soluiilor standard se aleg astfel nct
absorbanele s fie situate n domeniul 0,20 0,90 (n cazul spectrometrelor
ultraperformante, domeniul A poate fi extins ntre 0,10 i 1,50), dar n cazul
msurtorilor efectuate cu spectrometre de generaie veche acestea au o precizie
satisfctoare dac absorbanele sunt situate n domeniul 0,30 - 0,70.
- De obicei determinrile cantitative se fac msurnd absorbana la o singur lungime de
und corespunztoare unuia dintre maximele de absorbie. Alternativ, absorbana poate
fi citit din spectrul obinut pe un anumit domeniu de lungimi de und, aceast variant
fiind preferat n studiile calitative sau n anumite situaii cnd este nevoie s se lucreze
cu valori ale absorbanei la mai multe lungimi de und.

Determinri cantitative pe baza absorbtivitii

Reprezint o cale simpl pentru determinarea concentraiei i se bazeaz pe
folosirea direct a legii Beer - Lambert, cunoscnd coeficientul de absorbie. Principul este
redat schematic n figura 4.

Absorbana, A la
lungimea de und
, cuva de 1 cm

cx
Soluia
prob

c x ,%(m/V) =

factor

Coeficientul de
absorbie,
sau A1cm1% la o
anumit

Tabele
specifice

Figura 4. Principiul determinrii cantitative pe baza absorbtivitii specifice

(factorul poate include gradul de diluie, raportarea la o anumit cantitate de prob sau la un anumit
mod de exprimare a concentraiei, corecia datorat limii cuvei de msur dac aceasta nu este 1
cm etc.)

n continuare vor fi prezentate cteva aplicaii ale acestei metode de evaluare

cantitativ.
Exemplul 1
O cantitate de pulbere de comprimate de furosemid echivalent la 0,25 g furosemid este extras cu 300 ml NaOH
0,1 M sub agitare. Se completeaz la 500 ml cu acelai solvent, apoi o poriune se filtreaz i 5 ml filtrat se
dilueaz la 250 ml cu NaOH 0,1 M. Absorbana soluiei finale la 271 nm este 0.596, iar absorbana specific
A(1%,1 cm) = 580 n soluie bazic, la 271 nm. S se calculeze cantitate de furosemid pe comprimat i procentul
acesteia fa de cantitatea declarat. Se dau: cantitatea de pulbere de comprimate cntrit: 0,519 g; masa a 20
de comprimate: 1,656 g; cantitatea declarat de furosemid pe comprimat: 40 mg.
Masa medie a unui comprimat va fi m = 1,656 / 20 = 0,0828 g
A/A(1%, 1cm) g JJJ. 100 ml soluie final
X JJJJJJJJJ.. 250 ml soluie final
X = A/A(1%, 1cm) 2,5
X JJJJJJJJJ. 5 ml soluie iniial
Y JJJJJJJJJ. 500 ml soluie final total
Y = A/A(1%, 1cm) 2,5 500/5 = A/A(1%, 1cm) 250
YJJJJJJJJJ... 0,519 g pulbere de comprimate luat n lucru
Z JJJJJJJJJ.. 0,0828 g masa medie a unui comprimat
Z = A/A(1%, 1cm) 250 0,0828 / 0,519 = A/A(1%, 1cm) 39,88
De unde:
Z = 0,596 39,88 / 580 = 0,04098 g furosemid / comprimat
ceea ce nseamn n procente fa de cantitatea declarat:
Z% = 0,04098 / 0,040 = 102,4 %
Exemplul 2
Calculai concentraia n g/ml a unei soluii de triptofan (cu masa molecular 204,2) n acid clorhidric 0,1 M, a
crei absorban la max = 277 nm este 0,613 n cuva de 4 cm. Absorbtivitatea molar a triptofanului la 277 nm este
5432 M-1 cm-1.
Din legea Beer-Lambert:
c = A/(l)
de unde:
0,613
c=
= 2,82x10 5 mol l1 = 2,82x10 5 x204,2 g l1 = 0,00576 g l1 =
5432x4

= 5,76 g ml1

Metoda standardului extern de evaluare cantitativ

Se utilizeaz o soluie standard din substana de referin a crei concentraie cs
trebuie s fie apropiat de valoarea concentraiei ateptate n prob cprob. Determinarea
cantitativ propriu-zis se bazeaz pe proporionalitatea A c, iar principiul este
schematizat n figura 5.
Absorbana Ap la
lungimea de und
, n cuva de l cm

cx

Cuva cu prob

cx =

A pc s
As

Absorbana AS la
lungimea de und
, n cuva de l cm

cs

Cuva cu soluia
standard

Figura 5. Principiul determinrii cantitative pe baza standardului extern

(cx i cs sunt concentraia probei i, respectiv, a soluiei standard)

Metoda se aplic atunci cnd se verific legea Beer Lambert i exist substan
de referin cu puritate adecvat. Este des aplicat n monografiile din farmacopei.

Determinri cantitative pe baza curbei de calibrare

Pornind de la legea Beer - Lambert, pentru un sistem cu o singur specie
absorbant n regiunea de interes, absorbana este direct proporional cu concentraia
analitului. Prin urmare, pentru o serie de soluii standard de analit (minimum 5 soluii) cu
concentraiile ci se msoar absorbana acestora la lungimea de und de lucru Ai i se
traseaz o curb de calibrare A = f(c). Aceast curb aproximeaz cel mai bine variaia A =
f(c) n sensul c punctele sunt uniform repartizate de-a lungul acesteia. Concentraiile
soluiilor standard trebuie s fie cuprinse ntr-un domeniu care acoper concentraiile
ateptate n probe. Orice alt soluie de analit n acelai solvent, creia i se msoar
absorbana n aceleai condiii experimentale cu cele de la trasarea curbei de calibrare,
poate fi estimat cantitativ din curba de calibrare prin interpolare grafic (figura 6) sau cu
ajutorul ecuaiei matematice care descrie aceast curb.
Ax
cx

A
x
x

Ax

Prob

x
x

A1
c1

A2
c2

A3
c3

Ai
ci

cx

Serie de soluii
standard

Figura 6. Principiul determinrii cantitative prin metoda standardelor externe (metoda curbei de
calibrare)

Curbele de calibrare sunt trasate, de regul, ca fiind drepte, considernd directa

proporionalitate A = f(c), acestei proporionaliti corespunzndu-i o ecuaie de gradul unu:
A = a c + b. Dreapta este valid dac r > 0,99 (r, coeficient de corelare vezi laboratorul de
EAI corespunztor). Cunoscnd ecuaia dreptei de calibrare, concentraia unei probe se
calculeaz cu relaia c = (A-b)/a.
Atunci cnd absorbana variaz neliniar pe domeniul de concentraii considerat, se
liniarizeaz computerizat datele sau se atribuie o funcie neliniar care fiteaz cel mai bine
punctele experimentale.
Exemplu de calcul. Valorile absorbanelor la 272 nm ale unor soluii standard de substan medicamentoas, unei
soluii prob cu aceeai substan i martorului sunt date n tabelul urmtor. Calculai, folosind analiza de regresie
liniar, parametrii ecuaiei dreptei de calibrare i concentraia probei.
Concentraia (
g/ml)
c
0
10
20
30
40
50
Prob

A272
0,000
0,125
0,243
0,364
0,478
0,598
0,128

Parametrii ecuaiei dreptei de calibrare se calculeaz cu ajutorul unui program de calcul tabelar sau pe baza
formulelor pantei i intercepiei, a i b, date n cri de specialitate. Ecuaia dreptei este:
A = 0,0118 c + 0,0073, iar r = 0,9999
Concentraia probei va fi:
cx = (0,128 - 0,0073)/0,0118 = 10,22 g/ml

D. APARATUR
Spectrele de absorbie se obin cu ajutorul spectrofotometrelor. n figura 7 este
prezentat schematic un spectrofotometru de absorbie cu monofascicul, format din patru
componente principale:

Figura 7. Schema unui spectrofotometru de absorbie

a. Sursa de radiaie
O surs ideal ar trebui s emit o radiaie continu, cu intensitate uniform pe un domeniu
larg de lungimi de und. Pentru domeniile UV apropiat i VIS (350 - 900 nm) sursele sunt
lampa cu filament de tungsten sau cu halogen, iar pentru ultraviolet (190-350 nm) lampa cu
descrcare n deuteriu, cu nveli de cuar. O surs foarte intens pentru ambele regiuni
este lampa cu arc n xenon la nalt presiune. Lampa produce radiaii pn la valori mai mici
de 200 nm.
b. Monocromatorul
Monocromatorul are rolul de a descompune radiaia n componentele sale i poate fi prism,
reea de difracie sau interferometru.
c. Celula (cuva) de absorbie
Are form paralelipipedic, ferestrele cuvelor fiind confecionate din materiale care permit
transmiterea radiaiilor fr s absoarb semnificativ: sticl Pyrex, cuar, materiale plastice
transparente pentru vizibil i cuar topit pentru ultraviolet.

Figura 8. Cuve de diferite tipuri folosite n spectrometria UV-VIS

d. Detectorul
Detectorul este sensibil la radiaia care cade pe el, transformnd-o ntr-un semnal electric.
Acest semnal este redat apoi sub forma unui spectru trasat electronic pe un ecran sau pe
hrtie cu ajutorul unui nregistrator. Spectrul poate fi nregistrat ca absorban A sau
transmitan procentual T% n funcie de frecven , numere de und sau lungime de
und . Detectorii pot fi fotomultiplicatori n care fotonii care cad pe suprafaa unui metal,
cum este cesiu, duc la emisia de electroni (fotoelectroni). Aceti electroni sunt accelerai
sub tensiune i cad pe suprafaa unui alt electrod de unde, n urma ciocnirilor, prin schimb
de energie se emit un numr mai mare de electroni secundari, procesul repetndu-se astfel
nct se obine pe anod (ultimul electrod) un curent mare. Se mai pot folosi plci fotografice
sau detectori formai din iruri (barete) de fotodiode (figura 9), care prezint avantajul de a
putea detecta un domeniu larg de lungimi de und n acelai timp.

Figura 9. Schema unui spectrofotometru UV-VIS

cu detector cu ir de diode

Figura 10. Schema unui spectrofotometru UV-VIS

cu fascicul dublu

n cazul spectrofotometrelor cu dublu fascicul (figura 10), radiaia incident este

mprit n dou, astfel nct aceasta trece simultan att prin cuva cu prob, ct i prin
cuva cu soluia martor (conine toate componentele soluiei prob, cu excepia analitului de
determinat). Prin aceast construcie, scderea absorbanei martorului se face automat n
timpul msurtorii.