Universitatea de Medicin i Farmacie Craiova

TEZ DE DOCTORAT
STUDIUL ANGIOGENEZEI N ACCIDENTELE
VASCULARE CEREBRALE DE TIP ISCHEMIC

- REZUMAT -

COND. T.

DRD.

Prof. univ. SIMIONESCU

CRISTIANA EUGENIA

MRGRITESCU OTILIA
CLARA

CRAIOVA 2012

CUPRINS
INTRODUCERE

PARTEA GENERAL
Capitolul I
Vascularizaia cerebral- anatomie i fiziologie

Capitolul II
Etiopatogenia accidentelor vasculare cerebrale (AVC)

21

Capitolul III
Clasificarea i prognosticul accidentelor vasculare cerebrale

30

CERCETRI PERSONALE
Motivaia studiului

45

Capitolul IV
Material i metod

46

Capitolul V
Rezultate

59

Capitolul VI
Discuii

127

Capitolul VII
Concluzii

158
158

Bibliografie

161

Lista cu lucrri publicate

177

INTRODUCERE
Accidentul vascular cerebral (AVC) este una din cele
mai importante probleme de sntate public, cu un puternic
impact socio-economic la nivel mondial, fiind totodat i o
cauza major a disabilitilor n rile nalt dezvoltate. Astfel, sa estimat o prevalen general de circa 0,2%, 30% din aceti
pacieni preconizndu-se c vor deceda, iar 30% vor
supravieui cu sechele neuro-funcionale. De asemenea, la
nivel mondial se preconizeaz c, pn n anul 2015, numrul
pacienilor cu un prim AVC va crete la circa 18 milioane, cifr
care ar crete n 2030 la 23 de milioane. Dac n prezent rata
mortalitii prin AVC este de 10%, pentru anul 2030 se
estimeaz c va ajunge a doua cauz major de deces.
Datele oficiale raportate pentru Romnia indic faptul c
suntem pe locul 10 n lume n ceea ce privete incidena AVC,
iar potrivit raportului pe anul 2008 al Comisei Europene i al
Organizaiei pentru Dezvoltare i Cooperare Economic
(OCED) ocupm locul doi ca i rata a mortalitii.
n ultimele decenii s-au nregistrat numeroase progrese
n nelegerea mecanismelor moleculare i celulare care stau
la baza dezvoltrii AVC. Unul din evenimentele cheie n
procesul de regenerare la nivelul unui esut ischemic este
angiogeneza. Acest fenomen ce presupune formarea de noi
vase de snge din cele preexistente s-a dovedit a avea loc i
adiacent zonelor de lichefacie i, chiar mai mult, densitatea
acestor noi vase se coreleaz cu timpul de supravieuire dup
instalarea unui AVC.
Studiul realizat a avut ca obiective stabilirea tabloului
morfo-clinic al AVC ischemice de la subiecii umani, precum i
extinderea cunotiinelor legate de procesul de angiogenez
ce are loc n evoluia acestei patologii.
1

Cuvinte cheie: accident vascular cerebral, ischemie,

angiogenez, factorul de cretere al endoteliului vascular,
microdensitate vascular, receptorii 1 i 2 ai factorului de
cretere al endoteliului vascular.

I. STADIUL CUNOATERII
Capitolul I - Vascularizaia cerebral- anatomie i
fiziologie- descrie elemente clasice de anatomie macro- i
microscopic a vascularizaiei de la nivel cerebral. n
continuare sunt redate cele mai noi date privind fiziologia
vascularizaiei cerebrale, respectiv mecanismele care
guverneaz schimburile de la nivelul barierei hematoencefalice.
Capitolul II - Etiopatogenia accidentelor vasculare
cerebrale ischemice- sunt prezentate cele mai noi date cu
privire la factorii de risc incriminai n producerea accidentelor
vasculare cerebrale i, respectiv, patogenia leziunilor care au
loc, n evoluia acestor boli.
n capitolul III - Clasificarea i prognosticul
accidentelor vasculare cerebrale- sunt prezentate datele
clasice privind clasificrile anatomo-clinice a accidentelor
vasculare cerebrale i sunt introduse cele mai noi achizitii
privind prognosticul i evoluia acestei patologii umane.

II. CERCETRI PERSONALE

Dei s-au fcut numeroase progrese n nelegerea
mecanismelor moleculare i celulare ce stau la baza
dezvoltrii AVC, multe din evenimentele intrinseci ale acestora
i, mai ales, modul lor de evoluie i interconectare nu sunt
nc pe deplin elucidate. nc din 1993 s-a evideniat faptul c
la subiecii umani decedai prin stroke, la cteva sptmni de
la instalare a crescut densitatea capilarelor sanguine din aria
peri-infarct, iar aceasta s-a corelat cu timpul de supravieuire
al acestor bolnavi. De atunci, numeroase studii experimentale
de stroke dezvoltate pe animale de laborator au evideniat
existena unui proces de angiogenez implicat n evoluia
acestei patologii.
Totui, aceste modele animale de stroke au limitri
majore, ele nereuind s reproduc fidel heterogenitatea
aspectelor legate de severitatea, patologia i comorbiditile
asociate acestei boli, dezvoltate la subiecii umani i, implicit,
toate rezultatele experimentale obinute trebuiesc privite i
interpretate cu circumspecie atunci cnd vrem s le
translaionm la om. n acest sens, studiul ntreprins de noi i
propune s elucideze unele din aspectele angiogenezei din
AVC ischemice dezvoltate la subiecii umani. Astfel, am
nceput studiul prin caracterizarea ct mai complet
epidemiologic, clinic i imagistic a unui numr de 127 de
cazuri de AVC de tip ischemic. Apoi, pe un lot restrns de 22
de pacieni decedai cu stroke ischemic am investigat
morfologic toate aspectele lezionale, inclusiv pe cele legate de
angiogenez. n continuare, studiul s-a axat pe cercetarea
intit la nivel celular i molecular a procesului de
angiogenez post-stroke ischemic dezvoltat la 15 subieci
umani. Preconizm ca rezultatele astfel obinute s ilustreze
implicaiile patogenice ale angiogenezei n AVC de tip
ischemic cu posibilitatea ca prin cercetri viitoare s fie
identificate noi inte prognostice i terapeutice n aceast
patologie uman.
3

Capitolul IV intitulat Materiale i metode are ca prim

obiectiv descrierea materialului de studiu precum i a
tehnicilor folosite.
Materialul cercetat a fost material uman, provenind din
Clinica de Neurologie a Spitalului Clinic de Urgen, Nr. 1,
Craiova i a fost reprezentat de un numr de 154 de AVC
diagnosticate n intervalul de timp 2008-2011 (30 septembrie).
n evaluarea ulterioar clinico-morfologic au fost investigai
numai pacienii cu AVC ischemice n evoluie (127 de cazuri),
excluzndu-se pacienii cu AVC hemoragice, pe cei cu AVC
ischemice tranzitorii, lacunare i pe cei cu AVC dezvoltat n
teritoriul arterei bazilare. Materialul histopatologic a provenit
de la un numr de 22 de cazuri de AVC ischemic n care a
survenit decesul la diverse intervale de timp, iar din acestea sau selectat 15 cazuri care au fost procesate i
imunohistochimic.
Mai nti s-a efectuat o prelucrare i interpretare clinicoepidemiologic i imagistic a datelor, principalele variabile
urmrite fiind: incidena AVC ischemice, distribuia AVC
ischemice n funcie de vrst i sex, rata general a
mortalitii prin AVC ischemic i particularitile sale n funcie
de: decadele de vrst i sex, principalii factori de risc
implicai n patologia ischemic cerebral i diversele lor
asocieri, particularitile clinico-topografice ale AVC ischemice
investigate, precum i aspectele sugestive pentru diagnostic
al investigaiei imagistice de tipul tomografiei computerizate
(CT)
Prelucrarea i interpretarea histopatologic a datelor s-a
efectuat prin tehnica histopatologic clasic de includere la
parafin, utiliznd ca i coloraii: hematoxilina eozina, tricromic
Mallory, Cresyl violet i Luxol Fast Blue - Periodic acid-Schiff
Albastru de Toluidin. S-a urmrit evidenierea leziunilor
instalate la nivelul parenchimului cerebral n evoluia AVC
ischemice comparativ cu zonele controlaterale i zonele
corespondente de la subieci decedai prin alte cauze dect
cele ischemice cerebrale.
Prelucrarea imunohistochimic s-a desfurat pe dou
direcii: cu detecie enzimatic i respectiv, cu detecie
fluorescent. Tehnica utilizat a fost cea indirect cu LSAB
(Labelled Streptavidin-Biotin2 System), iar panelul de anticorpi
folosit este redat in tabelul de mai jos:
4

Anticorpi utilizai n studiul AVC ischemice

Nume

Clon
oarece,
CD68
IgG1k
Iepure,
CD105
policlonal
Iepure,
GFAP
policlonal
NeuN Iepure, IgG1
VEGF

VEGF
VEGFR1
VEGFR2
CNPaza
Ki-67

Iepure, IgG2
Iepure,
policlonal
Iepure,
policlonal
Iepure,
policlonal
oarece,
IgG1
Iepure,
policlonal

Diluie

Demascare Productor

1:100

0.1 M citrat

Dako

1:50

0.1 M citrat

Thermo
Scientific

1:20.000

0.1 M citrat

Dako

1:1000
0.1 M citrat,
1:200
(cromogenic)
0.1 M citrat
1:30
(fluorescen)

Millipore
Santa Cruz

1:50

0.1 M citrat

Santa Cruz

1:50

0.1 M citrat Sigma Aldrich

1:50

0.1 M citrat

Abcam

1:20

0.1 M citrat

Thermo
Scientific

1:25

0.1 M citrat Neomarkers

Anticorpii folosii n acest studiu s-au adresat:

identificrii specifice a diverselor subpopulaii celulare
din parenchimul cerebral normal i, respectiv, cu infarcte
ischemice (NeuN - neuroni, CD68 microglii i macrofage,
GFAP- astrocite, CNP-aza- oligodendrocite i celulele
Schwann);
vizualizrii vaselor de angiogenez (CD105);
evaluarea potenialului angiogen din AVC ischemice:
evidenierea expresiei i a localizrii VEGF i a receptorilor si
VEGFR1 i VEGFR2 prin reacii duble de imnofluorescen
(cealalt int vizat fiind tipul de celul nervoas care
exprim markerii proangiogeni respectivi);
aprecierii microdensitii vasculare (CD105) i a
neovaselor active (dubla CD105/Ki-67);
5

Capitolul V - Rezultate i Capitolul VI - Discuii

redau principalele rezultate obinute n antitez cu datele
existente n literatur.
n studiul nostru, n intervalul de timp 2008-2011 (30
septembrie), AVC ischemice au reprezentat aproximativ
82,47% din totalul accidentelor vasculare cerebrale
investigate. Acestea au predominat uor la sexul masculin, cu
un raport de 1,15:1 n favoarea brbailor. Grupa de vrst
cea mai afectat a fost decada a VII-a, fiind diagnosticate
aproximativ 25% din AVC ischemice investigate. Potrivit
estimrilor OMS, n anul 2002 s-a preconizat o inciden
global a AVC de 15,3 milioane, din care mai mult de o treime
(5,5 milioane) s-a estimat c ar evolua spre deces (Reinhardt,
2005). Cercetrile efectuate asupra populaiilor din Europa au
artat c procentul populaiei cu vrsta de peste 65 de ani la
care se dezvolt, de regul, AVC va crete de la 20% n 2000
la 25% n 2050, iar vrsta medie va crete de la 37,7 ct era
n 2000 la 47,7 n 2050 (World Population Prospects, 2004).
Att incidena ct i prevalena AVC este mai mare la brbai
dect la femei n marea majoritate a rilor i cresc cu
naintarea n vrst.
Pe cazuistica noastr, studiul incidenei primului AVC n
funcie de factorii de risc asociai a evideniat prevalena
ndeosebi a persoanelor cu HTA, de regul de sex masculin i
cu vrsta mai mare de 50 de ani (22,85% din totalul
cazuisticii). Pe locul doi s-au situat persoanele ce au asociat
dislipidemii (14,17%), urmate de cele cu fibrilaie atrial
(4,73%) i, respectiv, diabet zaharat (0,8%). n Anglia, 50%
din AVC ischemice au fost cauzate de HTA (Hankey i
Warlow, 1994). Se estimeaz c riscul dezvoltrii de-a lungul
vieii a unui AVC se reduce la jumtate la cei cu valori ale
tensiunii arteriale de <120/80 mm Hg, tratamentul i scderea
tensiunii arteriale la persoanele hipertensive asociindu-se cu o
reducere semnificativ a riscului de stroke (Buse i colab.,
2007). Spre deosebire de persoanele cu nivel normal al
glicemiei, cele cu teste pozitive de toleran la glucoz au risc
dublu de a dezvolta stroke, acesta crescnd de trei ori la
persoanele diagnosticate cu DZ (Vermeer i colab., 2006).

Potrivit clasificrii lui Mena i colab. a infarctelor

cerebrale n raport cu cronologia modificrilor morfologice, pe
cazuistica investigat de noi, majoritatea AVC ischemice
(63%) au fost diagnosticate n faza de organizare. Prima
modificare morfologic dezvoltat n AVC ischemice
investigate de noi a fost leziunea neuronal, respectiv
moartea neuronilor. Astfel de neuroni au fost observai iniial
n centrul AVC ischemice, prezentnd aspectul necrozei de
coagulare, iar mai trziu n evoluia infarctelor au fost prezeni
i n zona de penumbr sub form de celule necrotice sau
apoptotice. Numeroase studii au artat c moartea neuronal
se produce prin trei mecanisme majore: apoptoz, autofagie i
necroz de coagulare, toate cele trei putndu-se dezvolta n
accidentele ischemice cerebrale (Lipton, 1999; Taoufik i
Probert, 2008). n studiul nostru, n afara leziunilor neuronale
am mai consemnat ca i leziuni celulare, necroza de
coagulare a microgliilor, oligodendrocitelor i astrocitelor din
centrul zonei de infarct cerebral, precum i proliferri i
activri ale unor astfel de celule n zona de penumbr.
Studiul efectuat de noi a evideniat existena unui proces
de angiogenez n imediata vecintate a ariilor de lichefacie
constnd n apariia de noi vase de regul imature, de calibru
mic, neacoperite de pericite i cu defecte ale membranei
bazale. O serie de studii efectuate pe modele animale de
ischemie cerebral vin s confirme dezvoltarea de noi vase la
marginea zonei de infarct cerebral, vase care au ns o
morfologie profund alterat (Morris i colab., 2003).
n premier am efectuat evaluarea microdensitii
vasculare (MVD) de la nivelul ariilor de infarct ischemic
cerebral dezvoltate la om prin cuantificarea vaselor marcate
cu CD105. n studiul nostru, MVD a fost mai crescut n aria
perilezional la subiecii cu AVC instalat de cel puin 5 zile,
valorile cele mai mari nregistrndu-le la cei cu AVC mai vechi
de 7 zile. Marea majoritate a studiilor din literatur au artat
c MVD a crescut numai n teritoriul ischemic adiacent zonelor
necrotice (Manoonkitiwongsa i colab., 2001), fenomenul de
angiogenez
post-ischemic
neextinzndu-se
n
tot
parenchimul cerebral deservit de artera cerebral medie
obstruat (Zhang i colab., 2002).
7

Studiul nostru este primul care caracterizeaz distribuia

spaial
a
semnalului
de
fluorescen
privind
imunoreactivitatea pentru VEGF la nivel lezional i perilezional
comparativ cu zona de lichefacie i aria corespondent
controlateral. n esuturile lezionale post-stroke, cea mai
intens reactivitate pentru VEGF am observat-o la nivelul
neuronilor, aceast reactivitate crescnd cu vrsta leziunii i
dinspre zona de lichefacie spre esuturile adiacente aparent
normale. n modelele experimentale animale de ischemie
cerebral s-a observat o cretere a expresiei VEGF la nivelul
emisferului cerebral ischemiat la mai puin de 3 ore de la
instalarea leziunii, expresia meninndu-se crescut timp de 3
(Marti i colab., 2000) pn la 7 zile (Wei i colab., 2001).
Investigaiile noastre de colocalizare fluorescen au
evideniat existena unei reactiviti pentru VEGFR1 mai ales
n ariile adiacente zonelor de lichefacie, acest receptor fiind
exprimat la nivel neuronal, n astrocitele gemistocitice, n
macrofagele spumoase ce invadeaz aria necrotic i la
nivelul endoteliilor vaselor pre-existente i de neoangiogenez
adiacente zonelor necrotice. Kovacs i colab. au evideniat
expresia imunohistochimic a lui VEGFR-1 n celulele
endoteliale din aria cerebral de infarct i la periferia acesteia,
maximum de reactivitate fiind nregistrat la 7 zile de la
producerea ocluziei arterei sylviene la obolan (Kovacs i
colab., 1996).
n studiul nostru am remarcat prezena unei reactiviti
pentru VEGFR2 limitat la nivelul neuronilor din vecintatea
ariilor de necroz, a gemistocitelor, macrofagelor spumoase i
a endoteliilor vaselor de angiogenez. Marti i colab. au
constatat pierderea expresivitii pentru VEGFR-2 n zonele
de infarct i meninerea acesteia n restul zonelor cerebrale la
mai mult de 24 de ore de instalarea ocluziei arterei cerebrale
medii (Marti i colab., 2000). La 48 de ore de la instalarea
ocluziei, autorii au raportat inducerea expresiei ARN-ului
mesager al VEGFR-2 la marginea zonelor de lichefacie i n
membrana pial adiacent, maximum de expresivitate fiind
nregistrat la 72 de ore.
8

n Capitolul VII sunt redate concluzii studiului nostru.

Astfel, studiul epidemiologic al cazuisticii AVC
nregistrate n Spitalului Clinic Judeean de Urgen, Nr. 1,
Craiova de-a lungul intervalului de timp 2008-2011 a scos n
eviden prevalena accidentelor de tip ischemic (82,5%),
dezvoltate mai frecvent la brbaii (raportul pe sexe 1,15:1) de
peste 60 de ani (75%) i care au cumulat ca i factori de risc
HTA i dislipidemii (24%).
Rezultatele studiului clinic au artat prevalena
sindroamelor de afectare a arterei cerebrale medii (80%), mai
mult de jumtate din aceti pacieni prezentnd la momentul
instalrii AVC ischemic, sindromul afectrii teritoriului
superficial al arterei sylviene, avnd ca simptom dominant
hemiplegia facio-brahial contro-lateral. Pe locul doi ca i
inciden s-au situat pacienii cu AVC ischemice produse ca
urmare a interesrii mai multor teritorii arteriale cerebrale, iar
pe ultimul loc cele produse prin afectarea arterei cerebrale
posterioare (3%).
Studiul imagistic a artat c tomografia computerizat
convenional i-a adus un real aport diagnostic n primele 24
de ore de la instalarea AVC ischemice n sub 41% din cazuri,
acurateea sa diagnostic crescnd la 70% prin repetare n
cazurile neconfirmate la examenul iniial. Examinarea dup
administrarea substanei de contrast s-a dovedit a fi util, mai
ales, n cazurile n care CT convenional a fost needificator,
acurateea sa diagnostic, dar i de localizare topografic a
leziunilor s-a dovedit, ndeosebi, dup 24 de ore de la
instalarea AVC ischemic.
Rata general a mortalitii a fost de circa 42%, fiind
ceva mai crescut la brbai (44% versus 39%) i cu valori
maxime ndeosebi n rndul bolnavilor cu vrsta de peste 80
de ani. Cea mai nalt rat a mortalitii am consemnat-o n
grupul pacienilor ce au prezentat asocieri de mai multe
sindroame de afectare a ramurilor arteriale cerebrale (85%),
n timp ce la polul opus s-au situat pacienii diagnosticai cu
AVC ischemice produse n teritoriul arterei cerebrale
posterioare (11%).
9

Investigaia
histopatologic
a
evideniat
heterogenitatea
leziunilor
cu
interesarea
tuturor
compartimentelor celulare din parenchimului cerebral
ischemiat. Totodat, aceste leziuni au prezentat o anumit
cronologie ca dezvoltare i evoluie. Astfel, moartea neuronal
debuteaz din primele minute i continu zile n ir, dar
procesul este limitat spaial de o reacie inflamatorie care
debuteaz din prima zi i care, evolutiv, i schimb caracterul
din acut n unul de tip cronic i se finalizeaz printr-o cicatrice
ntr-un interval de timp mergnd de la circa 2 sptmni la luni
i ani de zile. n cazuistica noastr, majoritatea AVC
ischemice necropsiate au fost diagnosticate n faza de
organizare (63%).
n limitarea distruciilor neuronale un rol hotrtor l
joac procesul de angiogenez care potrivit studiului nostru
debuteaz ncepnd din a 3-a zi, valorile maximale ale
microdensitii vasculare (MVD) precum i existena unei
reacii proliferative endoteliale nregistrndu-se n zilele 6-7
post-stroke.
Studiul morfologic al procesului de angiogenez n
AVC ischemice a evideniat faptul c:
topografic, procesul este prezent n imediata
vecintate a ariilor de lichefacie, respectiv adiacent cicatricei
gliale n formare;
se prezint sub forma unor reele de neovase cu
arhitectonic haotic, cu un pattern extrem de complex, cu
numeroase puncte de ramificaie, multiple arcade vasculare i
un aspect tortuos evident;
neovasele au avut diverse grade de maturitate,
cele mai imature fiind plasate adiacent ariilor necrotice au avut
un calibru mai mic, nu au fost acoperite de pericite, lipsindu-le
chiar membrana bazal i, nu rareori, am evideniat i celule
endoteliale izolate. Ceva mai la distan de ariile necrotice i
pe msur ce leziunile evolueaz n timp, gradul de
imaturitate al acestor neovase a sczut;
de regul, aceste neovase, indiferent de
topografie, au prezentat grosimi variabile ale membranei
bazale, neregulariti de contur, discontinuiti, discoeziuni ale
celulelor endoteliale cu membrana bazal i un numr redus
de contacte cu procesele astrocitelor nconjurtoare;
10

Investigaia expresiei imunohistochimice a VEGF n

AVC ischemice a evideniat prezena unei reactiviti n
compartimentul neuronal, care a crescut cu vrsta leziunii i
dinspre zona de lichefacie spre esuturile adiacente aparent
normale. n plus, n vecintatea zonelor de lichefacie am mai
consemnat reactivitate pentru VEGF la nivelul astrocitelor
gemistocitice i a microgliilor activate non-fagocitice.
Deasemenea, am mai consemnat o bun reactivitate i din
partea macrofagelor spumoase prezente n ariile necrotice i
adiacent acestora i din partea endoteliilor vaselor de
angiogenez.
n studiul ntreprins de noi, imunoreactivitatea pentru
VEGFR1 s-a suprapus temporo-spaial cu cea pentru VEGF,
nregistrnd reactivitate n neuronii adiaceni ariei necrotice, n
astrocitele gemistocitice, n macrofagele spumoase ce
invadeaz aria necrotic, precum i la nivelul endoteliilor
vaselor pre-existente i a celor de angiogenez adiacente
zonelor necrotice.
O reactivitate aproape similar am consemnat-o i
pentru VEGFR2, cu meniunea c doar endoteliile vaselor de
angiogenez au fost pozitive pentru acest marker i c nu am
consemnat nici un fel de reactivitate n zonele cerebrale
neafectate ipsi- i contralaterale i nici n specimenele
recoltate de la subiecii martori care nu au prezentat patologie
vascular cerebral.
Un astfel de pattern al expresiei VEGF i a receptorilor
si sugereaz existena unor mecanisme de tip autocrin i
paracrin care la nivel neuronal i astrocitar au efect protectiv
n faa agresiunii ischemice, limitnd procesele distructive i
favoriznd recuperarea funcional a structurilor persistente.
n plus, coexpresia VEGF i a receptorilor si la nivelul
vaselor de angiogenez este martorul activitii i
funcionalitii acestor vase n vederea limitrii leziunilor
ischemice.
Acest profil proangiogen dovedete potenialele efecte
benefice pe care le poate aduce o terapie bazat pe
administrarea de ageni agoniti ai celor doi receptori
VEGFR1 i VEGFR2 n tratamentul bolnavilor cu AVC
ischemice care supravieuiesc mai mult de 72 de ore de la
instalare.
11