Influenta polifenolilor asupra actiunii amilazelor

Abstract
Prezenta lucrarea are drept obiectiv studiul efectului inhibitor al compusilor f
enolici din ceaiul verde si negru asupra activitatii enzimatice a amilazelor din
faina de malt in vederea obtinerii unor extracte cu aplicabilitate in industria
alimentara.
Ambele ceaiuri au prezentat actiune inhibitoare diferita asupra enzimei n functie
de tipul de ceai analizat si de concentratia probei supusa analizei.
Cuvinte cheie : Polifenoli, amilaza, ceai verde
Introducere
Datorita actiunii lor antioxidant polifenolii ceaiului verde si negru au proprie
tati benefice asupra organismului, precum reducerea riscului de cancer, a bolilo
r cardiovasculare si chiar de prevenire a fenomenelor specifice imbatranirii. n l
iteratura se mentioneaza ca polifenolii din ceaiul verde prezinta actiune antira
dical mai puternica dect vitamina C sau E. n acelasi timp, polifenolii pot inhiba
enzimele digestive, reducnd digestibilitatea alimentelor.
Unii cercetatori (Zhang, J.; Kashket, S.) considera capacitatea ceaiurilor de a
reduce continutul de zahar din snge, ca fiind proprietatea care sta la baza ntrzier
ii proceselor de mbatrnire. S-a demonstrat ca att ceaiul verde, ct si ceaiul negru a
u actiune antidiabetica, ambele fiind benefice n prevenirea si tratarea diabetulu
i, probabil datorita mecanismului de inhibare a activitatii amilazei asupra amid
onului ingerat. Ceaiul inhiba att a-amilaza salivara, ct si a-amilaza din sucul pa
ncreatic. Ca urmare, transformarea amidonului n zaharuri simple este ncetinita si
cresterea nivelului de glucoza n snge este minimalizata. Mai mult, potrivit unui s
tudiu recent, ceaiul poate reduce absorbtia intestinala a glucozei. Astfel, unii
autori afirma ca o singura ceasca de ceai verde inhiba activitatea enzimatica a
amilazei cu 87% (Zhang, J.; Kashket, S.).
Ceaiul verde furnizeaza mai ales fenoli simpli, pe cnd ceaiul negru contine n spec
ial polifenoli complecsi. Ceaiul negru prezinta o capacitate inhibitorie mai put
ernica dect ceaiul verde. nlaturarea taninurilor din ceai cu gelatina determina pi
erderea activitatii inhibitorii asupra amilazelor.
Compusii polifenolici din ceai care sunt eficienti n inhibarea activitatii enzima
tice a a-amilazei sunt reprezentati de: epigalocatechin-galat, epicatechin-galat
, epigalocatechina, epicatechina, (+) catechina si izomerul acesteia, teaflavina
, teaflavinmonogalat A, teaflavinmonogalat B si teaflavindigalat.
Amilazele sunt enzimele care catalizeaza reactii de hidroliza a legatur
ilor a-1,4-glicozidice din amidon, glicogen si poliglucide derivate ale acestora
, conducand la produsi cu greutate moleculare mica: dextrine, maltoza, glucoza.
Cele mai active se gasesc in saliva si in sucul pancreatic al omului si al anima
lelor, in mucegaiuri, cereale incoltite. Se impart in trei grupe:
1.
a-amilazele ( endoamilaze; dextrinogenamilaze) hidrolizeaza legaturile a
-1,4-glicozidice din interiorul moleculelor de amidon conducand la dextrine dife
rite ca marimi; sunt raspandite in majoritatea drojdiilor, microciuperci si bact
erii, in semintele plantelor si in unele lichide biologice animale ca saliva, su
c pancreatic, sange;
2.
-amilaze ( exoamilaze; zaharogenamilaza) hidrolizeaza legaturile a-1,4-gl
icozidice de la capetele nereducatoare ale lanturilor poliglucidice din amidon,
conducand la eliberarea de maltoza si dextrine limita datorita neatacarii legatu
rilor a-1,6-glicozidice. Sunt raspandite mai ales in semintele cerealelor;
3.
?(gluco)-amilaze ( a-1,4-glucan-glucohidrolaze; a-amiloglucozidaze) hidr
olizeaza atat legaturile a-1,4 cat si a-1,6-glicozidice de la capetele nereducat
oare ale lanturilor poliglucidice din amidon, conducand la eliberarea de glucoza
. Sunt raspandite in microorganisme, mai ales in microciuperci; se gasesc in muc
oasa intestinala a mamiferelelor, inclusive a omului.

Amilazele sunt inactivate la temperature inalte si cu ajutorul inhibito

rilor chimici. Recent s-a demonstrate ce extractele de ceai verde si ceai negru
au proprietati inhibitorii partiale asupra acestor enzime.
Ceaiul verde si ceaiul negru reprezinta doua dintre cele cinci varietat
i de baza ale aceleiasi plante Camellia sinesis (ceai alb, ceai verde, oolong, c
eai negru sip pu-erh). Ceaiul verde este supus unui tratament cu aburi, pentru a
nu fermenta; inainte de uscare, frunzele sunt rulate aidoma celor de tutun, faz
a in care capata o culoare galben-verzuie. La ceauil negru oxidarea este mai pro
funda (dureaza ore intregi) si datorita acestui indelungat proces de fermentare,
contine de trei ori mai multa cafeina decat celelalte tipuri de ceai.
Att ceaiul negru ct si cel verde contin cantitati mari de flavonoide; cu t
oate acestea, ele difera n structura lor chimica. Ceaiul verde contine mai multe
flavonoide simple numite catechine, n timp ce procesul de oxidare prin care trec
frunzele pentru a se obtine ceai negru face ca aceste flavonoide sa se transform
e n varietati mai complexe numite teaflavine si tearubigine. In frunzele proaspet
e de ceai sunt prezente substante din grupa catechinelor, care includ cativa est
eri galici: gallocatechina (GC), epigal-locatechina (EGC), epicatechina (EC), ep
igallocatechin-gallat (EGCg) si epicatechin gallat (ECg). Componenta care domina
este EGCg, care este si cea mai puternica. Tabelul de mai jos furnizeaza valori
medii pentru diferite flavonoide prezente n ceaiul verde si negru, cu toate ca e
le difera n functie de varietatea frunzelor, mediul de crestere, prelucrare, mari
mea particulelor din frunzele subterane de ceai si de prepararea infuziei.
Tabelul 1.Flavonoide n ceaiul verde si negru
Flavonoide
Ceaiul verde,(g medie/ 100g)
Catechine
14.2
4.0
Teaflavine
0.94
Flavonol glicozide
0.64
0.47
Flavon C glicozide
0.086 0.051
Total polifenoli
16.0
15.6

Ceaiul negru (g medie/ 100g)

Materiale si metode
Pentru determinarile experimentale s-au ales doua variante de lucru:
A. Substratul: Solutia de amidon 2% preparata in extractul de ceai n
egru,respectiv verde n concentratie de: 1,5%, 3%, 4,5% .
Extractul enzimatic: solutie de malt 3%, in mediu apos.
B. Substratul: solutia de amidon 2% in mediu apos;
Extractul enzimatic: solutie de malt 3% in ceai (negru, respect
iv verde) n concentratie de: 1,5%, 3%, 4,5%
In studiul de fata s-au utilizat ceaiul verde si ceaiul negru ca sursa de poli
fenoli. 1. Dozarea polifenolilor din ceaiul verde si negru prin metoda spectofot
ometrica.
Fenolii, in mediu alcalin, reduc complexul fosfomolibdenic (4MoO
3 MoO2) H3PO4.
Reactivii folositi sunt: - reactiv Folin-Ciocaltau;
- Na2CO3 (101 g Na2CO3 10 H2O/500 ml
apa);
- solutie etalon de fenol(quercetin
a).
Proba de analizat se obtine astfel: se trateaza 0,5 ml de extract de ce
ai (diluat 1:2) cu 0,5 ml reactiv Folin-Ciocaltau (diluat 1:3), apoi se adauga 1
ml solutie saturata Na2CO3 si 16 ml de apa distilata. Amestecul se mentine la t
emperature camerei 25 de minute, apoi se citeste extinctia la 725 nm.
n paralel s-a dozat n acelasi mod quercetina (drept etalon) dintr-o solutie etalo
n
Activitatea amilazei s-a determinat prin dozarea glucidelor reducatoare formate

ca urmare a actiunii amilazelor asupra amidonului folosind metoda cu acidul 3,5

-dinitrosalicilic (acid 3,5-DNS).
2. Determinarea activitatii amilazei prin dozarea glucidelor reducatoare cu acid
3,5-DNS
Se supune actiunii enzimatice o solutie de amidon 2% in extractul de ce
ai verde, respectiv negru folosind drept sursa de amilaza un extract apos din ma
lt 3%;
Se determina zaharul reducator format.
Reactivi : - solutie amidon 2% in extract de ceai;
- solutie DNS.
Se iau intr-un Erlenmeyer 25 ml solutie amidon 2% in ceai,respectiv 25
ml solutie apoasa de amidon 2% . Pentru proba martor se folosesc 25 ml extract d
e ceai,respectiv 25 ml apa. Se aduga 5 ml de extract apos de malt 3% si 5 ml ext
racte malt 3% in ceai. Dupa ce au fost bine omogenizate se termostateaza la temp
erature de 40 C timp de 30 de minute. Dupa expirarea timpului de termostatare, a
ctivitatea enzimatica este oprita prin fierberea probelor. Dupa racire, probele
se trec cantitativ in baloane cotate de 50 ml, se aduc la semn si se omogenizeaz
a. Din fiecare proba se determina glucidele reducatoare prin DNS.
Se iau 1 ml proba de analizat din fiecare balon cotat diluata 1:1 cu ap
a distilata peste care se aduga 2 ml reactiv DNS. Pentru proba martor se foloses
c 2 ml apa distilata.Se agita si se astupa cu dop de vata dupa care se introduc
timp de 10 minute in baie de apa la fierbere. Dupa racire se completeaza cu 16 m
l de apa distilata, se omogenizeaza si si citeste extinctia la 535 nm, folosind
cuva de 1 cm si apa distilata ca fond. In paralel se face o proba martor la care
se foloseste numai apa distilata.
pentru stabilirea curbei etalon se foloseste o
Trasarea curbei etalon
solutie de glucoza in concentratie de 0,5 mg/ml.
Din aceasta solutie se pipeteaza intr-o serie de eprubete in care se ga
sesc cate 2 ml reactiv DNS, urmatoarele cantitati: 0,0; 0,5; 1; 1,5; 2. Volumul
eprubetelor se aduce cu apa distilata la 4 ml, iar tratamentele ulterioare si ad
augarea reactivilor se fac in modul descris la determinarea glucidului reducator
in proba de cercetat.
Se traseaza curba etalon trecand pe abscisa cantitatile de zahar reduca
tor, iar pe ordonata extinctiile corespunzatoare.
3) Dinamica reactiei enzimatice in extractele de ceai negru si verde
Dinamica reactiei enzimatice s-a realizat pentru ambele variante A si B p
entru urmatoarele durate de desfasurare a reactiei enzimatice 15, 30, 45 de minu
te.

Rezultate si discutii
1) Cantitatea de polifenoli totali continuta de ceaiurile analizate s-a
exprimat n echivalenti de quecetina/g ceai. Valorile obtinute sunt redate n tabel
ul 2.
Tabelul 2. Polifenoli totali din ceaiul negru si verde
Concentratia ceai (%)
Negru Verde
1,5
4,2
4,9
3
15,1
5,13
4,5
15,3
5,17

Echiv. Quercetina/100 ml infuzie

[echiv. quercetina/ml infuzie]

unde:
0,6
cantitatea de quercetina/ml proba;
1,426 - extinctia solutiei etalon de polifenoli
2. Activitatea enzimatica s-a exprimat in UE,adica in micromoli de gl
ucoza pusi in libertate de amilazele dintr-un gram malt intr-un minut in conditi
ile de lucru date, dupa relatia:

unde:
c cantitea de glucoza transformata in grame;
d
dilutia;
C volumul de extract enzimatic luat in analiza, in ml, sau cantitatea de mat
erial
prima care se gaseste in
C ml de extract, in grame;
1 micromol glucoza;
t
timpul de termostatare, in minute;

Varianta A
Tabelul 3.Influenta concentratiei ceaiului asupra activitatii enzimatic
e
Concentratia ceaiului, %
1,5
3
4,5

negru
545,9
158,8
52,9

Verde
670,7
273,5
139,9

Activitatea enzimatica UE/g malt

Din datele obtinute, se constata ca atat ceaiul negru cat si cel verde au actiun
e inhibitoare asupra amilazei din malt. Pentru experimentele cu substrat prepara
t in extractele de ceai, de concentratii diferite, se observa scaderea cantitat
ii de produsi de reactie, implicit scaderea activitatii enzimatice a amilazei di
n extractul apos 3% de malt. Actiunea de inhibare a enzimei este mai mare in caz
ul ceaiului negru comparativ cu cel verde, explicatia fiind prezenta compusilor
de condensare a polifenolilor formati in timpul procesul de oxidare a frunzelor
de Camellia sinesis cat si in urma desfasurarii reactiei Maillard, la obtinerea
ceaiului negru. Se observa ca odata cu cresterea concentratiei ceaiului, implici
t a cantitatii de polifenoli extrasi, scade activitatea amilazei direct proporti
onal cu concentratia.

3) Tabelul 8. Dinamica reactiei enzimatice in functie de concentratia ceaiului

Timpul de termostatare
Min
Activitatea enzimatica UE/g malt
Extract 1,5%
Extract 3,0%
Extract 4,5%
negru
15
239,5
30
545,9
45
387,5

verde
2907,2
670,7
1262,4

negru
12,6
158,8
217,7

verde
1099,3
273,5
540,4

negru
2,5
52,8
236,2

verde
920,0
139,9
270,6

Daca se variaza timpul de reactie se inregistreaza aceeasi tendinta de scadere a

activitatii enzimatice a amilazei odata cu cresterea concentratiei la ambele ti
puri de ceai.
In cazul ceaiului negru actiunea inhibitoare este mai puternica intr-un timp scu
rt de reactie (15 minute) pentru ca mai apoi reactia sa se echilibreze in sensul
cresterii activitatii enzimatice a amilazei pe masura cresterii timpului de rea
ctie. Aceasta se explica prin desfacerea legaturilor complexului polifenoli
enzi
ma, cu eliberarea enzimei.
In cazul ceaiului verde procesul de amiloliza debuteaza cu viteza mare pentru ca
dupa un timp de reactie de 30 de minute sa se inregistreze cele mai mici valori
ale activitatii enzimatice. Apoi procesul de hidroliza este reluat dar cu o vit
eza de reactia mai mica prin eliberarea centrilor activi ai enzimei si reluarea
activitatii enzimei.

Varianta B
Tabelul 5 Influenta concentratiei ceaiului asupra activitatii enzimatic
e
.
Concentratia ceai
%
Activitatea enzimatica UE/g malt
1,5
3
4,5

Negru
531,8
158,7
52,8

Verde
501,7
152,5
109,6

In cazul variantei B, in care s-a utilizat extract de malt 3% in ceai se constat

a o scadere a activitatii enzimatice a amilazelor odata cu cresterea concentrati
ei ceaiului, atat cel negru cat si cel verde, astfel la dublarea concentratiei i
nitiele (1,5) activitatea enzimei scade in medie de 3 ori, iar la triplarea conc
entratiei initiale activitatea enzimatica scade in medie de 6 ori. Se observa de
asemenea ca extractul de ceai verde are o actiune inhibitoare mai mare decat ex
tractul de ceai negru pentru primele doua concentratii.

3)Tabelul 10. Dinamica reactiei enzimatice in functie de concentratia ceaiului

Timpul de termostatare
min
Activitatea enzimatica UE/g malt
Extract 1,5%
Extract 3,0%
Extract 4,5%
negru
15
143,7
30
531,8
45
749,6

verde
4311,6
501,7
1349,8

negru
22,7
158,8
228,2

verde
2228,6
152,5
644,6

negru
453,8
52,8
43,6

Verde
2783,2
109,6
511,8

La variatia timpului de reactie, scaderea activitatii enzimatice a amilazelor ra

mane proportionala cu concentratia ceaiului numai pentru 30 de minute,respectiv
45 de minute.Cea mai puternica inhibare pentru ceaiul negru este la 30 de minute
la fel si pentru ceaiul verde.

Concluzii finale
Studiul de fata a demonstrat ca polifenolii prezenti in mediul de reactie enzima
tica influenteaza activitatea amilazei in functie de concentratia lor.
Ca urmare, prezenta polifenolilor in sistemele alimentare poate fi o cauza a per
turbarii proceselor enzimatice.

Bibliografie
1.
Qiang, He.; Yuanping Lv.;Kai Yao, Effect of polyphenols on the activitie
s of a-amilase, pepsin, trypsin and lipaze,2006,
2.
Yukihiko Hara; Miwa Honda,1994, Method of inhibiting the activity of a-a
mylase,United States Patent, patent number 5,318,986;
3.
Sundarajan, Raja; Haja, Nazeer Ahamed; Venkatesan, Kumar; Mukherjee, Kak
ali; Saha, Bishnu Pada; Bandyopadhyay, Arun; Mukherjee, Pulok Kumar, Cytisus sc
A natural antioxidant, 2006, BMC Complementary and Alternative medi
oparius link
cine, 6:8 doi 10.1186/1472-6882-6-8;
4.
Tagliazucchi, D.; Verzelloni, E.; Conte, A, Effect of some phenolic comp
ounds and beverages on pepsin activity during simulated gastric digestion, Depar
tament of Agricultural Science, University of Morena and Reggio Emilia;
5.
Zhang, J.; Kashket, S.;1998, Inhibition of salivary amylase by black and
green tea and their effects, Caries Researsh, 32:233-238(DOI: 10.1159/000016458
)