BIOLOGIA VIRUSURILOR.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL
VIROZELOR.

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Particularitile virusurilor
Reprezint structuri acelulare cu potenial
infecios
Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind
parazii obligai intracelulari
Nu cresc pe medii artificiale, numai pe
celule vii
Genomul viral este constituit dintr-un
singur tip de AN (ADN sau ARN)
Nu cresc i nu se divid, ci se reproduc n
celule vii
Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)

CLASIFICAREA VIRUSURILOR
Dup

tipul AN (cu genom ARN/ADN)

Dup dimensiuni (mici 20-50 nm,
medii 50-150 nm, mari peste 150
nm)
Dup tipul de simetrie a capsidei
(helicoidal, cubic, mixt)
Dup gazd (om, animal, insect,
bacterie)
Dup sensibilitatea n mediul
extern, etc

 Virusuri

ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae,

Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae
Virusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae,
Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae,
Retroviridae
Virusuri ARN- : Rhabdoviridae,
Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae,
Bunyaviridae, Arenaviridae, Filoviridae
Virusuri ARNd.c. : Reoviridae
Virion unitate structural infecioas a virusului
Viroid ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante
Prion protein termostabil infecioas,
cauzeaz la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob,
sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi

COMPOZIIA CHIMIC I
STRUCTURA VIRIONULUI
Virusurile simple AN i nveli proteic
capsida (nucleocapsid)
Virusurile complexe nucleocapsid i un
nveli extern, lipoglicoproteic
(supercapsid, peplos)
AN ADN sau ARN, mono- sau bicatenar,
linear, circular sau fragmentat.
ARN monocatenar : ARN+ (caten cu
sens, ARNm) sau ARN- (caten fr
sens)

Funcia AN asigurarea replicrii i expresia

genomului pentru sinteza proteic
Capsida format din uniti proteice,
capsomere, aranjate simetric.
1. Simetrie helicoidal capsomerele se
fixeaz pe catena de AN, form de
bastona
2. Simetrie cubic (icosaedric)
capsomerele se aranjeaz n jurul AN,
formnd un icosaedru (poliedru regulat cu
20 fee triungiulare i 12 vrfuri), eikos=20
3. Simetrie mixt (bacteriofagii,
poxvirusurile)
Funcia protecia AN, rol antigenic, adeziune

Supercapsida structur glucido-lipidoproteic,

derivat din membrana
celulei gazd (lipidele din membrana
celular, glicoproteinele proprii)
Funcie protecie, antigene de
suprafa, adeziune
Unele virusuri conin enzime polimeraze,
transcriptaze, etc.
Aciunea factorilor fizici, chimici
Virusurile sunt foarte sensibile la cldur,
desicare, UV. Detergenii i solvenii
inactiveaz virusurile cu supercapsid.
Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80 C

REPRODUCEREA VIRUSURILOR
I ADSORBIA virusului la celula-gazd
prin intermediul receptorilor specifici
(tropism)
II PENETRAREA virusului n celul
a) Pinocitoz (viropexis)
b) Fuziunea membranelor
c) Translocare
d) Injectarea AN n citoplasm
III DECAPSIDAREA (enzime celulare)

IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor i replicarea AN)

Are loc n citoplasm (virusuri cu ARN) sau nucleul
celulei (virusuri cu ADN)
Biosinteza virusurilor ADN
ADNdc
transcrierea ARNm
translaia
(precoce, tardiv), replicarea
sinteza
proteic
Biosinteza virusurilor ARN
ARN+
translaie, replicare
sinteza proteic
ARNtranscriere
ARNm
translaie,
replicare
sinteza proteic
Retrovirusuri (ARN+)
transcriere
ADNADNdc
transcriere
ARNm
replicare, translaie, sinteza pr. (sau integrare n
cromosom)

RNA VIRUSES THAT DO NOT HAVE A DNA PHASE

Genome

RNAdependent
RNA
polymerase
(=transcripta
se) in virion

Infectivity of
RNA

Initial event in
cell

RNA +

No

Infectious

Translation

RNA -

Yes

Noninfectious

Transcription

RNAd.c.

Yes

Noninfectious

Transcription

RETROVIRUSES

Genome

RNA +

RNAdependent
RNA
polymerase
(=transcriptas
e) in virion
Yes

Infectivity of
RNA

Non-infectious

Initial event in
cell

Reverse
transcription

V. MORFOGENEZA (asamblarea) virionilor

Proteinele capsidale particip la formarea
nucleocapsidei (nucleu,citoplasm),
glicoproteinele sunt inserate n MCP, substituind
proteinele celulare. Contribuie la apariia
incluziunilor sau a corpusculilor elementari.
VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, nmugurire,
exocitoz)
Interferena viral fenomen n care,
consecutiv infeciei unei celule cu 2 virusuri,
multiplicarea unuia este inhibat (virus
interferat / virus interferent)

CULTIVAREA VIRUSURILOR
Virusurile sunt cultivate pentru:
Stabilirea diagnosticului etiologic
Testarea infeciozitii virusurilor
Testarea preparatelor antivirale
Producerea vaccinurilor
SISTEME DE CULTIVARE
1. Culturi de celule
2. Ou embrionat de gin
3. Animale de laborator

Animalele de laborator se utilizeaz

limitat (receptivitate selectiv,
preexistena infeciilor, cost avansat). Se
recurge numai cnd nu exist alte
posibiliti (VHB, HIV, Coxsackie, etc).
Constituie modele de cercetare sau de
control al vaccinurilor. Animalele utilizate
curent oriceii albi nou-nscui, dar pot
fi utilizai obolani, cobai, maimue, etc.
Regulile de lucru cu animalele de laborator
(selectare, inoculare, examinare) sunt
identice cu cele din infeciile bacteriene.

Oul embrionat de gin (5-13 zile) reprezint

un mediu de celule nedifereniate, cu
multiplicare activ, steril i lipsit de mijloace
de aprare antiinfecioas. Se utilizeaz n
prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)
- Iniial se verific viabilitatea embrionului la
ovoscop n camera obscur.
- Prelevatul se inoculeaz steril cu seringa n
cavitatea amniotic sau alantoidean, sau pe
membrana chorioalantoidean (utiliznd
metoda deschis sau nchis).
- Orificiul se parafineaz i se incubeaz la 3537 C timp de 48-72 ore

Culturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins).

Celulele provenite din esuturi adulte sau embrionare,
normale sau tumorale, plasate ntr-un mediu adecvat
(nutrieni, pH, t) rmn viabile i se multiplic. Pentru
cultivarea virusurilor se utilizeaz culturile n monostrat
celular.
Tipurile de culturi de celule:
Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obinute din
esuturi adulte sau embrionare de origine animal sau
uman. Suport 4-6 pasaje (subcultivri)
Culturi diploide. Obinute din esut embrionar (MRS5,
fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaii
Linii continui de celule. Obinute din esut tumoral. Pot
fi subcultivate nelimitat.
HeLa carcinom de col uterin
KB tumoare a rinofaringelui
Hep-2 tumoare canceroas a laringelui

Obinera culturilor de celule primar

tripsinizate:
- Prelevarea esutului (ex.: rinichi de maimu)
- Fragmentarea i splarea cu sol fiziologic
- Dezagregarea tisular cu enzime proteolitice
- Separarea celulelor prin centrifugare
- Dozarea suspensiei 105 106 celule/ml
- ntroducerea celulelor n mediu nutritiv i
repartizarea n recipiente sterile
- Incubarea pn la formarea monostratului celular
(inhibiie de contact)
- Monostratul poate fi infectat cu virus sau servete
drept surs de celule pentru o nou cultivare
(pasaj)

Mediile de cultur pentru culturi de celule

conin AA, Vit, factori de cretere, sruri
minerale (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de
lactalbumin, etc), rou fenol pentru
monitorizarea pH (vireaz n galben n mediu
acid)
1. Mediile de cretere sunt mbogite cu ser
sangvin (uman, animal) pentru cultivarea
CC
2. Mediile de ntreinere se utilizeaz pentru
meninerea monostratului n procesul
reproducerii virale. Nu conin ser.
CC reprezint sistemul virus-gazd predilect n
virologia clinic i cercetare.

Inocularea CC
- Se aleg tuburi cu monostrat bine
format
- Se nltur mediul de cretere, se spal
cu sol. Hanks
- Se inoculeaz 0,1 0,2 ml de prelevat
- Peste 30-60 min n tuburi se toarn
cte
1 ml mediu de ntreinere
- Se ntroduc n termostat la t adecvat
3-4 zile

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL VIROZELOR
Indicaii:
- Boli cu msuri terapeutice sau profilactice
speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc)
- Elucidarea etiologiei virale a unor
izbucniri epidemice (meningite, gastroenterite, pneumonii, etc)
- Supravegherea epidemiologic
Prelevate: LCR, snge, exsudate, secreii
nazale, rino-faringiene, mase fecale,
urin, vezicule i ulceraii cutaneomucoase, bioptate, etc.

Eficacitatea diagnosticului este

condiionat de:
1. Alegerea corect a prelevatelor,
calitatea lor i transportarea n
laborator
2. Examinarea precoce (la debutul bolii)
3. Transportarea rapid a probelor sau
utilizarea mediului de transport
4. Respectarea regulilor de autoprotecie
i de protecie a anturajului la recoltare,
transportare i examinarea probelor

METODELE DE DIAGNOSTIC AL
VIROZELOR
METODE DIRECTE
- Examenul virusoscopic (evidenierea direct
a virionului sau a componentelor lui n
prelevate)
- Examenul virusologic (izolarea i
identificarea virusului)
- Detectarea Ag virale n prelevat
- Identificarea genomului viral (hibridizarea
AN, amplificarea genic PCR)
METODE INDIRECTE
- Serodiagnosticul (creterea de cel puin 4 ori
a titrului Ac n dinamic)

EXAMENUL VIRUSOSCOPIC
1.

2.
3.

4.

Microscopia optic depistarea n

prelevat a incluziunilor virale specifice
(corpusculii Guarnieri n variol, BabeNegri n rabie) sau nespecifice,
citoplasmatice sau nucleare. Se prepar
frotiuri sau frotiuri-amprente colorate
Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom
Microscopia electronic
Imunoelectronomicroscopia mai
sensibil, mai specific. Se examineaz
complexele imune virus Ac
Imunofluorescena (direct i indirect)
utilizat n diagnosticul rapid al virozelor

EXAMENUL VIRUSOLOGIC
Prelucrarea prealabil a prelevatelor:
- Omogenizarea (dup necesitate)
- nlturarea elementelor celulare, inclusiv
bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)
- Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea
creterii bacteriilor i fungilor
contaminani (penicilin - 500 UA/ml,
streptomicin
- 500 UA/ml, nistatin - 20 UA/ml)

Etapele diagnosticului virusologic

1. Izolarea virusului
2. Evidenierea (indicarea) reproducerii
virale
3. Identificarea virusului
Izolarea virusului se realizeaz prin
inocularea cu material de examinat a
animalelor de laborator, embrionilor de
gin sau a culturilor de celule. Alegerea
sistemului de cultivare se efectueaz n
funcie de particularitile biologice ale
agentului etiologic probabil i
posibilitile laboratorului.

INDICAREA VIRUSULUI
n

culturi de celule
1. ECP modificri degenerative i
distrugere celular, rezultat al
multiplicrii virale (rotunjire sau
retracie celular, citoliz, apariia
vacuolelor sau granulelor n citoplasm,
picnoza nucleului, fuziunea
membranelor, etc). ECP poate fi studiat
la microscopul optic pe celule
necolorate sau colorate cu hematoxilineozin, Giemsa, fluorocrom.

2. Incluziuni virale
Reprezint acumulri paracristaline de virioni
sau de componente virale n aria de replicare
i asamblare a virusurilor (citoplasm, nucleu).
Coloraia Giemsa, hem-eozin, fluorocrom.
Localizarea, forma i afinitatea tinctorial
(bazofile, acidofile) sunt particulariti
diagnostice pentru unele viroze.
3. Interferena
Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determin
fenomenul de interferen. Pentru detectarea
V.rubeolei se infecteaz CC cu virus
citopatogen. Lipsa multiplicrii acestui virus
confirm prezena V.rubeolei.

4. Hemadsorbia (RHAd) pentru virusuri cu

HA
Unele virusuri posed n componena
capsidei, n special supercapsidei,
glicoproteine care pot adera la suprafaa
hematiilor HA.
n timpul eliberrii din celul prin nmugurire a
acestor virusuri, HA lor se afl deja nserate
n MCP la nivelul mugurelui. Dac la aceasta
etap n recipientul cu monostrat celular se
adaug suspensie de hematii i se menine
15-20 min la t caracteristic fiecrui virus, la
microscop pot fi urmrite hematiile fixate la
suprafaa celulelor infectate (RHAd).

5. Hemaglutinarea (RHA)
Pentru virusurile cu HA acumulate n mediul de
ntreinere. n acest caz mediul de ntreinere
aglutineaz eritrocitele unor specii de mamifere
sau psri.
6. Formarea plajelor
Reprezint focare de celule alterate n monostratul
celular acoperit cu agar. Numrarea plajelor
permite cuantificarea virusului infectant.
7. Proba culorii
- Metabolismul celular neafectat virajul culorii
mediului din rou n galben (pH acid)
- Metabolismul celular inhibat culoarea mediului
nu se modific

Indicarea virusului n oul

embrionat de gin
Oule se rcesc 18 ore la +4 grade C
pentru o vazoconstricie maxim, apoi
aseptic se taie coaja, se recolteaz
lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA
i embrionul se ntroduc n cutii Petri
sterile. Se observ:
1. Moartea embrionului
2. Apariia modificrilor (hemoragii,
pustule) pe MCA
3. Acumularea de HA n lichide


1.
2.
-

Indicarea virusului pe animale

de laborator
Boala manifest a animalului, deces
Urmrirea virusului n organele-int:
Hemaglutinare
Infeciozitatea omogenatelor
Examene histopatologice (leziuni
inflamatorii, degenerare, incluzii
virale specifice: corp. Babe-Negri n
neuronii infectai cu V.rabic, etc)

Identificarea virusurilor
Determinarea genului, speciei i serotipului
de virus prin stabilirea structurii antigenice.
Se efectueaz cu ajutorul serurilor imune
specifice antivirale n diferite reacii
serologice:
- RN
- RIHA/RIHAd
- RFC
- RIF
- RIE (ELISA)
- ARI, etc

DETECTAREA AG VIRALE N PRELEVATE

Avantaje: simplitatea i rapiditatea
examenului, nu necesit meninerea
infeciozitii virusului
Dezavantaje: sensibilitate direct
proporional cu cantitatea virusului din
prelevat
Se utilizeaz Ac policlonali de origine
uman (seruri imune) sau Ac
monoclonali (de origine murin)
Reacii: RHAI, RLA, RIF, RIE, Westernblot, ARI, etc.

IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL

(punerea n eviden a AN virali din
prelevate n cursul infeciilor virale
acute sau cronice i monitorizarea
tratamentului).
Pot fi examinate toate esuturile i
lichidele biologice.
Hibridizarea acizilor nucleici fr
amplificare
Hibridizarea dup amplificare (PCR
i variantele ei)

DIAGNOSTICUL SEROLOGIC
Esena: depistarea Ac sintetizai de
gazd n rspuns la o infecie viral.
Dup o primo-infecie are loc inducerea
formrii Ac, iar dup o reinfecie sau
reactivare titrul Ac crete n dinamic.
n serodiagnosticul virozelor este
obligator de a examina 2 probe de ser
de la bolnav : prima prelevat la
debutul bolii, al doilea prelevat peste 15
zile.

Ac sunt depistai n ser, uneori n LCR, exsudate,

lichid articular, etc.
Pentru depistarea Ac se utilizeaz Ag virale de
referin (suspensie viral inactivat, proteine
virale native sau recombinante, oligopeptide
sintetice).
Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI,
ARI, AIE (ELISA), etc.
Semnificaie diagnostic prezint trecerea
titrului de Ac de la 0 la pozitiv
(seroconversie, primo-infecie) sau creterea
titrului Ac de cel puin 4 ori n cursul
infeciei. Ambele seruri vor fi testate n aceeai
zi, prin tehnici identice i n acelai laborator.

RELAII VIRUS-CELULA GAZD

Infecie

viral productiv, citocid

Virusul este infecios iar celula permisiv. La
nivelul ma/o corespunde infeciilor acute,
aparente sau inaparente (grip, rujeol)
Infecii virale persistente
Celulele infectate supravieuiesc cu producerea
permanent sau intermitent a virusului.
1. Infecii abortive cu virioni defectivi
infecia nu se exprim, are loc transformarea
celulelor prin proteine virale. Ele devin int
pentru efectorii imunitii (macrofage, Tlimfocite) n cursul unor infecii cronice (PESS
post-rujeolic)

2. Infecii integrate (virusuri ADN sau copii

ADN ale Retrovirusurilor)
- Transformarea malign a celulei gazd
- Manifestarea infeciei dup o perioad de
incubaie ndelungat cu expresia integral a
genomului viral (HIV-SIDA) infecii lente
- Reactivri ocazionale, repetate ale infeciei cu
exprimarea integral a informaiei genetice
virale (infecia herpetic) infecii latente
- Infecii cronice perioade de remisie i
acutizare, virusul este prezent permanent,
chiar n absena simptomelor (hepatita viral
B)

TERAPIA ANTIVIRAL
Dificulti:
- Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fr
afectarea celulei!)
- Apariia mutantelor rezistente
- Activitate asupra virusului n faz de multiplicare
- Costul avansat al tratamentului
Primele preparate antivirale anticanceroase.
Preparatele antivirale contemporane:
- Nu manifest activitate virucid, doar inhib
reproducerea viral
- Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale

 Adeziunea

virusului la celul
Mecanismul blocarea receptorilor celulari (HIVoligopeptidul T, care reproduce gp120; CD4
solubili)
Dificulti: afinitate redus, degradare rapid
Fuziunea, penetrarea
Reprezint peptide sintetice (pentafuzida-T20,
T1249) blocheaz fuziunea virusului HIV cu
membrana celular (dificultate injecii s/c
zilnice)
Decapsidarea
Amantadina, rimantadina inhib decapsidarea
virusului gripal A
Utilizare limitat dezvoltarea rezistenei

Replicarea
Mecanismul blocheaz activitatea enzimelor virale
de reproducere (transcriptaze, polimeraze,
replicaze)
Avantaj nu influeneaz componentele celulei-gazd
1. Analogi nucleozidici
Se disting de nucleozidele naturale prin modificarea
componentului glucidic sau a bazei purinice sau
pirimidinice. Blocheaz elongarea catenei de ADN
n curs de formare.
Antiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir,
idoxuridin)
Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin,
stavudin, lamivudin, etc)
Anti-HBV (entecavir, LdT, LdC faz de cercetare)

2. Analogi nucleotidici
- Cidofovir-CMV, HSV
- adefovir- HIV, HBV, HSV, CMV
- tenofovir HIV, HBV
3. Analog al pirofosfatului
- Foscarnet HSV, CMV (HIV, HBV -?)
4. Inhibitori nenucleozidici ai RT
HIV (nevirapin, delavirin, efavirenz )

Blocarea activitii polimerazelor virale

se realizeaz prin:
1. Competiie cu substratul natural al
enzimei
2. ngrmdirea steric a centrului activ
al enzimei
3. Incorporarea n catena de ADN n curs
de sintez
4. Blocarea procesului de elongare a
catenei de ADN prin incapacitatea de
a fixa un alt nucleozid pe analogul
su artificial

Asamblarea, eliberarea
- Inhibitori ai proteazei HIV
(sanquinavir, ritonavir, indinavir,
amprenavir, lopinavir, nelfinavir,
etc) toxicitate, rezisten
- Inhibitori ai neuraminidazei
virusurilor gripale (zanamivir,
oseltamivir). Activ contra gripei
A i B (efect preventiv, curativ,
rezisten rar)

INTERFERONII (IFN)
IFN ansamblu de proteine capabile
s confere celulelor o stare de
rezisten la o infecie viral.
IFN tip 1 (clasic, antiviral):
1. IFN-alfa (leucocitar)
2. IFN-beta (fibroblastic)
Inductori: virusuri, LPS, ARN bicatenar
IFN-gama, tip 2, imun, produs de LT
activate, NK. Manifest activitate
imunomodulatoare

IFN acioneaz asupra ciclului de replicare viral prin

intermediul celulei: interaciunea IFN-alfa cu
receptorul su induce sau stimuleaz expresia unor
gene celulare, rezultnd o activitate antiviral
(blocarea translaiei ARNm viral, degradarea ARNm
viral). Este posibil i blocarea asamblrii i
nmuguririi virusului (HIV)
IFN mresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar
IFN-gama i a celor de clasa II
IFN mresc activitatea intrinsec i extrinsec a
macrofagelor i manifest activitate antiproliferativ
IFN-gama activeaz celulele NK

Utilizarea terapeutic a IFNhepatite B i C cronice,

infecii herpetice, sarcomul Kaposi, limfome, leucemii
Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la
etapa de testare in vitro.

 TERAPIA

CELULAR (CMV, EBV)

Fondat pe administrarea CTL
(limfocite Tc) autologe.
- Prelevarea sngelui de la bolnav
- Izolarea CTL specifice
- Clonarea i proliferarea CTL in vitro
- Reinjectarea la pacient
VIITOR: fototerapia, imunizarea
intracelular (introducerea unei gene
ce codific un anticorp antiviral)