Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
ONCOGENEZEI SI IN CLASIFICAREA
TUMORILOR NEOPLAZICE
CUPRINSULCURSULUI
ONCOGENEZA
- MODIFICARI FIZIOPATOLOGICE
- GENE IMPLICATE IN ONCOGENEZA
ONCOGENEZA
DEFINITIE
Bolile neoplazice reprezinta un grup de afectiuni caracterizate prin:
hormoni
http://outreach.mcb.harvard.edu/animations/checkpoints.swf
TELOMERII
Celulele umane normale parcurg un numar finit de diviziuni celulare in
culturi si, in final, nu se mai divid ( senescenta replicativa).
Numarul de diviziuni celulare atins inainte de senescenta este de aprox. 50.
ROLUL TELOMERAZEI
Telomeraza este un complex ribonucleoproteic care contine mai multe
proteine si ARN. Componentul catalitic al acestui complex este o
reverse transcriptaza (= enzima ce permite formarea de duble catene de
ADN din monocatena-matrita de ARN), hTERT, care foloseste ARN-ul
continut in complex ca matrice pentru reverse transcriptia necesara
replicarii secventelor de ADN din telomere.
Rolul principal al telomerazei: mentinerea lungimii telomerelor
Celule germinale si celulele pluripotente au activitate telomerazica;
telomeraza isi inceteaza activitatea in celulele din majoritatea
tesuturilor, pe masura ce acestea se diferentiaza.
Cele mai multe cancere umane par a fi capabile sa reactiveze activitatea
telomerazica, reluandu-si capacitatea proliferativa; totusi 10%-15% din
cancere nu exprima telomeraza si, aparent, mentin lungimea
telomerului printr-un mecanism diferit.
INSTABILITATEA GENOMICA
Instabilitatea genomica este generata de pierderea controlului normal asupra activitatii
genelor, ducand in final la pierderea controlului asupra ciclului celular si la proliferare
aberanta.
Controlul genetic se realizeaza prin factorii de transcriptie, proteine care se leaga de
multiplele locuri de legare situate in genomul normal:
inaintea situsului de unde incepe transcrierea, ce contine structuri de legare a ARN-polimerazei
(promotorii)
la distanta variate (uneori la mare distanta) de gena tinta a transcrierii (amplificatorii = enhancers).
GENE TUMOR
SUPRESSOR
PROTO-ONCOGENE
Confera un avantaj celulei
neoplazice prin castigarea unei
functii inexistenta in celula de
initiala, de provenienta.
Sunt gene normale care sufera
mutatii: de ex. ale factorilor de
crestere celulara sau a cascadei
cyclin ciclazelor
Pentru oncogene mutatia este de
obicei la nivelul unei singure alele.
PROTOONCOGENELE
Protooncogenele trebuie sa
REPARAREA ADN
ROLUL p53
p53, denumita astfel deoarece
codifica o proteina fosforilata cu
GM = 53 kDa.
Proteina p53 functioneaza atat la
nivelul punctului de control G1
(unde poate opri ciclul celular)
cat si in punctul de control G2.
p53 este un factor de transcriptie, dar, in mod normal este foarte instabila si nu se
acumuleaza suficient pentru a activa transcriptia. Nivelul p53 este mentinut scazut
prin legare de alte proteine (MDM2, COP1, PIRH2 sau JNK) care ii si promoveaza
degradarea pe calea ubiquitin/proteazomilor. MDM2 blocheaza transcriptia genei
p53. Cele mai multe gene ale acestei cai sunt reglate de p53, formand o bucla de
feedback negativa.
Alterarea ADN stabilizeaza p53, crescandu-i concentratia. Una din genele a carei
transcriptie o stimuleaza p53 codifica p21CIP, un inhibitor de cyclin- kinaza (CKI)
care leaga si inhiba complexele Cdk-cyclina. Ca rezultat, celula este blocata in G1
(si G2) pana leziunea ADN-ului este reparata si nivelul p53 scade (ducand la
scaderea p21CIP). In acest fel, cyclin-kinazele isi pot relua activitatea.
Daca leziunea ADN este extinsa, p53 dicteaza apoptoza celulei respective.
GENA Rb
Gena Rb este cunoscuta ca gena a retinoblastomului, o tumora a ce
apare la copiii care poarta aceasta gena.
Descoperita initial la familiile purtatoare ale acestei gene, este o gena
recesiva mutata sau pierduta in retinoblastom.
Gena complexa : 200 kb cu 27 exoni si introni cu dimensiuni intre
80bp - 60kb
Codifica o fosfoproteina nucleara ce controleaza ciclul celular in G1.
Aceasta se leaga nespecific de ADN, factori de transcripte (E2) sau de
complexele proteice (trithorax group) implicate in reglarea ciclului celular.
GENA RB
M
G2
Rb
G1
Rb
P
P
PPPP
Inactive
repressor
RETINOBLASTOMUL SI MODELUL
CARCINOGENEZEI IN DOUA ETAPE
pentru genele tumour supressor
Knudson: gena RAS (a retinoblastomului) este
inactivata in 2 etape si de aceea:
- In cazurile familiale: frecventa retinoblastomului
este mare si boala are debut precoce:
In aceste cazuri retinoblastomul este datorat
unei mutatii germinative a unei alele Rb + peste
care se suprapune o mutatie dobandita a
celeilalte alele
ambele alele devin inactivate
- In cazurile sporadice (frecventa mica, debut
tardiv): retinoblastomul apare si necesita aparitia
succesiva (intre care exista un interval de timp
variabil) a 2 mutatii somatice dobandite la
ambele alele
ambele alele devin inactivate
ut
.
m
ut
.
**
*
early
onset
late
onset
COMPLEXUL BASC
BASC = BRCA1- associated genome-surveillance complex.
Include multiple proteine (printre care ATM ataxia teleangiectazia, MSH2, MSH6,
Rad50-MRE11 - Meiotic Recombination-11, RFC (DNA Replication Factor-C, etc.)
Rol:
Regleaza transcriptia, moduland nivelul p53 si a proteinei de reparare a ADN,
proteinelor efectoare.
PROTO-ONCOGENELE
Gene ce confera un avantaj competitiv de crestere celulelor
neoplazice printr-un mecanism de castigare de functii
celulare suplimentare
Mecanisme de aparitie a protoconcogenelor:
- Mutatii : exemplu, mutatia punctiforma a genei Ras
- Inlaturarea domeniului de reglare al genei (frecvent prin
translocare)
Translocarea: O gena non latenta (non quiescent) care
promoveaza cresterea celulara poate fi dizlocata in timpul
translocarii cromozomiale langa un enhancer gena
devine activa (in mod patologic, deoarece rolul ei era sa
fie inactiva) controlul cresterii celulare este pierdut.
- Amplificare: replicarea in exces, aleatorie, a unor regiuni
din genom; ex copii multiple de ras se gasesc in anumite
tumori.
- Insertie de oncogene virale
Exemplu de translocare
a genei myc
PROTO-ONCOGENELE
Un mecansim de aparitie a oncogenele este insertia unui material viral in genom.
Exemple: virusurilor HLTV 1 pentru leucemiile cu celulel T sau limfoame, virusului
hepatitei B pentru carcinomul hepatocelular sau HPV pentru cancerul de col uterin.
Oncogenele pot realiza pentru celula maligna diferite functii care sa ii asigure
multiplicarea si sinteza de proteine care sa ii medieze migrarea si metastazare,
cum sunt:
1.
2.
3.
4.
RAS
Genele RAS sunt cele mai frecvente oncogene intalnite in tumorile maligne umane
(30% din neoplazii), in special in cancerele pancreatice, colorectale, endometriale,
pulmonare si in cel de col uterin. Cele 3 gene RAS codifica 4 proteine (HRAS, NRAS,
KRAS (4A and 4B). Denumirea genei provine de la rat sarcoma.
Proteinele RAS sunt localizate pe suprafata interna a membranei celulare.
Functioneaza ca GTP-aze care cupleaza factorii de crestere celulari membranari la
mecanismele de semnalizare intracelulara a transcrierii, controland astfel multiple
procese celulare care:
mentin integritatea citoscheletului actinic,
contribuie la proliferarea, diferentierea, adeziune celulara si migrare celulara
Proteinele RAS sunt activate in mod normal de peste 20 de proteine efectoare.
Mutatia genelor poate duce la activarea independenta de semnalul factorilor de
crestere.
SEMNALIZAREA INTRA SI
INTERCELULARA MODIFICATA
PATOLOGIC
NOTIUNI GENERALE
Cele mai multe mecanisme fiziopatologice in oncogeneza presupun
modificarea la un anumit nivel a cailor de semnalizare intracelulara.
In mod normal, semnalizarea intra celulara este un proces generat de
variate influente externe:
- factori de crestere
- proteine din matricea extracelulara
- hormoni
- citokine
- factori care influenteaza mobilitatea
- factori care influenteaza adeziunea celulara.
NOTIUNI GENERALE
In principiu, activarea unui receptor:
- Genereaza nu doar un singur efect biologic, ci o cascada de evenimente
celulare cu exprimari fenotipice diferite. Aceste fenomene distincte sunt reglate
in interiorul celulei de unul sau mai multi adaptori de cele mai multe ori o
proteina cu multe domenii de interrelatie cu alte proteine dar si cu structuri
lipidice.
- In celule diferite, acelasi ligand poate avea efecte diferite.
- Un semnal al unei cai metabolice poate afecta rezultatul unei alte alte cai
metabolice, fenomen descris ca cross talk.
- Activarea unui receptor duce la activarea simultana a cailor de inactivare a
cailor activate, dupa o anumita perioada de la semnalul initial.
RECEPTORII TIROZINKINAZEI
(RTK)
includ 90 de membrii. Cei mai bine caracterizati sunt receptorii pentru:
- factorul de crestere derivat din plachete (platlet derivated growth factor = PDGF),
- factorul de crestere epidermic (epidermal growth factor = EGF)
- efrina (ephrin)
- factorului de crestere hepatocitar (HGF)
- factorului de crestere pentru fibroblasti (FGF)
- insulina.
CALEA RECEPTORULUI
TIROZINKINAZEI
In general, activarea lui presupune dimerizarea
portiunii extracitoplasmatice
juxtapunerea
a doua domenii catalitice
transfosforilarea reziduurilor tirozinei din bucla
de activare a domeniului kinazic
(autofosforilarea) + altor zone din domeniul
intracelular.
Fosforilarea initiaza modificari conformationale
care favorizeaza legarea ATP de receptor si
substrat; fosfotirozinele folosesc ca situsuri de
legare pentru alte proteine implicate in
semnalarea mediata de RTK.
Reziduurile fosforilate ale portiunii tirozinei
citosolice a receptorului activat interactioneaza
cu proteine adaptor ce contin grupari SH2 si
situsuri de legare proteica.
CALEA RECEPTORULUI
TIROZINKINAZEI
Proteinele adaptor cupleaza RTK activati cu alte componente ale caii
de semnalizare dar nu au ele insele proprietati de semnal.
De ex. GRB2 (o proteina citoplasmatica) este un astfel de adaptor. Este o
proteina care contine doua domenii SH2. Legarea ei de reziduul tirozinic
specific este urmata de legarea si activarea Sos, proteina ce functioneaza ca
o proteina schimbatoare de guanin nucleotid, convertind RAS intr-o forma
activa. RAS este legata de ADP in forma inactiva si devine activa sub
actiunea unui factor de schimb guanin nucleotid; forma activa se transforma in
cea inactiva prin hidroliza GTP.
ACTIVAREA RAS
RAS activata stimuleaza mai multe cai de semnalizare:
- Recruteaza serine/threonine kinaza Raf din membrana citoplasmatica, care apoi,
tot prin fosfolirare, va activa MEK 1 si 2, kinaze care fosforileaza specific reziduurile
treonina si tirozina ale MAP kinazei, activandu-le capacitatea catalitica (ERK este
un alt acronim pentru MAP= Extracellular Signal-regulated Kinase-1.) MEK se leaga
de domeniul C-terminal catalitic al Raf si este fosforilat de Raf serine/ threonine
kinaza; aceasta fosforilare declanseaza activitatea catalitica a MEK. In acest fel,
activarea Ras induce o cascade kinazica ce include Raf, MEK, si MAP kinaza.
- O alta importanta clasa recrutata este clasa IA fosfatidil inozitol 3 kinaza (IA PI 3K), care se asociaza direct cu receptorul prin intermediul domeniului SH2; cele 3
clase de IA PI 3-K sunt implicate in sinteza celulara, declansarea ciclului celular,
supravietuirea celulara, proliferare, metabolism, autofagie, geneza ribozomala,
translatia ARNm.
- Alte semnale efectoare mai selective pentru RTKs cum sunt PDGFr includ
fosfolipaza Cg, protein adaptor Nck, si tirozin fosfataza Shp2, ca si reglatorii negativi
Ras-GAP si Cbl.
ACTIVAREA RAS
RAS prezinta mutatii in 40-90% din neoplazii: frecventa cea mai mare de
mutatii se intalneste in cancerele pancreatice (90%).
Proteinele mutante din neoplazii permit legarea guanin nucleotidului
de RAS dar nu si hidroliza acestuia, determinand in consecinta o stare
de continua activare care duce la transformarea neoplazica prin
proliferare celulara in absenta stimulului generat de factorii de crestere.
In unele forme de cancere au fost identificati RTKs asociati cu forme
mutante de receptori pentru factorii de crestere care trimit un semnal de
proliferare la celule in absenta factorului de crestere. Un astfel de mutant,
codificat intr-un nou locus, contribuie la proliferarea necontrolata a unor
cancere la san.
CALEA Ras-MEK-ERK
Ras activata recruteaza
serine/treonin kinaza Raf din
membrana celulara.
Raf, prin fosfolirare, va activa
MEK 1 si 2.
MEK 1 si 2 sunt kinaze care
fosforileaza specific reziduurile
treonina si tirozina ale ERK
kinazei, activandu-le
capacitatea catalitica.
ERK induce transcriptia
nucleara.
In acest fel, activarea Ras
induce o cascada kinazica ce
include Raf, MEK, si MAP
kinaza.
MODIFICARI EPIGENETICE
NOTIUNI
GENERALE
Metilarea ADN
Deacetilarea histonelor
Imprinting
MODIFICARI
EPIGENETICE
PIERDEREA IMPRINTING-ului
GENOMIC
In mod normal, imprinting- ul genomic este o modificare epigenetica a genomului
care permite sa fie exprimata numai o singura alela (fie doar cea materna, fie doar
cea paterna). Pana in prezent sunt identificate aprox. 30 de gene de mamifere
care pot suferi fenomenul de imprinting.
In cancer, poate apare pierderea imprinting-ului (LOI), care permite exprimarea
ambelor alele (si a celei materne si a celei paterne).
Daca fenomenul apare pentru un factor de crestere, cum ar fi insulin-like growth
factor-2 (IGF-2), celule dobandesc o doza dubla de semnal de stimulare a
cresterii.
- LOI al IGF-2 a fost observat in aproximativ 45% din pacientii cu cancer
colorectal.
- LOI al IGF-2 a putut fi detectat si in leucocitele circulante ale acestor pacienti
sugerand ca este o alterare care precede inceputul neoplaziei si ca ar putea fi
folosita ca un test de screening al susceptibilitatii pentru cancer.
PIERDEREA IMPRINTING-ului
GENOMIC
CLASIFICAREA TUMORILOR
MALIGNE
CLASIFICAREA CLASICA A
TUMORILOR
tumori benigne
tumori maligne.
Practic o tumora benigna este un tesut alcatuit din celule normale care si-au pierdut
capacitatea de reglare a proliferarii si care se reproduce in exces. Complicatia majora a
tumorilor benigne este compresia pe care o exercita asupra structurilor din proximitatea lor.
Histologic, tumorile benigne sunt compuse din celule asemanatoare cu celulele mature ale
tesutului respectiv
Cu cat apar mai multe modificari fata de celulele normale cu atat celula ce compune tumora
maligna este mai agresiva: aceea se vorbeste de grade de malignitate.
Intreagul efort de clasificare al tumorilor are ca scop stabilirea locului tumorii respective pe
scara dintre benign si malign.
TUMORILE MALIGNE
Histologic, tumorile maligne sunt compuse din celule:
care pastreaza doar in mica masura structura si functiilor tesutului de provenienta (cu cat sunt mai apropiate de
celule mature cu atat gadul lor de malignitate este mai redus),
se divid mult mai repede (un raport intre nucleu si citoplasma in favoarea nucleului),
prezinta nucloli vizibili la microscopul optic, ca marker al multiplelor mitoze,
prezinta relativ putine structuri de celula matura.
dau metastaze la distanta; uneori, chiar si pe sectiunile histologice clasice se constata ruperea membranelor
bazale sau extravazarea lor ca prim pas spre metastazare.
SAGE
Analiza seriata a exprimarii genice (SAGE= Serial analysis of gene
expression) permite o evaluare simultana si comprehensiva a multiplelor specii
mARN.
Spre deosebire de analiza prin microsonde (microarray), SAGE nu necesita
cunoasterea anterioara a genelor de interes si furnizeaza date cantitative si
calitative teoretic (potential) a tuturor secventelor transcrise intr-un tesut
specific sau intr-o celula.
Mai mult de cat atat, SAGE poate cuantifica transcripturi in cantitate mica (lowabundance transcripts) si poate sa detecteze in mod pertinent concentratii
relativ mici ale diferentelor de concentratii de transcripti intre populatii celulare.
SAGE
Metoda SAGE genereaza o secventa tag care functioneaza ca un unic
identificator al transcrierii, derivat dintr-o locatie bine definita a transcriptului.
Multe tinte ale transcrierii (transcript tags) sunt concatenate intr-o singura
molecula si apoi secventiate, relevand identitatea multiplelor tinte simultan.
Prezentarea relativa a fiecarui membru in bazele de date (library) SAGE este
proportionala cu corespondentul de abundenta a mRNA in populatia de
transcriere originala.
Profilele de expresie comparativa pot fi deduse prin compararea abundentei
tintelor individuale din fiecare set de probe. Aceasta permite modificari in
profilele de expresie globale a tesuturilor normale sau maligne in conditiile
terapeutice diferite care trebuie rapid evaluate.
PROFILLING TUMOURS
tehnica de determinare a profilului tumorii monitorizeaza patternul de expresie
globala al genelor si a permis dezvoltarea taxonomiei moleculare a cancerului.
Se bazeaza pe sondele de ADN colorate in 2 culori si evalueaza simultan mii de
transcripti ai genelor si exprimarea lor relativa, furnizand o imagine snapshot a
transcriptomului
Transcriptom = intregul complement de transcripturi ARN
produse la un anumit moment
Stabilirea profilului transcriptional prin utilizarea microsondelor implica screeningul exprimarii mRNA din doua surse (tumora si celule normale), folosind cDNA
complementar sau biblioteci (baze de date) de oligonucleotide aranjate intr-o
extrem de mare densitate microchip-uri.
PROFILLING TUMOURS
Acestea sunt studiate cu o mixtura de cDNAs marcat fluorescent generat din
probele provenite din tumora si din celulele normale o colorare diferita a
fiecarei gene (reprezentata in final printr-un punct).
Intensitatea relativa a celor doua culori diferite reflecta nivelul de exprimare a
RNA a fiecarei gene din fiecare proba asa cum ar fi analizata cu un scanner
laser focalizat.
Utilizand microsonde, se pot monitoriza sistematic si individualizat gene care
constituie markeri de diagnostic, prognostic, sau markeri relevanti pentru
terapie.
- De asemenea, intregul set de gene exprimate poate fi analizat colectiv prin
utilizarea unor metode statistice pentru a clasifica tumorile pe baza
profilului lor transcriptional.
ANALIZA DE LINKARE
In urma Studiului Cancer and Steroid Hormone s-a definit initial modelul genetic autosomal
dominant cu penetranta mare validat prin analiza de linkare si identificat ca BRCA 1 si 2.
Acestea sunt gene predispozante la cancer la san cu penetrare mare.
Analizele de segreagare ulterioare, mai complexe au evidentiat si alte gene, favorizand
modelul poligenic in care factori genetici multipli actioneaza independenti. Componentul
poligenic al riscului este log normal distribuit, are o varianta care scade liniar cu varsta si
se aplica similar purtatoarelor de mutatii BRCA si nepurtatoarelor.
Datele sunt consistente cu observatiile ca excesul de cancer de san familial este distribuit in
multe familii, fiecare cu un numar redus de cazuri mai degraba decat in putine familii cu
multe cazuri.
Studiile de linkaj sunt folosite pentru a mapa un locus al unei boli prin analiza co- segregarii
markerilor genomici cu un fenotip specific de boala utilizand probe ale mai multor membrii
ale familiilor numeroase. Regiunea din genom din jurul markerilor linkati este integrata
pentru posibilitatea de a contine gene cauzatoare (determinante) celor care poarta mutatia.
Daca corelatia dintre o gena cu penetranta redusa si cancer este mica status-ul mutatiei la
familiile cu mutatia respectiva pozitiva ar putea fi insuficient pentru a genera un semnal.