Sunteți pe pagina 1din 71

APLICAREA GENOMICII IN STUDIUL

ONCOGENEZEI SI IN CLASIFICAREA
TUMORILOR NEOPLAZICE

CUPRINSULCURSULUI
ONCOGENEZA
- MODIFICARI FIZIOPATOLOGICE
- GENE IMPLICATE IN ONCOGENEZA

SEMNALIZAREA INTRA SI INTERCELULARA MODIFICATA


PATOLOGIC
MODIFICARI EPIGENETICE IN NEOPLAZII
CLASIFICAREA TUMORILOR MALIGNE
- CLASIFICAREA CLASICA A TUMORILOR
- STADIALIZAREA CLINICA CLASICA
- UTILIZAREA GENOMICII IN CLASIFICAREA SI STADIALIZAREA
TUMORILOR MALIGNE

ONCOGENEZA

DEFINITIE
Bolile neoplazice reprezinta un grup de afectiuni caracterizate prin:

cresterea celulara anormala


invazia la distanta fata de tesutul tinta.
Cresterea celulara este datorata pierderii controlului ciclului celular normal
Invazia la distanta este datorata schimbarii proprietatilor de adezivitate si de
supravietuire in mediu a celulei neoplazice.
Leziunea primara este la nivel genic dar modificarile epigenetice sunt aproape
intotdeauna prezente.

MODIFICARI GENOMICE IN NEOPLAZII (Rudon)


1. exprimarea in exces a proteinelor oncogene datorita translocarii, amplificarii sau
mutatiilor cromozomiale.
2. pierderea proteinelor de supresie a tumorilor prin deletii sau mutatii ale genelor ce
le produc.
3. alterarea pattern-ului de metilare a ADN-ului.
4. erori de imprinting genetic cu supraproductie de substante de crestere (IGF-2 =
insulin growing factor 2).
5. cresterea sau reglarea la nivel crescut a factorilor de crestere (eg TGF- =
transforming growth factor- ), factori tumorali de angiogeneza, PDGF= plateletderived growth factor, factori de crestere hematopoetica (eg: CSFs= colony
stimulating factor, interleukine).
6. instabilitatea genomica cu pierderea progresiva a reglarii proliferarii celulare,
cresterea invazivitatii, si cresterea potentialului metastatic.
7. nivele mari de enzime implicate in sinteza acizilor nucleici si nivele ridicate de
enzime litice (eg, proteaze, colagenaze, glicozidaze).
8. exprimarea in exces a genelor de oncodezvoltare de tipul antigenelor oncofetale
(eg, antigen carcinoembrionic), hormoni placentari (eg, human chorionic
gonadotropin).

PUNCTELE DE CONTROL ALE CRESTERII


CELULARE
Se asigura ca celula a parcurs toate procesele necesare completarii unei faze inainte de a
avansa in etapa urmatoare a ciclului celular. Controlul se realizeaza prin ciclin kinaze .

G2M Este punctul in


care se decide
mitoza.
Este controlat de MPF
= M phase promoting
factor, o ciclin
dependent kinaza.
ADN modificat are
actiune de fosforilare
a MPF, inhiband-o.

Spindle check point = se asigura ca toti


cromozomii sunt aliniati pe fusul de
diviziune

Parcurgerea ciclului celular este


stimulata de cyclin-kinaze.
G1 Este punctul in care se decide daca
celula intra in diviziune sau nu si care leaga
diviziunea de cresterea celulara. Este un
punct de restrictie influentat de semnale
interne (nutritie, dimensiuni celulare) si
externe: factori de crestere si diviziune.
Controlat de p53 care dicteaza apoptoza
daca exista alterari majore ale ADN.

PUNCTE DE CONTROL ALE CRESTERII


CELULARE
In general, kinazele sunt enzime care
adauga PO4+2, activnd proteinele iar
fosfatazele (care indeparteaza PO 4+2)
dezactiveaza proteinele.
Celula care a suferit o alterare a ADN-ului
normal datorata radiatiei ultraviolete (UV)
sau radiatiei X, este blocata in G 1 pentru
ca leziunea ADN sa fie reparata inaintea
replicarii celulare.
Celulele canceroase, care au putine sau nu
au de loc puncte de control, continua sa
isi replice ADN-ul modificat; in acest mod
mutatiile persista si se acumuleaza
progresiv.

G1- Gap 1- celula creste


S- faza de sinteza a ADN
G2 Gap 2 celula se pregateste
de diviziune
M- mitoza (diviziunea celulara)

CEASUL DE CONTROL AL CICLULUI


CELULAR

In mod normal proliferarea este


programata prin modul de exprimare
a genelor in diferite momente ale
ciclului celular si reglata de 3 categorii
de factori:

factorii de crestere (TGF = transforming


growth factor, factori ce stimuleaza
receptorii tyrosin kinazici)

factorii de inhibitie a cresterii

hormoni

http://outreach.mcb.harvard.edu/animations/checkpoints.swf

PROCESUL NORMAL DE REPARARE A ADN-ul


Structura ADN-ul este periodic modificata de diferiti factori:
exogeni (carcinogeni chimici, lumina UV, etc)
endogeni (reactii de tip oxidativ, deaminarea citozinei, etc).
In mod normal, interventia mecanismele de control al diviziunii celulare repara
alterarea ADN-ului prin:
(1) Indepartarea dimerilor de pirimidina indusi de radiatii UV
(2) Excizia zonei in care s-a produs o ruptura a lantului si refacerea lungimii
secventei normale
(3) Repararea exciziei bazelor care a dus la formarea unor locusuri
apurinice sau apirimidinice
(4) Repararea prin excizie a nucleotidelor modificate
(5) O6-alkilguanine-ADN alkiltransferaza recunoaste si indeparteaza
fragmente alchil de dimensiuni mici (alkyl adducts) din lantul de ADN

TELOMERII
Celulele umane normale parcurg un numar finit de diviziuni celulare in
culturi si, in final, nu se mai divid ( senescenta replicativa).
Numarul de diviziuni celulare atins inainte de senescenta este de aprox. 50.

O diferenta intre celulele tinere si cele senescente care continua sa se


replice este lungimea cozilor/capetelor/ tails specializate ale capetelor
cromozomilor, numite telomere.
Celulele tinere au telomere mai lungi.

Telomerele sunt alcatuite in medie din 5,000 -15,000 de perechi de baze


repetate ce contin secventa (TTAGGG)n impreuna cu proteinele care
leaga telomerul.
In timpul fiecarei diviziuni, sunt pierdute 50-100 de perechi de baze si se
emite un semnal celular de oprire a diviziunii.

ROLUL TELOMERAZEI
Telomeraza este un complex ribonucleoproteic care contine mai multe
proteine si ARN. Componentul catalitic al acestui complex este o
reverse transcriptaza (= enzima ce permite formarea de duble catene de
ADN din monocatena-matrita de ARN), hTERT, care foloseste ARN-ul
continut in complex ca matrice pentru reverse transcriptia necesara
replicarii secventelor de ADN din telomere.
Rolul principal al telomerazei: mentinerea lungimii telomerelor
Celule germinale si celulele pluripotente au activitate telomerazica;
telomeraza isi inceteaza activitatea in celulele din majoritatea
tesuturilor, pe masura ce acestea se diferentiaza.
Cele mai multe cancere umane par a fi capabile sa reactiveze activitatea
telomerazica, reluandu-si capacitatea proliferativa; totusi 10%-15% din
cancere nu exprima telomeraza si, aparent, mentin lungimea
telomerului printr-un mecanism diferit.

MODIFICARI FENOTIPICE IN ONCOGENEZA


(Stephen J. McPhee si Garry D Hammer)

1. instabilitatea genomica: alterarea repararii ADN-ului, controlul aberant al punctelor de


control ale ciclului celular
2. cresterea proliferarii: crestere autonoma, anomalii ale controlului ciclului celular, raspunsul
exagerat la factorii de stimulare a cresterii sau hormonali, lipsa de raspuns la factorii de
contact sau inhibitori sau la factorii de inhibare a cresterii
3. evitarea raspunsului imun: modulare sau mascare antigenica, sinteza de molecule
antagoniste raspunsului imun
4. invazia tisulara si a stromei: atasare de matricea extracelulara, secretia de enzime
proteolitice, recrutarea de celule mezenhimale care sa secrete enzime proteolitice,
pierderea adeziunii celulare
5. dobadirea capacitatii de a trece in sange si sistemul limfatic: cresterea motilitatii
celulare, recunoasterea secventelor proteinelor endoteliale, modificari ale citoscheletului
6. formare de metastaze: adeziune celulara si atasare celulara, tropism specific de tesut
7. abilitatea de neoformare vasculara permite cresterea tumorii primitive si a celor secundare
8. rezistenta la medicatie: metabolism alterat al medicamentelor, inactivarea
medicamentelor, cresterea sintezei enzimelor tinta, cresterea efluxului de medicamente.
Modificarea procesului de reparare a ADN-ului

INSTABILITATEA GENOMICA
Instabilitatea genomica este generata de pierderea controlului normal asupra activitatii
genelor, ducand in final la pierderea controlului asupra ciclului celular si la proliferare
aberanta.
Controlul genetic se realizeaza prin factorii de transcriptie, proteine care se leaga de
multiplele locuri de legare situate in genomul normal:
inaintea situsului de unde incepe transcrierea, ce contine structuri de legare a ARN-polimerazei
(promotorii)
la distanta variate (uneori la mare distanta) de gena tinta a transcrierii (amplificatorii = enhancers).

Exista factori de transcriere universali, care se leaga specific de un enhancer in toate


celulele din organism si factori de transcriere cu specificitate de actiune celulara, care
actioneaza doar in anumite tipuri particulare de celule.
In neoplazii instabilitatea genomica se refera la o tendinta crescuta de aparitie a
alterarilor in genom in timpul ciclului celular. Instabilitatea genomica este minimizata de
4 mecanisme: replicarea fidela a ADN-ului in faza S, segregarea corecta a cromozomilor
in mitoza, repararea perfecta a alterarilor sporandice ale ADN-ului si o coordonare buna
a progresiei ciclului celular.

GENE IMPLICATE IN ONCOGENEZA


gene care confera un avantaj competitiv celulei neoplazice fata de celula de origine

GENE TUMOR
SUPRESSOR

Confera un avantaj de crestere a


celulelor neoplazice prin
pierderea unor functii normale
a celulei
Sunt gene care in mod normal
normal opresc progresia ciclului
celular : ex p 53, gena Rb,
genele BRCA1 si 2
In absenta fenomenului de
imprinting, in cazul tumor
supressor genes, ambele alele
trebuie sa prezinte modificarea.

PROTO-ONCOGENE
Confera un avantaj celulei
neoplazice prin castigarea unei
functii inexistenta in celula de
initiala, de provenienta.
Sunt gene normale care sufera
mutatii: de ex. ale factorilor de
crestere celulara sau a cascadei
cyclin ciclazelor
Pentru oncogene mutatia este de
obicei la nivelul unei singure alele.

MECANISMUL DE ALTERARE GENICA


CE DUCE LA ONCOGENEZA
TUMOR SUPRESSOR
GENES
Trebuie sa fie inactivate
pentru a le anula functia
specifica celulara.
Inactivarea se realizeaza
prin:
frame-shift mutation
deletia unei parti sau a
totalitatii genei
silencing-ul genei
secundar metilarii

PROTOONCOGENELE
Protooncogenele trebuie sa

fie activate, functia lor


nefiind prezenta in celula
normala. Activarea se
realizeaza prin:
mutatii
amplificare genica sau
supra- exprimare
translocare cromozomiala
insertia unui material viral
in genom

TUMOR SUPRESSOR GENES


EXEMPLE
Gena Rb
Gena p53 are rol in reglarea ciclului celular:
BRCA1 si 2 cu rol in repararea ADN dublu catenar (DNA ds-break repair). Mutatii
ale lor sunt responsabile de majoritatea cancerelor de san familiale (5-10% din
cancere la san) si ovariene familiale (8% din totalul cancerelor ovariene).
Transmiterea este autosomal dominanta.
BRCA2 se asociaza cu un RR intre 50 si 100 pentru cancerul la san la barbati, de 5
pentru cancerul de prostata sau pentru cel de vezica biliara, de 4 pentru cancerul
pancreatic si de 3 pentru melanomul malign si cancerul de stomac.

GENA p53 permite recunosterea ADN-ului modificat si


incetineste ciclul celular pana la repararea ei sau declanseaza
activarea mecanismului de moarte programata a celulei (apoptoza)

Gena pentru P53 este


localizata pe cromozomul 17
(bratul scurt, 17p13), o
regiune care sufera frecvent
deletii in cancer.

Gena p53 umana are 22 000 bp , cu11 exoni


(albastru ) codificand un ARN m de 2.2 Kb.
Translatia incepe la exonul 2.
Dimensiunile exonilor si intronilor sunt redate in bp.

REPARAREA ADN
ROLUL p53
p53, denumita astfel deoarece
codifica o proteina fosforilata cu
GM = 53 kDa.
Proteina p53 functioneaza atat la
nivelul punctului de control G1
(unde poate opri ciclul celular)
cat si in punctul de control G2.
p53 este un factor de transcriptie, dar, in mod normal este foarte instabila si nu se
acumuleaza suficient pentru a activa transcriptia. Nivelul p53 este mentinut scazut
prin legare de alte proteine (MDM2, COP1, PIRH2 sau JNK) care ii si promoveaza
degradarea pe calea ubiquitin/proteazomilor. MDM2 blocheaza transcriptia genei
p53. Cele mai multe gene ale acestei cai sunt reglate de p53, formand o bucla de
feedback negativa.
Alterarea ADN stabilizeaza p53, crescandu-i concentratia. Una din genele a carei
transcriptie o stimuleaza p53 codifica p21CIP, un inhibitor de cyclin- kinaza (CKI)
care leaga si inhiba complexele Cdk-cyclina. Ca rezultat, celula este blocata in G1
(si G2) pana leziunea ADN-ului este reparata si nivelul p53 scade (ducand la
scaderea p21CIP). In acest fel, cyclin-kinazele isi pot relua activitatea.
Daca leziunea ADN este extinsa, p53 dicteaza apoptoza celulei respective.

Distributia celulele umane in cultura a celulelor in G1, S, si G2 a fost


determinata prin analiza continutului in ADN masurat prin fluorescenta

Celulele cu p53 functionala se opresc in G1 sau G2 dupa expunere la


radiatii, in timp ce celule fara p53 (mutante) continua diviziunea.

REPARAREA ADN ROLUL


p53
Dupa un stres genotoxic sau non-genotoxic , activarea p53 se produce in
doua etape: initial nivelul proteinei p53 creste prin inhibarea interactiuni ei
cu mdm2 si alti reglatori negativi. Supra-translatia ARN-ului pentru p53
va asigura apoi acumularea p53. In al doilea rand, o serie de modulatori
(kinaze, acetilaze) activeaza activitatea transcriptionala a p53.
Calea p53 a fost impartita conventional de
Levine in 5 componente:
Semnalul stresor: activeaza calea
Mediatorii upstream: detecteaza si
interpreteaza semnalele upstream
Reglarea p53: interactiunile cu
proteinele care ii moduleaza stabilitatea

Evenimentele downstream: activarea


transcriptiei si interactiunile proteinaproteina

Rezultatul final: blocarea cresterii,


apoptoza sau repararea ADN.

John Wiley & Sons, Inc.

GENA Rb
Gena Rb este cunoscuta ca gena a retinoblastomului, o tumora a ce
apare la copiii care poarta aceasta gena.
Descoperita initial la familiile purtatoare ale acestei gene, este o gena
recesiva mutata sau pierduta in retinoblastom.
Gena complexa : 200 kb cu 27 exoni si introni cu dimensiuni intre
80bp - 60kb
Codifica o fosfoproteina nucleara ce controleaza ciclul celular in G1.
Aceasta se leaga nespecific de ADN, factori de transcripte (E2) sau de
complexele proteice (trithorax group) implicate in reglarea ciclului celular.

GENA RB

este activa doar in


jurul punctului de restrictie R al fazei
G1.

Inainte de punctul R din G1: Rb actioneaza ca un


active
repressor

represor activ al cresterii celulare


Dupa punctul R d in G1: Rb devine un represor
hiperforsforilat inactiv al cresterii (faciliteaza
progresia in ciclul celular). Stimulii care cresc
fosforilarea o inactiveaza.
La sfarsitul mitozei Rb este defosforilata.

M
G2

Rb
G1

Rb

P
P
PPPP

Inactive
repressor

pRB ROL IN REGLAREA CICLULUI


CELULAR

John Wiley & Sons, Inc.

In urma legarii de proteinele E2F


este inhibata transcriptia enzimelor
care faciliteaza progresia in ciclul
celular (ciclinele)

In faza tardiva a ciclului celular, proteina Rb (pRB)


fosforilata elibereaza E2F si genele tinta devin active
John Wiley & Sons, Inc.

John Wiley & Sons, Inc.

MECANISMELE DE INACTIVARE A GENEI


RB
Mutatie ce elibereaza factorii proteici
asociati
Sechestrarea Rb de catre
oncoproteinele virale, impiedicandu-i
legarea de alti factori .
SV40 T antigen
adenovirus E1A
Papillomavirus uman E7

Fosforilarea de catre complexele CDK


cyclina in timpul ciclului celular ii
anuleaza abilitatea de a se lega de
complexele thorax group.
Degradare prin proteoliza dependenta de
caspaze in timpul apoptozei.

RETINOBLASTOMUL SI MODELUL
CARCINOGENEZEI IN DOUA ETAPE
pentru genele tumour supressor
Knudson: gena RAS (a retinoblastomului) este
inactivata in 2 etape si de aceea:
- In cazurile familiale: frecventa retinoblastomului
este mare si boala are debut precoce:
In aceste cazuri retinoblastomul este datorat
unei mutatii germinative a unei alele Rb + peste
care se suprapune o mutatie dobandita a
celeilalte alele
ambele alele devin inactivate
- In cazurile sporadice (frecventa mica, debut
tardiv): retinoblastomul apare si necesita aparitia
succesiva (intre care exista un interval de timp
variabil) a 2 mutatii somatice dobandite la
ambele alele
ambele alele devin inactivate

ut
.

m
ut
.

**

*
early
onset

late
onset

GENELE BRCA1 SI BRCA2


BRCA1 este situata pe cromozomul 17q21 iar BRCA2
pe cromozomul 13q12.
Codifica proteine mari, cu 1,863 si respectiv 3,350 de
amino acizi, continand fiecare din ele peste 20 de
exoni.
Elemente comune cu alte gene: domeniul BRCT al
capatului C-terminal al BRCA1, un domeniu intalnit in
peste 40 de alte gene si asociat raspunsului la
alterarea ADN-ului.
Rol biologic:
Un semnal al alterarii ADN
Un efector al repararii ADN sau al punctelor de
control ale diviziunii celulare
Absenta lor nu e compatibila cu supravietuirea (exp
pe soarece) embrionului, iar deletia experimentala
partiala determina aparitia de neoplazii
Reglator al complexului BASC

G1- Gap 1- celula creste


S- faza de sinteza a ADN
G2 Gap 2 celula se pregateste de
diviziune
M- mitoza (diviziunea celulara)

COMPLEXUL BASC
BASC = BRCA1- associated genome-surveillance complex.

Include multiple proteine (printre care ATM ataxia teleangiectazia, MSH2, MSH6,
Rad50-MRE11 - Meiotic Recombination-11, RFC (DNA Replication Factor-C, etc.)
Rol:
Regleaza transcriptia, moduland nivelul p53 si a proteinei de reparare a ADN,

RAD51; intervin in reglarea proteinelor ATM ce controleaza fosforilarea mai


multor proteine ce actioneaz in punctele de control si in repararea ADN cum
sunt: p53, MDM2, NBS1si al kinazelor CHK2 (cell-cycle-checkpoint kinase 2).
ATM fosforileaza BRCA1 dupa tratament cu radiatii ionizante, ca feedback pozitiv
Intervine post translatie
implicat in remodelarea cromatinei site-urile ADN alterate care permit accesul

proteinelor efectoare.

BRCA1/2 in repararea ADN

Nature review, vol: 4, 2004

MODEL AL CASCADEI DE SEMNALE


MEDIATE DE ATM SI ATR DUPA ALTERAREA
ADN (A.Tutt si A. Ashworth)
ATM regleaza raspunsul in mai multe puncte de control:
punctului de control G1-S prin:

ATM = gena mutata


a bolii ataxieteleangiectazie
punctului de control al fazei S reprezentat de kinaze CHK1 si
ATR = gena ataxie
CHK2.
teleangiectazie
- Acestea determina o crestere a transcriptiei inhibitorului p21
legata de Rad3
dependent de ciclin kinaza (CDK) si in final blocarea celulei.
ATM si ATR au atat
Fosforilarea CHK1 si CHK2 e mediata prin Cdc25C fosfataza.
roluri distincte cat
punctul de control G2M:
si roluri care se
- blocarea lui este mediata de activarea transcrierii de catre
suprapun.
p53 a 14-3-37 si GADD45 sau via CHK1 si CHK2 kinazelor,
care inhiba Cdc25 fosfataza (care ar activa complexului
Cdc2-B1-ciclina).
- cresterea activitatii p53, fie prin forsforilare directa, fie
indirect prin fosforilarea reglatorului sau negativ , MDM2

MODEL AL CASCADEI DE SEMNALE MEDIATE DE


ATM SI ATR DUPA ALTERAREA ADN (A.Tutt si A.
Ashworth)

ATM si ATR fosforileaza BRCA1: acest proces e important atat


in repararea rupturilor lanturilor duble de ADN prin recombinare
omologa si blocarea celulei in punctul de control G2-M, posibil
prin stimularea GADD45.

ATM fosforileaza NBS1 care este implicat in repararea DS8


(cand formeaza un complex cu MRE11 si RAD50) si ar putea fi
implicata in controlul punctului de control al fazei S.

ATM poate fosforila si c-BL-kinaza, care fosforileaza apoi


RAD51 (un efector de reparare omolog), c-ABL si PK-ADNdependenta se fosforileaza reciproc influentand interactiunea
PK-AND cu proteinele de reparare DS8 implicate in jonctiunile
terminale non omologe. (NHEJ)

PROTO-ONCOGENELE
Gene ce confera un avantaj competitiv de crestere celulelor
neoplazice printr-un mecanism de castigare de functii
celulare suplimentare
Mecanisme de aparitie a protoconcogenelor:
- Mutatii : exemplu, mutatia punctiforma a genei Ras
- Inlaturarea domeniului de reglare al genei (frecvent prin
translocare)
Translocarea: O gena non latenta (non quiescent) care
promoveaza cresterea celulara poate fi dizlocata in timpul
translocarii cromozomiale langa un enhancer gena
devine activa (in mod patologic, deoarece rolul ei era sa
fie inactiva) controlul cresterii celulare este pierdut.
- Amplificare: replicarea in exces, aleatorie, a unor regiuni
din genom; ex copii multiple de ras se gasesc in anumite
tumori.
- Insertie de oncogene virale

Exemplu de translocare
a genei myc

PROTO-ONCOGENELE
Un mecansim de aparitie a oncogenele este insertia unui material viral in genom.
Exemple: virusurilor HLTV 1 pentru leucemiile cu celulel T sau limfoame, virusului
hepatitei B pentru carcinomul hepatocelular sau HPV pentru cancerul de col uterin.

Retrovirusurile (virusuri ARN): o oncogena este transferata celulei gazda dupa ce


a suferit o modificare:
de exemplu in timpul transferului genei src (virusul sarcomului Rous) care codifica
protein tirozin kinaza, se pierd secventele 3 ale genei si rezultatul este cel al unei
proteine a carei sinteza celulara nu mai este controlata strict, devenind foarte activa si
ducand la multiplicare celulara necontrolata.

Virusurile ADN pot contine oncogene care sintetizeaza proteine ce inactiveaza


semnalizatorii reglatori negativi ai celulei, cum ar fi p53 sau Rb.

FUNCTII ALE ONCOGENELOR

Oncogenele pot realiza pentru celula maligna diferite functii care sa ii asigure
multiplicarea si sinteza de proteine care sa ii medieze migrarea si metastazare,
cum sunt:
1.

factorii de crestere (exemplu, Epithelium growth factor EGF , and platelet


derived growth factor PDGF)

2.

receptorii pentru factorii de crestere (Exemplu; PDGFR)

3.

factorii de transductie celulara (exemplu; Ras, Raf, & MEK)

4.

factorii de transcriptie (exemplu; Jun, Fos, Elk-1 & myc)

RAS
Genele RAS sunt cele mai frecvente oncogene intalnite in tumorile maligne umane
(30% din neoplazii), in special in cancerele pancreatice, colorectale, endometriale,
pulmonare si in cel de col uterin. Cele 3 gene RAS codifica 4 proteine (HRAS, NRAS,
KRAS (4A and 4B). Denumirea genei provine de la rat sarcoma.
Proteinele RAS sunt localizate pe suprafata interna a membranei celulare.
Functioneaza ca GTP-aze care cupleaza factorii de crestere celulari membranari la
mecanismele de semnalizare intracelulara a transcrierii, controland astfel multiple
procese celulare care:
mentin integritatea citoscheletului actinic,
contribuie la proliferarea, diferentierea, adeziune celulara si migrare celulara
Proteinele RAS sunt activate in mod normal de peste 20 de proteine efectoare.
Mutatia genelor poate duce la activarea independenta de semnalul factorilor de
crestere.

IMPLICATII ALE UNEI MUTATII


PUNCTIFORME A GENEI K-Ras

SEMNALIZAREA INTRA SI
INTERCELULARA MODIFICATA
PATOLOGIC

NOTIUNI GENERALE
Cele mai multe mecanisme fiziopatologice in oncogeneza presupun
modificarea la un anumit nivel a cailor de semnalizare intracelulara.
In mod normal, semnalizarea intra celulara este un proces generat de
variate influente externe:
- factori de crestere
- proteine din matricea extracelulara
- hormoni
- citokine
- factori care influenteaza mobilitatea
- factori care influenteaza adeziunea celulara.

NOTIUNI GENERALE
In principiu, activarea unui receptor:
- Genereaza nu doar un singur efect biologic, ci o cascada de evenimente
celulare cu exprimari fenotipice diferite. Aceste fenomene distincte sunt reglate
in interiorul celulei de unul sau mai multi adaptori de cele mai multe ori o
proteina cu multe domenii de interrelatie cu alte proteine dar si cu structuri
lipidice.
- In celule diferite, acelasi ligand poate avea efecte diferite.
- Un semnal al unei cai metabolice poate afecta rezultatul unei alte alte cai
metabolice, fenomen descris ca cross talk.
- Activarea unui receptor duce la activarea simultana a cailor de inactivare a
cailor activate, dupa o anumita perioada de la semnalul initial.

RECEPTORII TIROZINKINAZEI
(RTK)
includ 90 de membrii. Cei mai bine caracterizati sunt receptorii pentru:
- factorul de crestere derivat din plachete (platlet derivated growth factor = PDGF),
- factorul de crestere epidermic (epidermal growth factor = EGF)
- efrina (ephrin)
- factorului de crestere hepatocitar (HGF)
- factorului de crestere pentru fibroblasti (FGF)
- insulina.

Structura generala a RTK include 3 componente:


- un lant polipeptidic extracelular (monomeric pentru cei mai multi),
- o structura hidrofoba transmembranara
- o portiune citoplasmatica ce contine atat domeniul kinazic (un set distinct de residuuri
de tirozina) cat si alte secvente care regleaza reciclarea si/sau turnover-ul receptorului
si interactiunea cu moleculele semnalizatoare.

CALEA RECEPTORULUI
TIROZINKINAZEI
In general, activarea lui presupune dimerizarea
portiunii extracitoplasmatice
juxtapunerea
a doua domenii catalitice
transfosforilarea reziduurilor tirozinei din bucla
de activare a domeniului kinazic
(autofosforilarea) + altor zone din domeniul
intracelular.
Fosforilarea initiaza modificari conformationale
care favorizeaza legarea ATP de receptor si
substrat; fosfotirozinele folosesc ca situsuri de
legare pentru alte proteine implicate in
semnalarea mediata de RTK.
Reziduurile fosforilate ale portiunii tirozinei
citosolice a receptorului activat interactioneaza
cu proteine adaptor ce contin grupari SH2 si
situsuri de legare proteica.

CALEA RECEPTORULUI
TIROZINKINAZEI
Proteinele adaptor cupleaza RTK activati cu alte componente ale caii
de semnalizare dar nu au ele insele proprietati de semnal.
De ex. GRB2 (o proteina citoplasmatica) este un astfel de adaptor. Este o
proteina care contine doua domenii SH2. Legarea ei de reziduul tirozinic
specific este urmata de legarea si activarea Sos, proteina ce functioneaza ca
o proteina schimbatoare de guanin nucleotid, convertind RAS intr-o forma
activa. RAS este legata de ADP in forma inactiva si devine activa sub
actiunea unui factor de schimb guanin nucleotid; forma activa se transforma in
cea inactiva prin hidroliza GTP.

Recrutarea si fosforilarea proteinei adaptor Shc, impreuna cu legarea


subiacenta a Grb2/Sos, permite caii Ras/MAPK sa devina activa.
MAPK fosforileaza multe proteine, inclusiv factori de transcriere

ACTIVAREA RAS
RAS activata stimuleaza mai multe cai de semnalizare:
- Recruteaza serine/threonine kinaza Raf din membrana citoplasmatica, care apoi,
tot prin fosfolirare, va activa MEK 1 si 2, kinaze care fosforileaza specific reziduurile
treonina si tirozina ale MAP kinazei, activandu-le capacitatea catalitica (ERK este
un alt acronim pentru MAP= Extracellular Signal-regulated Kinase-1.) MEK se leaga
de domeniul C-terminal catalitic al Raf si este fosforilat de Raf serine/ threonine
kinaza; aceasta fosforilare declanseaza activitatea catalitica a MEK. In acest fel,
activarea Ras induce o cascade kinazica ce include Raf, MEK, si MAP kinaza.
- O alta importanta clasa recrutata este clasa IA fosfatidil inozitol 3 kinaza (IA PI 3K), care se asociaza direct cu receptorul prin intermediul domeniului SH2; cele 3
clase de IA PI 3-K sunt implicate in sinteza celulara, declansarea ciclului celular,
supravietuirea celulara, proliferare, metabolism, autofagie, geneza ribozomala,
translatia ARNm.
- Alte semnale efectoare mai selective pentru RTKs cum sunt PDGFr includ
fosfolipaza Cg, protein adaptor Nck, si tirozin fosfataza Shp2, ca si reglatorii negativi
Ras-GAP si Cbl.

ACTIVAREA RAS
RAS prezinta mutatii in 40-90% din neoplazii: frecventa cea mai mare de
mutatii se intalneste in cancerele pancreatice (90%).
Proteinele mutante din neoplazii permit legarea guanin nucleotidului
de RAS dar nu si hidroliza acestuia, determinand in consecinta o stare
de continua activare care duce la transformarea neoplazica prin
proliferare celulara in absenta stimulului generat de factorii de crestere.
In unele forme de cancere au fost identificati RTKs asociati cu forme
mutante de receptori pentru factorii de crestere care trimit un semnal de
proliferare la celule in absenta factorului de crestere. Un astfel de mutant,
codificat intr-un nou locus, contribuie la proliferarea necontrolata a unor
cancere la san.

CALEA Ras-MEK-ERK
Ras activata recruteaza
serine/treonin kinaza Raf din
membrana celulara.
Raf, prin fosfolirare, va activa
MEK 1 si 2.
MEK 1 si 2 sunt kinaze care
fosforileaza specific reziduurile
treonina si tirozina ale ERK
kinazei, activandu-le
capacitatea catalitica.
ERK induce transcriptia
nucleara.
In acest fel, activarea Ras
induce o cascada kinazica ce
include Raf, MEK, si MAP
kinaza.

Semnalizarea ERK este compartimentalizata in interiorul celulei. Sunt


necesare molecule distincte de activare in membrana celulara (KSR), in
endozomi (MP1), si in aparatul Golgi (Sef). ERK activat in membrana
citoplasmatica si endozomi poate tinti atat moleculele citoplasmatice cat si pe
cele nucleare. ERK activat in aparatul Golgi este retinuta in citoplasma de
Sef si deci nu poate actiona decat in citoplasma.

MODIFICARI EPIGENETICE

NOTIUNI
GENERALE

Loci genetic activi sunt eucromatine, in timp ce heterocromatina (compacta) e inactiva.

DNA are o lungime de 1.8 m si este comprimat la scara 1:400000 in nucleu.

Cromatina este organizata in nucleosomi de catre histone.

Fiecare nucleosom, contine un octamer de histone inconjurate de ADN. Un nucleozom,


impreuna cu legaturile lui, impacheteaza 200 de perechi de baze (66 nm). Nucleosomii
sunt infasurati prin rasucire in cromatina, ca o funie cu grosimea de 30 nm. Pentru ca
informatia genetica sa poata fi copiata, zona de cromatina trebuie sa fie spatiata (relaxed).

Modificarile conformationale pot duce la modificari ale promotorilor, enhacerilor sau la


modificari de exprimare a unor gene.

Metilarea ADN
Deacetilarea histonelor
Imprinting

MODIFICARI
EPIGENETICE

Metilarea DNA la nivelul cytosinei in insulele CpG este un alt mecanism de


reglare a expresiei genice. In general, secventele hipermetilate ale ADN-ul sunt
mai putin exprimate iar secventele hipometilate sunt mai bine exprimate.
Insulele CpG sunt secvente scurte bogate in dinucleotide CpG si se gasesc in
zonele reglatoare 5 din aprox. jumatate din genele umane. Alterarea patternului
de metilare a ADN apare in liniile celulare tumorale, pe modele animale de
tumori, si in cancerele umane.
Hipermetilarea ADN poate duce la pierderea functiei tumour supressor genes.
Ex: Hipermetilarea secventelor de reglare a unor gene cum ar fi p53, p15, p16, Ecadherin, vhl, and hmlh1, fiind una din cauzele tacerii (silencing ) genelor supresoare
tumorale.

Secvente CpG metilate aberant sunt detectate in ser si in tesuturile pacientilor cu


cancer colorectal, pulmonar, hepatic si de prostata.

MODIFICARI EPIGENETICE ACETILAREA


HISTONELOR

In conformatiile in care histonele impacheteaza strans ADN-ul, transcriptia


acestuia in mRNA) este inhibata.
Initierea transcriptiei genelor necesita o desfasurare partiala a miezului
octameric, care este reglat de modificari biochimice ale histonelor centrale.
Unele evenimente de amutire a genelor necesita atat deacetilare cat si
metilarea ADN

MODIFICARI EPIGENETICE ACETILAREA


HISTONELOR
Gene implicate in acetilarea/ deacetilarea histonelor :
2 categorii de gene asociate acetilarii: hat1 and hat2.
De ex. Acetilarea histone H4 reduce afinitatea cozii aminoterminale a ADN si
permite o reducere a infasurarii ADN-ului in jurul octamerului format de
histone. In acest fel scade densitatea impachetarii nucleozomului. Aceasta
face ca mai multe secvente ale ADN sa fie disponibile pentru transcriptie.
Deacetilarea histonei H4 de catre deacetilaza (HDAC1 and HDAC2) creste
afinitatea H4 pentru DNA si duce la o mai stransa infasurare a nucleozomilor si
o reducere a transcriptiei.
Membrii ai familiilor de gene HDAC1 and HDAC2 apartin unei retele de gene
reglate in mod coordonat, gene care sunt implicate in remodelarea cromatinei
in timpul diferentierii celulare.

Unele evenimente de amutire a genelor necesita atat deacetilare cat si


metilarea ADN

PIERDEREA IMPRINTING-ului
GENOMIC
In mod normal, imprinting- ul genomic este o modificare epigenetica a genomului
care permite sa fie exprimata numai o singura alela (fie doar cea materna, fie doar
cea paterna). Pana in prezent sunt identificate aprox. 30 de gene de mamifere
care pot suferi fenomenul de imprinting.
In cancer, poate apare pierderea imprinting-ului (LOI), care permite exprimarea
ambelor alele (si a celei materne si a celei paterne).
Daca fenomenul apare pentru un factor de crestere, cum ar fi insulin-like growth
factor-2 (IGF-2), celule dobandesc o doza dubla de semnal de stimulare a
cresterii.
- LOI al IGF-2 a fost observat in aproximativ 45% din pacientii cu cancer
colorectal.
- LOI al IGF-2 a putut fi detectat si in leucocitele circulante ale acestor pacienti
sugerand ca este o alterare care precede inceputul neoplaziei si ca ar putea fi
folosita ca un test de screening al susceptibilitatii pentru cancer.

PIERDEREA IMPRINTING-ului
GENOMIC

In mod paradoxal, LOI este reversibil prin efectul unor medicamente


care sunt inhibitori ai metiltransferazelor ADN-ului, cum este 5-aza-2deoxycytidine, sugerand ca LOI este indus de un eveniment de metilare
a ADN-ului aberant.
LOI al genei igf2 pare sa fie implicata in progresia tumorii, ducand la
un fenotip mai invaziv.

CLASIFICAREA TUMORILOR
MALIGNE

CLASIFICAREA CLASICA A
TUMORILOR

Tumorile se clasifica in:

tumori benigne

tumori maligne.

Caracterele de benignitate sunt date de:

asemanarea morfologica cu celulele normale

lipsa de mitoze aberante, modificari cromozomiale


lipsa de metastazare si

existenta chiar a unei capsule care o delimiteaza


foarte bine (element care nu e insa obligatoriu).

Practic o tumora benigna este un tesut alcatuit din celule normale care si-au pierdut
capacitatea de reglare a proliferarii si care se reproduce in exces. Complicatia majora a
tumorilor benigne este compresia pe care o exercita asupra structurilor din proximitatea lor.
Histologic, tumorile benigne sunt compuse din celule asemanatoare cu celulele mature ale
tesutului respectiv

Cu cat apar mai multe modificari fata de celulele normale cu atat celula ce compune tumora
maligna este mai agresiva: aceea se vorbeste de grade de malignitate.

Intreagul efort de clasificare al tumorilor are ca scop stabilirea locului tumorii respective pe
scara dintre benign si malign.

TUMORILE MALIGNE
Histologic, tumorile maligne sunt compuse din celule:
care pastreaza doar in mica masura structura si functiilor tesutului de provenienta (cu cat sunt mai apropiate de
celule mature cu atat gadul lor de malignitate este mai redus),
se divid mult mai repede (un raport intre nucleu si citoplasma in favoarea nucleului),
prezinta nucloli vizibili la microscopul optic, ca marker al multiplelor mitoze,
prezinta relativ putine structuri de celula matura.
dau metastaze la distanta; uneori, chiar si pe sectiunile histologice clasice se constata ruperea membranelor
bazale sau extravazarea lor ca prim pas spre metastazare.

Pe baza originii embriologice primitive ( in stadiile initiale ale dezvoltarii embrionului, se


disting trei straturi: ectodermul, mezodermul si endodermul) tumorile se clasifica in:
Carcinoame: Neoplaziile dezvoltate din celule ce apartin ectodermul si endodermul
Sarcoame: Neoplazii dezvoltate din celule derivate din mezoderm.
Malignitatile celulelor sanguine desi ar trebui sa apartina sarcoamelor, sunt clasificate separat in malignitati ale
sangelui (leucemii si limfoame).

Dupa gradul de invazivitate:


Carcinoamele se impart in:
carcinoame in situ (nu depasesc membrana bazala a tesutului respectiv)
carcinom invaziv depasesc membrana bazala, dar nu sunt leziuni la distanta si
carcinom metastazat exista tumori secundare.
Sarcoamele sunt claisficate dupa polimorfismul nuclear si rata mitotica (care determina gravitatea leziunii: un
grad mai mare este corelat cu o tendinta mai mare la invazie la distanta).

STADIALIZAREA CLINICA CLASICA


Stadializarea tumorilor presupune:
Stabilirea sediului leziunii primare
Stabilirea dimensiunii si a numarului
tumorilor
Stabilirea afectarii sau nu a ganglionilor
limfatici
Stabilire tipului celular si a gradului de
diferentiere fata de celula normala
Prezenta sau absenta metastazelor

Cel mai important element este


gradul de diferentiere a celulei
neoplazice, impreuna cu
consecintele ce decurg de aici:
exprimarea sau nu a unor receptori
de suprafata, proprietatile
imunologice, formarea de proteine.
Metodele clasice de histologie au
fost completate cu metode de
imunohistochimie, determinari de
receptori, etc.

Tumora primara (T)


TX - Tumora primitiva nu poate fi stabilita
T0 - Nu exista o tumora primara evidentiata
Tis - Carcinom in situ (CIS)
T1, T2, T3, T4 - Dimensiunea si/sau extensia
tumorii primitive
Ganglioni limfatici regionali (N)
NX - Ganglionii limgatici regionali nu pot fi
evaluati
N0 - Nu exista ganglioni regionali invadati
N1, N2, N3 - Invadarea ganglionilor regionali
(in functie de numarul statiilor ganglionare
si /sau a extensiei)
Metastaze la distanta (M)
MX - Metastazele la distanta nu pot fi
evaluate
M0 - Nu exista metastazele la distanta
M1 - Exista metastaze la distanta

CONTRIBUTII ALE GENOMICII


IN ONCOLOGIE

TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARA


UTILIZATE IN ONCOLOGIE
Modificarile mari de aranjare ale unor gene in boala neoplazica sunt
studiate prin:
- analiza citogenetica prin hibridizarea in situ si marcare cu fluoresceina a
cromozomilor in metafaza.
- Este utila daca alterarea genetica este suficient de mare (cum ar fi o
deletie importanta), de ex in Leucemia Mielocitara Cronica

Modificari medii in aranjarea genelor:


Analiza ADN-ului prin electroforeza si Southern blotting pentru analiza
citogenetica detecteaza modificari mai mici in structura genelor, pe care
studiile de cariotip nu le detecteaza.

TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARA UTILIZATE IN


ONCOLOGIE
Modificari de foarte mare sensibilitate:
- Polymerase chain reaction (PCR) poate detecta alterari in structura ADN cu
o foarte mare sensibilitate. O particularizare a acestei tehnici este si tehnica
de secventiere prin chip-uri (chip sequencing technique) utilizata in
localizarea, izolarea si identificarea secventelor de ADN ocupate de proteine
celulare de legare a ADN-ul in mod specific.
- Aceste site-uri de legare pot indica functiile unor reglatori ai transcriptiei si
ajuta la identificarea genelor tinta ale acestor reglatori in timpul initierii si/sau
evolutiei bolii.
- Tipurile de elemente functionale identificate in acest mod includ promotori,
amplificatori, represori si factori silencing, izolatori (insulators), elemente
de legatura si secvente care controleaza replicarea ADN.

SAGE
Analiza seriata a exprimarii genice (SAGE= Serial analysis of gene
expression) permite o evaluare simultana si comprehensiva a multiplelor specii
mARN.
Spre deosebire de analiza prin microsonde (microarray), SAGE nu necesita
cunoasterea anterioara a genelor de interes si furnizeaza date cantitative si
calitative teoretic (potential) a tuturor secventelor transcrise intr-un tesut
specific sau intr-o celula.
Mai mult de cat atat, SAGE poate cuantifica transcripturi in cantitate mica (lowabundance transcripts) si poate sa detecteze in mod pertinent concentratii
relativ mici ale diferentelor de concentratii de transcripti intre populatii celulare.

SAGE
Metoda SAGE genereaza o secventa tag care functioneaza ca un unic
identificator al transcrierii, derivat dintr-o locatie bine definita a transcriptului.
Multe tinte ale transcrierii (transcript tags) sunt concatenate intr-o singura
molecula si apoi secventiate, relevand identitatea multiplelor tinte simultan.
Prezentarea relativa a fiecarui membru in bazele de date (library) SAGE este
proportionala cu corespondentul de abundenta a mRNA in populatia de
transcriere originala.
Profilele de expresie comparativa pot fi deduse prin compararea abundentei
tintelor individuale din fiecare set de probe. Aceasta permite modificari in
profilele de expresie globale a tesuturilor normale sau maligne in conditiile
terapeutice diferite care trebuie rapid evaluate.

PROFILLING TUMOURS
tehnica de determinare a profilului tumorii monitorizeaza patternul de expresie
globala al genelor si a permis dezvoltarea taxonomiei moleculare a cancerului.
Se bazeaza pe sondele de ADN colorate in 2 culori si evalueaza simultan mii de
transcripti ai genelor si exprimarea lor relativa, furnizand o imagine snapshot a
transcriptomului
Transcriptom = intregul complement de transcripturi ARN
produse la un anumit moment
Stabilirea profilului transcriptional prin utilizarea microsondelor implica screeningul exprimarii mRNA din doua surse (tumora si celule normale), folosind cDNA
complementar sau biblioteci (baze de date) de oligonucleotide aranjate intr-o
extrem de mare densitate microchip-uri.

PROFILLING TUMOURS
Acestea sunt studiate cu o mixtura de cDNAs marcat fluorescent generat din
probele provenite din tumora si din celulele normale o colorare diferita a
fiecarei gene (reprezentata in final printr-un punct).
Intensitatea relativa a celor doua culori diferite reflecta nivelul de exprimare a
RNA a fiecarei gene din fiecare proba asa cum ar fi analizata cu un scanner
laser focalizat.
Utilizand microsonde, se pot monitoriza sistematic si individualizat gene care
constituie markeri de diagnostic, prognostic, sau markeri relevanti pentru
terapie.
- De asemenea, intregul set de gene exprimate poate fi analizat colectiv prin
utilizarea unor metode statistice pentru a clasifica tumorile pe baza
profilului lor transcriptional.

IDENTIFICAREA IMPLICARII GENELOR


BRCA
Epidemiologia observationala a cuantificat contributia factorilor
genetici si predictia asupra felului in care acesti factori vor actiona
separat sau impreuna in cresterea riscului.
Modelarea genica (analiza de segregare) - presupune prefigurarea
de scenarii despre posibilitatile de aparitie a bolii datorita unor
combinatii ale genelor cunoscute sau ipotetice cu un risc, prevalenta si
modul de transmitere ereditara cunoscut.
- Pattern-urile de cancere prezise sunt apoi comparate cu frecventa
observata a bolii si in acest fel este validat cel mai bun model.

ANALIZA DE LINKARE
In urma Studiului Cancer and Steroid Hormone s-a definit initial modelul genetic autosomal
dominant cu penetranta mare validat prin analiza de linkare si identificat ca BRCA 1 si 2.
Acestea sunt gene predispozante la cancer la san cu penetrare mare.
Analizele de segreagare ulterioare, mai complexe au evidentiat si alte gene, favorizand
modelul poligenic in care factori genetici multipli actioneaza independenti. Componentul
poligenic al riscului este log normal distribuit, are o varianta care scade liniar cu varsta si
se aplica similar purtatoarelor de mutatii BRCA si nepurtatoarelor.
Datele sunt consistente cu observatiile ca excesul de cancer de san familial este distribuit in
multe familii, fiecare cu un numar redus de cazuri mai degraba decat in putine familii cu
multe cazuri.
Studiile de linkaj sunt folosite pentru a mapa un locus al unei boli prin analiza co- segregarii
markerilor genomici cu un fenotip specific de boala utilizand probe ale mai multor membrii
ale familiilor numeroase. Regiunea din genom din jurul markerilor linkati este integrata
pentru posibilitatea de a contine gene cauzatoare (determinante) celor care poarta mutatia.
Daca corelatia dintre o gena cu penetranta redusa si cancer este mica status-ul mutatiei la
familiile cu mutatia respectiva pozitiva ar putea fi insuficient pentru a genera un semnal.

IDENTIFICAREA IMPLICARII GENELOR


BRCA
Screeningul mutatiilor genelor candidate: deoarece frecventa
mutatiilor de acelasi tip este redusa, identificarea genelor implicate se
poate realiza doar prin studierea intregii secvente de codificare a genei
la un numar foarte mare de cazuri si de controale.
Studiile de asociere genomica; pentru demonstrarea unei asocieri
statistice este necesara depasirea pragului de 5% de variatie a
frecventei in cele doua populatii celulare comparate.
Pentru a permite evitarea erorii de asociere, a fost necesar studiului
comparativ a zeci de mii de probe. Posibilitatea maparii de mare
densitate, la nivel de polimorfism nucleotidic unic precum si a linkajului
dezechilibrat (linkage dezechilibrium) a permis identificarea de asocieri
semnificative.

UTILIZAREA GENOMICII IN CLASIFICAREA SI


STADIALIZAREA TUMORILOR MALIGNE
Identificarea unor mutatii, cum este cea de tip BRCA1 sau 2, permite
subclasificarea in tumori fenotipic diferite.
De exemplu, tumorile BRCA1 sunt in mod tipic carcinoame ductale de grad inalt de
malignitate, invazive, cu un triplu fenotip negativ:
Nu se coloreaza pentru ER (receptor estrogenic),
Nu se coloreaza pentru PR (receptor progesteronic), si
Si nu se coloreaza nici pentru HER2 (ERBB2) (Human Epidermal Growth Factor Receptor
2)
Aceste tumori se coloreaza pozitiv pentru un subset de keratine bazale exprimate in mod
normal in mioepiteliul normal al sanului.

In functie de profilului genomic al celulei maligne se pot face predictii adecvate


privind evolutia si prognosticul.
Inclusiv modul de selectie al tratamentelor s-a modificat prin contributia adusa de
analiza genomului malign.