Curs 8

Structura acizilor nucleici

In orice organism acizii nucleici constituie o sursa care codeaza informatia
biologica. Forma si activitatile diverselor celule sunt in mare masura determinate de
instructiunele genetice continute de ADN (sau ARN in unele virusuri). In conformitate cu
dogma centrala a biologiei moleculare, secventa de baze nucleotidice din ADN codeaza
secventa aminoacizilor din proteine. Multe proteine din celula sunt enzime care participa
in procesele metabolice. Alte proteine au rol participa in mentinerea si transmiterea
informatiei genetice.
Exista doua tipuri de acizi nucleici, ADNul si ARNul, care sunt purtatori ai
informatiei genetice si determina ca aceasta informatie sa fie disponibila pentru celula.
Structurile acestor molecule trebuie sa fie in concordanta cu urmatoarele aspecte:
1. informatia genetica trebuie pastrata intr-o forma stabila pentru o perioada
indelungata
2. Informatia genetica trebuie sa fie decodata inainte de a fi utilizata. Transcriptia
este procesul in care secventa nucleotidelor din ADN este copiata de ARN in asa
maniera incat sa determina sinteza proteinelor (translatie).
3. Informatia continuta de ADN si ARN trebuie sa fie accesibila atat proteinelor cat
si acizilor nucleici. Acesti agenti pot recunoaste (se pot lega de) acizii nucleici
astfel incat sa poata determina schimbari ale functiilor acestor molecule.
4. Progenitorii unui organism trebuie sa fie echipati cu acelasi set de instructiuni ca
ale parintelui. Astfel, ADNul este replicat (copiat) astfel incat celulele nou
formate sa primeasca aceeasi informatie genetica.
In general, este acceptat faptul ca pentru exercitarea functiei lor acizii nucleici necesita si
unele componente celulare.
Helixul-ADN
Perioada de dupa anii 1900 pana la cel de-al doilea Razboi Mondial a fost
considerata varsta de aur a geneticii. Cu toate acestea cercetatorii nu au reusit sa
determine faptul ca ADNul si nu proteinele constituie materialul ereditar. Oricum, in
aceasta perioada au fost facute multe descoperiri genetice si s-au facut corelatii intre
genetica si evolutie.
In 1869 F. Meischer a izolat ADNul din leucocite. Acesta a colectat puroiul (care
contine o cantitate apreciabila de leucocite) din bandajele de la spital, dupa care a
indepartat acest lichid de pe bandaje folosind o solutie de sare. Dupa adaugarea unei
solutii slab alcaline peste celulele albe a constat faptul ca nucleele precipita din solutie.
Meischer a observat ca aceasta substanta din nucleu, numita nucleina, are un continut
ridicat de fosfor.
ADNul s-a dovedit a fi unul din principalii componenti ai nucleului (Mendel si
Darwin au publicat descoperirea lor in acelasi timp). Deoarece s-a izolat din nucleu,
initial compusul (ADNul) a fost numit nucleina. Mai tarziu a fost denumit acid nucleic si
in ultima instanta acid deoxiribonucleic (ADN).

Principalele baze din acizii nucleici

In 1914 R. Feulgen a aratat faptul ca fuxina (colorant) poate lega ADNul. Acesta
proprietate a fost folosita pentru localizarea ADNului in nucleul celulelor eucariote. In
1920, P.A. Levene a analizat componentele moleculei de ADN. Studiile sale au dovedit
faptul ca ADNul contine 4 baze purinice/pirimidinice legate de o deoxiriboza si o grupare
fosfat.

Acest amsamblu
(baza+deoxiriboza+grupare fosfat)
formeaza formeaza nucleotidele,
monomeri care intra in constitutia
ADNului (polimer). De remarcat
este faptul ca nucleozidele au in
componenta numai baza si
deoxiriboza. Intr-o nucleotida baza
este atasata pin intermediul unei
legaturi N-glicozidice la atomul de
carbon 1 din deoxiriboza in timp ce
gruparea fosfat este grefata la atomul
de carbon din pozitia 5.
Nucleotidele sunt legate prin legaturi
fosfodiesterice: o gruparea fosfat se
leaga de doua zaharuri diferite prin
intermediul gruparilor hidroxil din
pozitia C3 de la unul dintre
carbohidrati si pozitia C5 de la
celalalt carbohidrat.
Desi Levene a propus corect
modul de legare a nucleotidelor, el a
avut o ipoteza gresita in ceea ce
priveste distributia nucleotidelor in
molecula de ADN, presupunand ca
nucleotidele se afla grupate in serii
de cate patru, care au aceeasi ordine
in lantul polinucleotidic.
Erwin Chargaff a izolat ADNul din diverse surse si a masurat ponderea fiecarei
baze (purinice sau pirimidinice). Din datele sale experimentale a reiesit faptul ca

ponderile adeninei si timinei (respectiv cele pentru guanina si citozina) sunt egale, insa
cele ale adeninei si guaninei sunt diferite. Asftel, s-a infirmat teoria lui Levene conform
careia tetranucleotida era unitatea structurala de baza a ADNului.
Dupa 1900 Garrod a propus o legatura intre gene si metabolismul existent la
nastere. Intrebarea care a survenit a fost: ce este o gena? Raspunsul a venit in 1920 cand
F. Griffith a studiat diferenta dintre doua tipuri de bacterii (una care cauzeaza pneumoniaS si alta care nu cauzeaza pneumonia-R). Tipul S de bacterie era incapsulat, pe cand tipul
R nu. Griffith a demonstrat (1928) ca un tip de bacterie nepatogenic poate deveni
patogenic prin intermediul unui factor de transformare. Cercetatorul a injectat diferite
tipuri de bacterie in soarece si a constatat faptul ca tipul S induce moarte, in timp ce tipul
R nu afecteaza organismul. Mai mult folosind tipul S al bacteriei care este distrus de
temperatura a observat faptul ca organismul a supravietuit. Combinarea ultimului tip de
bacterie (distrusa prin incalzire) cu tipul R (nepatogen) a indus aparitia pneumoniei,
respectiv a mortii. In 1944, O. Avery, C. MacLeod si M. McCarty au concluzionat ca
factor de transformare este de fapt ADNul. Dovada ca ADNul este materialul ereditar a
fost adusa de M. DelBruck si S. Luria. Acestia au analizat bacteriofagele, un tip de virus
(continand un invelis proteic care incapsuleaza ADNul) care ataca bacteriile E.Coli
(din intestinul gros).
In 1952, A. D. Hershey si M. Chase au demonstrat prin marcare cu radioizotopi a
bacteriofagelor (32P pentru ADN si 35S pentru proteina) faptul ca ADNul (care s-a regasit
in celula infectata) este purtatorul fizic al informatiei genetice (vezi cursul 9).
Structura ADNului
ADNul este un polimer care are doua lanturi de deoxinucleotide, molecule care
sunt legate prin legaturi fosfodiesterice. Cea mai cunoscuta forma a ADNului este aceea a
B-ADNului, care are trasaturile structurale a ADNului descris de J. Watson si F. Crick,
impreuna cu R. Franklin si colaboratorii sai:
1. Cele doua lanturi antiparalele sunt rotite spre dreapta in
jurul unei axe comune rezultand un dublu-helix al carui
diametru este de aproximativ 20 .
2. Planele formate de bazele nucleotidice, care
formeaza perechi de legaturi de hidrogen, sunt
aproximativ perpendiculare pe axa centrala a
helixului. In B-ADN, bazele ocupa miezul
helixului iar resturile de fosfozahar se regasesc in
afara acestuia, formand adancituri majore sau
minore. Numai portiuni mici din bazele perechi sunt
expuse spre exterior (solventului).
3. Fiecare pereche de baze are aproximativ aceeasi
inclinatie, ceea ce confera o simetrie moleculei de
ADN. Perechile de baze A-T si G-C pot fi
interschimbabile fara sa afecteze pozitia resturilor de
zahar din afara helixului. Guanina formeaza 3 legaturi
de hidrogen cu citozina, iar adenina 2 legaturi de
hidrogen cu timina. Alte perechi de baze perturba
semnificativ dublu helixul.

Interactiuni intre bazele nucleotidice

din lanturile ADNului

4. B-ADN helixul are 10 perechi de baze (engleza base pairs = bp) pentru o rotatie
completa si pasul de 34 .
Pentru a demonstra trasaturile structurale ale ADNului Watson si Crick s-au bazat
pe informatiile provenite din modul de difractie al razelor X de catre aceasta molecula.
Daca un fascicul de raze X este directionat spre un cristal, al unei substante, unele raze
sunt imprastiate sau reflectate in momentul in care intalnesc atomi. Razele X imprastiate
pot interfera intre ele si produc spoturi de diferite intensitati, care pot fi inregistrate sub
forma unei harti. Difractograma (harta rezultata) este asemenea unei semnaturi
caracteristica fiecarei molecule. R. Franklin si W. Maurice au obtinut difractogramele
specifice ADNului. Din aceste fotografii reiesea faptul ca molecula de ADN este
simetrica. Distributia sub forma literei X, din fotografie, este o dovada a structurii de
tip helix a ADNului. Intr-o difractograma de raze X cu cat spoturile sunt mai apropiate,
cu atat distanta este mai mare. Astfel barele orizontale corespund de fapt cu pasului
helixului. Distanta verticala dintre bare, 34 , este o masura a inaltimii pasului. Distanta
de la mijlocul difractogramei la partea de sus a acesteia, 3,4 , este echivalenta cu
distanta dintre doua baze suprapuse. Dat fiind faptul ca inaltimea pasului era de 34 iar
distanta dintre baze 3,4 cercetatorii ai dedus numarul de baze pe pas - 10 nucleotide.
Pasul helixului poate fi calculat din unghiul pe care X-ul il face cu axa orizontala.
Astfel, daca unghiul este mai mare pasul este mai mic, iar ADNul mai compact. Din
difractograma s-a dedus faptul ca ADN este un dublu-helix cu gruparile fosfat inafara, iar
bazele in interior.
Watson si Crick erau in concurenta cu Pauling in rezolvarea structurii
tridimensionale a ADNului. Ultimul, dupa ce a rezolvat structura -helixului din
proteine, incerca sa desluseasca si structura ADNului. Aproape in acelasi timp Pauling a
trimis o publicatie despre structura ADNului. Watson si Crick au verificat structura lui
Pauling cu ajutorul unui model cu bile si bete, structura care s-a dovedit a fi un tripluhelix. Distributia gruparilor fosfat era in centrul helixului, iar bazele in exteriorul
acestuia. Aceasta orientare a gruparilor fosfat in interiorul helixului era practic imposibila
datorita repulsiilor electrostatice dintre sarcinile negative, lucru care ar fi ingreunat
impachetarea moleculei.

Tipuri de ADN (A,B si Z)

Dublu-helixul poate avea cateva structuri distincte in functie de compozitia solventului si

secventa de baze. Cele mai cunoscute variante structurale ale ADNului sunt A-ADNul si
Z-ADNul.
Perechile de baze ale A-ADNului sunt inclinate in raport cu axa helixului
In conditii de deshidratare B-ADNul sufera schimbari conformationale reversibile
si este transformat in A-ADN a carui structura este mai plata si mai larga decat cea a
B-ADN-ului. A-ADNul are 11,6 bp pe rotatie si pasul de 34 . Diferenta majora dintre
B-ADN si A-ADN este aceea ca perechil de baze sunt inclinate cu un unghi de 20 in
raport cu axa helixului. A-ADNul are adancituri majore mai profunde.
Z-ADNul formeaza un helix orientat spre stanga
La 25 de ani de la descoperirea structurii ADNului, studiul structurii
deoxi(CGCGCG) de catre A. Wang si A. Rich a evidentiat o structura ADN a carei
orientare era spre stanga (Z-ADN). Acest tip de ADN are 12 bp pe rotatie si pasul de 44
, adancitura minora mai profunda, iar
adancitura majora se distinge mai
putin.
Difractia fibrelor si studiile RMN au
aratat ca polinucleotidele
complementare cu purinele si
pirimidinele afectate (de exemplu poli
d(GC)poli d(GC) sau poli d(AC)poli
d(GC)) adopta conformatia Z la
concetratie mare de sare. Stabilizarea
Z-ADNului de catre saruri se explica
prin faptul ca repulsiile dintre gruparile
fosfat vecine sunt mai atenuate in prezenta
Structura domeniului Z cu Z-ADNul
sarurilor. Rich a descoperit o familie de
De Rosa, M. et. al (2010), PNAS, 107, 9088-9092
domenii de proteine (Z) care
leaga Z-ADNul. Structura complexului a
aratat ca un domeniu Z leaga fiecare lant
din Z-ADN dublu-helix. Interactia dintre
proteina si Z-ADN se realizeaza prin
intermediul legaturilor de hidrogen si a
fortelor ionice dintre resturile polare si
lanturile laterale bazice din proteina cu
fosfat-zaharul ADNului.

5S-rARNul
(118 nucleotide)

Phe-tARNul
(77 nucleotide)

Tipuri de structuri ale ARNului

ARNul formeaza un A-helix

ARNul dublu-helix este materialul genetic
al unor virusuri, dar este sintetizat numai
sub forma unui singur lant. Acest lant
poate forma punti de hidrogen
intramoleculare formand un lant dublu,
respectiv bucle.

Segmente scurte din lantul dublu al ARNului sunt implicate in multiplicarea unor gene.
In mod uzual ARNul formeaza conformatii de tip A-ADN si are 11 bp pe rotatie si pasul
de 30,9 , iar perechile de baze sunt inclinate cu aproximativ 16,7 in raport cu axa
helixului.
Flexibilitatea conformationala a ADNului este limitata
Conformatia unei unitati de nucleotida indica prezenta a 6 unghiuri de torsiune
pentru partea de fosfo-zahar si un unghi de torsiune atribuit legaturii glicozidice. Rotatia
in jurul legaturii glicozidice este
impiedicata. Rezidurile purinice au doua
conformatii, sin si anti, ultima dintre acestea
fiind mai stabila. In marea majoritate a
acizilor nucleici, toate bazele adopta
conformatia anti. Numai in cazul ZADNului care au resturi de purina si
pirimidina a caror conformatie alterneaza
(anti, sin).
Conformatiile plic ale ribozei sunt
esentiale in acizii nucleici, determinand
orientarea relativa a substituientilor fosfat la
fiecare rest de riboza. In B-ADN
conformatia este C2-endo, pe cand in AADN conformatia este C3-endo. In schimb in Z-ADN nucleotidele purinice au toate
conformatia este 3-endo iar nucleotidele pirimidice au toate conformatia este 2-endo.
Proprietatile ADNului in solutie
Moleculele de ADN de diferite dimensiuni pot fi studiate prin metode fizicochimice:
Proprietatile acido-bazice
Gruparile fosfat din legaturile diesterice ale ADNului, care se repeta periodic in
fiecare nucleotida, au valori scazute ale pKa-ului si din acest motiv sunt ionizate la valori
ale pH > 4, fapt care confera ADNului un caracter acid. Gruparile fosfat sunt orientate
spre exteriorul dublu-helixului si pot fi interactiona cu moleculele de apa, ioni divalenti
(Ca2+, Mg2+) sau amine policationice (spermidina si spermina-sunt asociate cu moleculele
de ADN virale sau bacteriene). Stabilitatea legaturilor de hidrogen din perechile de baze
din ADN depinde de gradul de ionizare al gruparilor amino (pH 4-11).
Vascozitatea
Rigiditatea si lungimea apreciabila a ADNului confera acestei molecule
vascozitate mare. Masuratorile de vascozitate sunt folosite pentru a urmari gradul de
denaturare al ADNului si implicit gradul de impachetare al duplexului.
Coeficientul de sedimentare
Coeficientul de sedimentare si masa moleculara a tipurilor de ADN pot fi
determinate prin ultracentrifugare. Masa moleculara a ADNului poate fi determinata prin
compararea vitezei de sedimentare intr-un gradient de densitate de zaharoza cu o proba
de ADN cu dimensiuni si coeficient de sedimentare determinate in prealabil.
Sedimentarea la echilibru in gradient de CsCl este folosita pentru determinarea
densitatii de plutire a ADNului. Moleculele de ADN se concentreaza intr-o banda stabila

la nivelul care densitatea de plutire este egala cu densitatea CsCl din acea zona. ADNul
monocatenar are o densitate mai mare decat ADNul duplex, care la randul sau are in
general o densitate mai mare decat proteinele. ARNul poate fi diferentiat de ADN (mono
sau bicatenar) prin faptul ca primul are o densitate mai mare. Densitatea de plutire a
ADNului poate furniza informatii referitoare la ponderea perechilor G-C si A-T din
molecula. Mai mult, ADNurile virale intacte, omogene, prezinta benzi inguste, in timp ce
fragmetele heterogene de ADN din celulele eucariotelor apar sub forma unor benzi
(grupuri de benzi) mai largi.
Denaturarea si renaturarea
In cazul in care o solutie care contine duplex-ADNul este incalzita peste o
anumita temperatura, structura sa nativa este alterata rezultand separat cele doua lanturi
complementare care au conformatii aleatorii. Astfel procesul de denaturare este insotit de
schimbari calitative in cazul proprietatilor fizice ale ADNului (scaderea vascozitatii si
cresterea absorbantei in UV in cazul
formei denaturate). Denaturarea ADNului
este un fenomen cooperativ in care
alterarile dintr-o parte a moleculei
destabilizeaza celelalte legaturi (dintre
cele doua lanturi ramase). Aceasta
denaturare are loc intr-un interval ingust
de temperatura. Mijlocul acestui interval
poarta numele de temperatura de topire,
Tm (m = eng. melting-topire). Stabilitatea
duplex-ADNului (ilustrata de Tm) depinde
de o serie de factori: natura solventului,
taria ionica, continutul de perechi G-C
(care contin o legatura de hidrogen
suplimentara in comparatie cu perechea
A-T) sau de pH.
Denaturarea ADNului

In 1960 J. Marmur a aratat ca ADNul denaturat poate fi renaturat (sa revina la starea
initiala) in conditiile in care temperatura este mentinuta cu 25 mai jos decat Tm.
Baze perechi
Imperecherea bazelor este asemeni unui relipiri a celor doua lanturi din acizii
nucleici. In cazul Watson-Crick aceste perechi se formeaza intre oligonucleotide
complementare. Exista insa si situatii diferite. De exemplu perechea de baze A-T poate
avea atomul de azot din pozitia 7 (pereche Hoogsteen) drept acceptor si nu cel din pozitia
1 care corespunde situatiei clasice (modelului Watson-Crick). Oricum, masuratorile
experimentale au aratat ca numai perechile de baze Watson-Crick au o stabilitate mai
mare decat celelalte perechi. Exista si situatii diferite in care segmentele de dublu-helix
din multe ARNuri contin baze perechi G-U care au rol in stabilizarea structurii tertiare a
acestora.

Interactii van der Waals

Purinele si pirimidinele din interiorul dublu helixului au tendinta de a se orienta
intr-o maniera paralela prin intermediul interactiunilor de tip van der Waals (interactiuni
electronice de tip -) sau hidrofobe. Aceste interactiuni contribuie in mod esential la
stabilizarea structurii ADNului.
Interactii ionice
Interactiile electrostatice care au loc intre gruparile fosfat trebuie considerate,
alaturi de legaturile de hidrogen si interactiile hidrofobe din acizii nucleici, factori care
contribuie la stabilitatea structurii acizilor nucleici. De exemplu Tm a duplex-ADNului
creste daca concentratia ionilor de Na+ este marita. Acest fapt se datoreaza intercalarii
acestor ioni intre gruparile fosfat. Analog ionii divalenti, Mg2+, Mn2+ si Co2+ se leaga
specific de gruparile fosfat si astfel constituie agenti de protectie a acizilor nucleici. Ionii
de Mg2+ joaca de asemenea un rol esential in stabilizarea structurilor complexe adoptate
de diverse molecule de ARN.