Diagnosticul de laborator al TBC

43

Capitolul 4
Diagnosticul de laborator al tuberculozei
4.1. Recoltarea produselor patologice
4.1.1. Principii generale
Recoltarea se va face naintea administrrii oricrui antituberculos sau dup o
ntrerupere de minimum 3 zile.
Recoltarea se va face sub supravegherea unui cadru mediu instruit, n camere
special amenajate.
Produsele vor fi recoltate n recipiente speciale, de preferat de unic utilizare,
transportate i nchise ermetic.
Produsele vor fi trimise ct mai rapid la laborator. Dac transportul este
temporizat, produsele vor fi pstrate n frigerator.
4.1.2. Produsele patologice utilizate pentru examenul bacteriologic
Tuberculoza poate avea multiple localizri, de aceea i produsele patologice
folosite pentru diagnostic sunt multiple.
4.1.2.1. Tuberculoza pulmonar
Sputa expectorat spontan - bolnavul trebuie instruit astfel nct ceea ce se
recolteaz s fie realul produs patologic i nu saliv sau secreii rinofaringiene.
Pentru creterea ratei de izolare de la fiecare bolnav se vor recolta trei probe de
sput n dou zile consecutive dup cum urmeaz: o prim prob la prima
prezentare a pacientului la medic, proba care se recolteaz sub supraveghere; a
doua prob va fi recoltat a doua zi dimineaa, de pacientul deja instruit, iar a
treia prob va fi recoltat tot a doua zi cnd pacientul revine la pneumolog;
Spltura bronic uneori bolnavul nu expectoreaz spontan, n aceast situaie,
expectoraia este provocat prin introducerea a aproximativ 10 ml soluie salin
steril n orificiul glotic, ceea ce provoac tusea i expectoraia;
Aerosolizarea cu soluie salin hiperton este de asemenea o metod de provocare
a tusei;
Aspiratul traheobronic recoltat prin bronhoscop sau fibroscop;
Spltura gastric se practic la pacienii care obinuiesc s nghit sputa (sugari i
copii mici);
Lichidul pleural;
Piese biopsice;
Piese operatorii.
4.1.2.2. Tuberculoza extrapulmonar
Produsele patologice se aleg n funcie de localizarea bolii. Pot fi lichide
(urina, LCR, lichid de ascit, snge menstrual, etc) sau fragmente de esut.

Diagnosticul de laborator al TBC

44

4.2.Transportul
Acesta trebuie s fie prompt i asigurat n condiii de securitate
microbiologic.

4.3. Prelucrarea
4.3.1. Examenul microscopic. Presupune efectuarea de frotiuri, care vor fi
colorate cu coloraii difereniale ce evideniaz bacilii acido-alcoolo rezisteni
(BAAR). Detaliem n continuare etapele efecturii unui frotiu din sput:
examen macroscopic al produsului. Se repereaz un flocon mucopurulent,
care se prelev cu ansa i se depune pe o lam de microscop curat,
neutilizat i bine degresat;
etalarea. Cu ansa se etaleaz produsul patologic n strat subire i ct mai
uniform. Frotiul obinut trebuie s aib o lungime de 2 cm i o lime de 1
cm i trebuie s fie amplasat n mijlocul lamei, astfel nct riscul de
contaminare a persoanei care l manipuleaz s fie minimalizat pe ct
posibil;
uscarea. Se poate face la temperatura camerei sau mai bine, pe o platin
nclzitoare.
Apoi frotiul este colorat. Coloraiile care pun n eviden micobacteriile sunt
coloraii difereniale, care se bazeaz pe acido-alcoolo rezistena acestor microorganisme.
Acido-alcoolo rezistena este o caracteristic tinctorial i nseamn
nedecolorarea micobacteriilor cnd sunt tratate cu mixturi de acizi minerali i alcooli.
Aceast caracteristic nu are legatur cu viabilitatea micobacteriilor n mediul acid.
Pentru evidenierea micobacteriilor se folosesc n principal dou coloraii:
Ziehl Neelsen i coloraia cu fluorocromi auramin-rodamin. Expunem n continuare
timpii coloraiei Ziehl Neelsen ca fiind tehnica standard:
se acoper complet lama cu fucsina Ziehl turnat prin plnie cu hrtie de
filtru (pentru cca 10 min);
se nclzete lama trecnd pe sub frotiu flacra unui bec Bunsen sau a unei
lampi cu spirt pn la emitere de vapori; colorantul nu trebuie s fiarb i
nici s se usuce; operaiunea se repet de doua ori;
se vars fucsina i se spal frotiul sub jet slab de ap;
decolorarea: se acoper lama cu amestec alcool-acid timp de 3 min dup
care se spal i se scurge excesul de lichid;
recolorarea: se acoper lama cu soluie de albastru de metilen timp de 1
min; se spal bine lama sub jet de ap i apoi se usuc.
Frotiurile colorate Ziehl Neelsen vor fi examinate la microscopul optic, iar
cele colorate cu auramin- rodamin la microscopul cu lumina ultraviolet.
Examinarea presupune parcurgerea a 100 cmpuri microscopice cu imersia la
coloraie Ziehl Neelsen i a 30 cmpuri cu obiectiv uscat (40x) pentru coloraia

Diagnosticul de laborator al TBC

45

fluorescent. Lamele pozitive n fluorescen se recoloreaz Ziehl Neelsen pentru

confirmare, dat fiind specificitatea mai scazut a examenului n U.V.
Examenul microscopic este semicantitativ. Exist mai multe scale de apreciere
a concentraiei bacteriene. Cea utilizat n serviciul nostru este cea elaborat de
Organizatia Mondiala a Sntii i care este descris n continuare:
Tabel 4.1.
Numr BAAR/ cmp microscopic
Rezultat
0 BAAR/100 cmpuri
Negativ
1- 3 BAAR/100 cmpuri
Negativ - se repet
4- 9 BAAR/100 cmpuri
Se comunic numrul exact de BAAR
10- 99 BAAR/100 cmpuri
1+
1- 9 BAAR/cmp
2+
> 10 BAAR/cmp
3+
Examenul microscopic are urmtoarele avantaje:
este cel mai rapid mijloc de diagnostic al tuberculozei;
difereniaz bolnavii intens contagioi de cei mai puin contagioi;
reprezint un mijloc eficient de verificare a succesului antibioterapiei.
Examenul microscopic are i dezavantaje:
sensibilitate mediocr (doar aprox. 50% dintre bolnavii cu tuberculoz
sunt microscopic pozitivi);
nu ofer indicaii despre specia de micobacterii vizualizate;
nu ofer indicaii despre sensibilitatea la antituberculoase.
De aceea diagnosticul tuberculozei este continuat prin cultivare.
4.3.2. Cultivarea
Prin prisma cultivrii, produsele patologice se mpart n dou categorii, n
funcie de condiia lor microbiologic. O prim categorie este aceea a produselor care
vin din zone normal sterile. Acestea nu necesit decontaminare naintea nsmnrii.
A doua categorie este constituit din probe care provin din zone normal colonizate sau
care se contamineaz pe traiectul de eliminare (ex: sputa spontan sau provocat,
aspiratul traheo-bronic, spltura gastric, etc). Aceste produse trebuie decontaminate
naintea cultivrii pentru eliminarea aa numitei florei de asociaie, constituit din
bacterii cu cretere rapid. Decontaminarea este chimic i se bazeaz pe relativa
rezisten a micobacteriilor la alcali. Metoda de decontaminare cea mai utilizat const
n tratarea probei timp de 15 - 20 min cu NaOH 4%. Dup acest interval amestecul
obinut este adus la neutralitate cu HCl 8% n prezena albastrului de bromtimol ca
indicator de pH. Dup neutralizare, amestecul este centrifugat pentru concentrare i
din sediment se face nsmnarea pe medii de cultur. Fiecare produs patologic
trebuie cultivat pe cel puin un mediu solid i un mediu lichid. Mediul solid cel mai
frecvent utilizat este mediul Lwenstein Jensen. Mediile lichide, la ora actual, sunt
utilizate n sisteme automate de cultivare a micobacteriilor (ex.: BACTEC, MB/BacT,
MGIT, etc.). Mediile lichide au o rat mai mare de pozitivitate i un timp mai scurt de
pozitivare, n schimb mediile solide se suprainfecteaz mai rar.

Diagnosticul de laborator al TBC

46

Incubarea se face la 37oC timp de 60 zile pentru mediile solide i 42 zile

pentru mediile lichide. Mediile solide sunt verificate sptmnal pentru detectarea
creterii bacteriene. n sistemele automate culturile pozitive sunt anunate de sistem.
Urmtoarele etape n diagnosticul tuberculozei sunt identificarea i testarea
sensibilitii la antibiotice.
4.3.3. Identificarea
Identificarea micobacteriilor se bazeaz pe caractere microscopice (dispoziie
n corzi), de cultura (temperatura i viteza optim de cretere, aspectul colonilor,
pigmen-togeneza), biochimice (producerea de catalaz i termorezistena acesteia,
producerea de niacin sau rezistena la hidrazida acidului tiofen -2- carboxilic).
Pe mediul Lwenstein Jensen Mycobacterium tuberculosis crete lent i
eugonic, coloniile sunt de tip R (rugoase, uscate, conopidiforme), greu emulsionabile
i nepigmentate. M. africanum are o cretere disgonic, iar coloniile sunt plate, rugoase.
M. bovis creste disgonic, coloniile sunt S, mici, rotunde, emulsionabile.
4.3.4. Testarea sensibilitii la antituberculoase
Exist trei metode diferite de testare a sensibilitii la antituberculoase: metoda
proporiilor (cea mai exact, dar laborioas i costisitoare), metoda concentraiilor
absolute i metoda rapoartelor de rezisten. Metoda utilizat n Romnia este metoda
concentraiei absolute. Principiul acesteia este urmtorul: un inoculum standardizat este
cultivat simultan pe mediu fr antituberculoase (tuburi martor) i pe tuburi cu mediu n
care sunt incluse antituberculoase n anumite concentraii (tuburi test). Citirea const n
compararea intensitii creterii bacteriene pe tuburile martor cu cele test. Dac pe
tuburile test creterea este absent tulpina este considerat sensibil, dac pe tuburile
test exist cretere, dar de intensitate mai mic dect pe tubul martor, tulpina este
parial rezistent; dac pe cele dou categorii de tuburi creterea are aceeai intensitate,
tulpina este rezistent.
4.3.5. Metode noi de diagnostic de laborator n tuberculoz
Diagnosticul de laborator n tuberculoz este grevat de necesitatea cultivrii
agenilor etiologici care au un timp de generaie lung. De aceea, pentru laboratoarele
care folosesc doar medii solide, culturile pozitive se obin, n medie, n 34 zile la care
se mai adaug trei sptmni pentru antibiogram.
Metodele noi, noncultivative, de diagnostic pentru infeciile micobacteriene
sunt desemnate s detecteze i s identifice micobacteriile direct n proba clinic,
evitnd astfel pierderea de timp.
n general aceste teste folosesc fie o metod foarte sensibil pentru a detecta
anumite componente micobacteriene, fie o metod prin care o component bacterian
este amplificat pn la un nivel detectabil.
4.3.5.1. Detectarea componentelor micobacteriene
Acidul tuberculostearic (acid gras saturat) este un component al peretelui
celular al unor bacterii clasificate n ordinul Actinomycetales, printre care i cele din
genul Mycobacterium. Acidul tuberculostearic poate fi detectat prin cromatografie
gaz-lichid. Metoda este folosit pentru diagnosticul rapid al meningitei tuberculoase,

Diagnosticul de laborator al TBC

47

pentru c dintre agenii etiologici posibili doar M. tuberculosis conine acid

tuberculostearic.
Hidroliza anumitor esteri micolai ai micobacteriilor produce 2- eicosanol (un
alcool cu lan lung) care poate fi detectat prin gaz- cromatografie- spectrometrie de
mas.
4.3.5.2. Metode de amplificare
Utilizarea acestora n laboratorul de microbiologie are cteva scopuri:
1.creterea sensibilitii metodei;
2. automatizarea metodelor de microbiologie molecular i
3. Excluderea moleculelor radioactive din sistemele de detecie.
Exist trei sisteme de amplificare: amplificarea intei (materialul genetic care
trebuie detectat), amplificarea sondei (caten de acid nucleic complementar intei) i
amplificarea semnalului (modalitatea prin care este relevat reacia pozitiv).
Metodele de amplificare ale inei utilizate n diagnosticul tuberculozei sunt:
polymerase chain reaction (PCR), self sustaining sequence replication (3SR) i stand
displacement amplification (SDA).
In PCR principiul este urmtorul: 2 fragmente mici, monocatenare de DNA,
numite primeri se vor alinia segmentului care trebuie amplificat (inta). Primerii, care
sunt molecule sintetizate, sunt complementari secvenelor care flancheaz inta.
Primerii iniiaz amplificarea care decurge n cicluri alternative de amplificare i
denaturare a DNA- ului nou format, fiecare ciclu dublnd numrul de segmente. Un
ciclu ncepe cnd temperatura crescut desface catena dubl de DNA. Primerii pot
acum hibridiza cu secvenele lor complementare pe fiecare caten a materialului
nucleic iniial. O DNA- polimeraz termostabil (Taq polimeraza) reface helixul dublu
catenar, alipind baze nucleotidice la primer. Cnd polimeraza ajunge la captul catenei
originale, secvena int este refcut. Alt aplicare a cldurii ncepe un nou ciclu prin
denaurarea DNA- ului nou format.
3SR utilizeaz activitile selective a trei enzime: o reverstranscriptaz, o
RNA- z i o RNA- polimeraz DNA- dependent) pentru a amplifica o int. De fapt,
este o reacie repetat n doi cicli n care se obine un cDNA pornind de la o int in
intermediul reverstranscriptazei, urmnd transcripia acestuia n multiple copii RNA
prin intermediul polimerazei. ntre cele dou etape, exist o faz intermediar care are
ca rezultat formarea unui hibrid RNA- DNA. RNA- ul din acest hibrid este distrus de
RNA-z.
SDA este o procedur izotermal de amplificare a DNA-ului care utilizeaz
primeri specifici, o DNA polimeraz i o endonucleaz de restricie.
Amplificarea sondei survine n cazul reaciilor Q replicase i ligase chain
reaction (LCR). Q replicase se bazeaz pe incorporarea unei sonde monocatenare,
oligonucleoidic ntr-o molecul de RNA care dup hibridarea cu inta poate fi
amplificat exponenial datorit enzimei Q replicase.
LCR se bazeaz pe capacitatea intei de a direciona legarea covalent a dou
oligonucleotide de ctre DNA ligaz. Odat legate, prima pereche de nucleotide poate
servi ca matri pentru a amorsa legarea a noi nucleotide complementare.

Diagnosticul de laborator al TBC

48

Specificitatea metodei const n specificitatea hibridizrii oligonucleotidelor la DNAul int.

Principiul metodei branched DNA (bDNA) este amplificarea semnalului.
Acest sistem utilizeaz o etap specific de capturare a intei care conduce la izolarea
secvenei de acid nucleic, urmat de hibridizarea cu o sond nemarcat. O regiune a
acestei sonde este complementar secvenei int i alta este capabil s hibridizeze cu
multimerul bDNA. Multimerul, cheia amplificrii este o macromolecul sintetizat
chimic, cu o structur asemntoare unui pieptene. Aceast molecul are capacitatea
de a hibrida cu o mulime de sonde marcate, ceea ce conduce la un semnal foarte
puternic.