Real-time PCR folosind tehnica SYBR Green

1. Introducere
Real-time PCR a devenit o procedur bine stabilit pentru cuantificarea
nivelelor expresiei genice, precum i a cuantificrii rearanjamentelor genice,
amplificrilor, deleiilor, sau a mutaiilor punctiforme. Puterea sa rezid n
capacitatea de a detecta cantitatea de produs PCR (amplicon) la fiecare ciclu
PCR, folosind fluorescena. Mai multe metode au fost folosite pentru
detectarea produilor PCR. Cele mai populare metode sunt bazate pe legarea
specific a hidrolizei probelor hibridizate de secvena vizat (de interes). O
alt abordare folosete colorani fluoresceni, care se leag la de produsul
PCR dublu-catenar n mod nespecific. Dei ambele analize sunt rapide i
sensibile, principiile de detecie i optimizare sunt diferite, precum este i
costul pentru fiecare analiz.
2. Chimia SYBR Green
SYBR Green este un colorant fluorescent care se leag doar la molecula de ADN
bicatenar. Fluorescena este emis proporional cu cantitatea de ADN bicatenar.
ntr-o reacie PCR, cantitatea iniial de ADN sau ADN complementar este minimal
i de aceea singurul ADN bicatenar prezent n cantiti suficiente pentru a fi
detectat este produsul PCR n sine.
n ceea ce privete mecanismul real-time PCR, citirile sunt date dup numrul de
cicluri PCR (Ct) necesare obinerii unui nivel de fluorescen dat. n timpul ciclurilor
PCR iniiale, semnalul fluorescenei emis de SYBR Green I legat la produii PCR este
de obicei prea mic pentru a fi nregistrat fa de semnalul de fundal. n timpul fazei
exponeniale, fluorescena se dubleaz la fiecare ciclu. O dublare precis a
fluorescenei la fiecare ciclu este un indicator important pentru o analiz optimizat.
Dup