UNIVERSITATEA ACADEMIEI DE STIINTE A

REPUBLICII MOLDOVA
CATEDRA DE BIOLOGIE

Referat

TEMA: Mecanismele

moleculare ale apoptozei

Autor:Biria Cristina

Chisinau 2015
1

Cuprins:
1Introducere-----------------------------------------------2
2Mecanismele moleculare ale apoptozei.-------------3
3 Fazele procesului
apoptotic-------------------------------7
4 Morfologia apoptozei-----------------------------------9
5 Genetica apoptozei-------------------------------------12
6 Biochimia apoptozei-----------------------------------13
7 Embriogeneza------------------------------------------19
8 Reglarea mitocondriala-------------------------------20
9 Apoptoza versus
necroza--------------------------------21
10 Recunoasterea si inlaturarea celulelor apoptotice 24
11 Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia
cancerului -------------------------------------------------27
12 Bibliografie --------------------------------------------33

Introducere
Apoptoza (din limba greac: , apo = departe i ptosis = cdere, termen referitor la
"cderea frunzelor" toamna) este o form a morii celulare programate, proces prin care
celulele declaneaz propria lor auto-distrugere ca rspuns la un anumit semnal. Apoptoza este o
moarte celular fiziologic, programat genetic, necesar pentru supravieuirea organismelor
pluricelulare, n echlibru constant cu proliferarea celular. Termenul a fost propus n 1972 ntr-un
articol publicat n British Journal of Cancer de ctre John F. Kerr de la Universitatea
din Queensland (Australia) mpreun cu Andrew H. Wyllie i Alastair R. Currie de la
Universitatea din Aberdeen (Scoia), ca rezultat al observaiilor lor fcute n cursul studiilor
efectuate asupra esuturilor cu microscopul electronic. Fenomenul fusese deja remarcat
n 1842 de cercettorul german Carl Vogt; o descriere mai amnunit aparine anatomistului
englez Walther Flemming (1885).Hippocrate din Cos (460 - 377 .Chr.) folosise deja termenul
de apoptosis pentru a descrie "cderea oaselor" n procesul de descompunere a esuturilor dup
moarte.
Apoptoza se deosebete de alte forme de moarte celular programat, prin faptul c este
caracterizat de prezena unui grup de enzime cu activitate proteolitic, aa numitele caspaze,
care joac un rol primordial n procesul de auto-distrugere. Acest proces poate fi provocat din
exteriorul celulei (de ex. prin factori imunitari), sau din interior, n urma unei modificri a
informaiei genetice.
Cercetrile asupra apoptozei au cptat o amploare spectacular n ultimii douzeci de ani. n
afara importanei sale ca fenomen biologic, o desfurare defectuoas a apoptozei are o
semnificaie deosebit n patogeneza multor maladii. O activitate apoptozic excesiv poate
cauza pierderi celulare, ca n unele boli neurodegenerative (de ex. boala Parkinson), n timp ce o
apoptoz insuficient poate implica o proliferare celular necontrolat, mecanism ce st la
baza neoplasmelor(cancere)
Modelul mortii celulelor - pe calea apoptozica sau a necrotica - e dependenta si de
concentratiile intracelulare de NAD+ si ATP. Micsorarea nivelului de NAD+ si ATP induce
necroza celulara (F.Oliver si al., 1999, P.Nicotera si al., 1997).
Intr-un organism sanatos moartea programata celulara (MPC) este un mecanism de
3

mentinerea homeostaziei. Atat hipofunctia, at si hiperfunctia apoptozei are in consecinta

dereglari de homeostazie. Se considera actualmente, ca MPC este o etapa naturala de
activitate a celulelor animale

Mecanismele moleculare ale apoptozei.

Apoptoza este un proces multifazic. Prima faza consta in primirea semnalului, aparitia unei
informatii, transmisa in celula din exteriorul ei sau generata in compartimentele ei. Semnalul
este fixat de receptor si supus analizei. Apoi semnalul este consecutiv transmis de mesagerii, de
diferit rang, pana la nucleu, unde si are loc includerea programei sinuciderii celulare prin
activarea genelor letale sau represia celor antiletale. Realizarea MPC in sistemele nucleare,
confirma ca prezenta nucleului nu este un component obligatoriu pentru efectuarea acestui
proces.
Referitor la celulele animale si ale omului, apoptoza in majoritatea cazurilor este
dependenta de activatia proteolitica a cascadei de caspaze - o familie de proteaze cisteinice,
evolutiv conservative, care specific scindeaza proteinele dupa resturile de acid aspartic. In
corespundere cu omologia structurala caspazele se deriva in subfamilii:
a) caspazele 1 (1,4,5),
b) caspazele 2 (2 si c) caspazele 3 (3, 6-10) (V.Kidd, 1999). E stabilit, ca apoptoza poate
parcurge si fara aceste enzime: superproducerea proteinelor- promotori ai apoptozei Bax si Bak
induc MPC in prezenta inhibitorilor caspazelor.
In rezultatul actiunii caspazelor are loc:
activarea procaspazelor, cu formarea caspazelor;
scindarea proteinelor antiapoptozice din familia Bcl-2.
hidroliza proteinelor laminelor, ce stabilizeaza membrana nucleara, cu condensarea
cromatinei;
distrugerea proteinelor, participante la reglarea functiei citoscheletului;
inactivarea si dereglarea reglarii proteinelor ce iau parte in reperarea DNA, splaisigului
mRNA, replicarii DNA. Tinta caspazelor este poli (ADP-ribozo) polimeraza (PARP).
Aceasta enzima participa la repararea DNA, catalizand poli (ADP-ribozilare) proteinele,
legate de DNA. ( A. si al., 1996, Oliver F. si al., 1999).
Exista cateva cai de realizare a MPC ( A si al. 1996, Raff M. 1998, Kumar S si
al. 1999, Aravind L. si altii 1999):
1. Calea determinata de inductorii fiziologici, actiunea carora se realizeaza prin recep- torii
4

celulari, ce au functia de a include mecanismele programei apoptozei. Schematic ar putea fi

in felul urmator: inductor > receptor > adaptori > caspazele initiale > reglatori > caspazele
finale. Receptorul (Fas) interactioneaza cu ligandul (FasL) (proteina transmem- branara a TKiler), se activeaza si include PMC infectata de virus (desen 1).

. Apoptoza celulei tinta dependenta de Fas-receptor sub actiunea T-limfocitelor (T-kiler)

Astfel, la interactiunea cu FasL pe suprafata limfocitelor -T sau a anticorpului la Fasreceptor mor beta-limfocitele, producatoare de anticorpi ce duc Fas-receptor, care nu sunt
necesare organismului insanatosit.
FasL ligandul e componentul familiei factorilor necrotici ai tumorilor (TNF) - o familie
numeroasa de liganzi homotrimeri. Fas - prezinta proteine transmembranare, care cu locusurile
extracelulare interactioneaza cu trimerii liganzilor. Interactiunea receptor-ligand duce la
formarea clasterelor receptorici cu fixarea locusurilor intracelulare de adap- tori. Ultimii,
fixandu-se pe receptori, intra in actiune cu efectorii - cu caspazele initiale, deocamdata neactive.
Interactiunea descrisa se realizeaza prin proteine omofile interac- tiune proteica a domeniilor
mici: DD (death domain - domeniul mortii), DED (death efec- tor domain - domeniul efectorului
mortii), CARD (caspase activation and recruitment do- main - domeniul activarii si recrutarii
(inhibitiei) caspazei). Toate au structura asemanatoa- re, contin sase alfa-catene. Mai bine e
studiata procaspaza 8. Agregatul FasL - Fas - FADD (Fas - associated DD-protein) - procaspaza
5

8 se activeaza, purtand denumirea de apoptoso- ma (Green D.S., 1998) sau semnal-complex, ce

induce moartea (disc- death-inducing sig- naling complex) (Peter H.si al, 1997)), sau ciaperonine
apoptozice (Hengartner M., 1998).
Procaspazele poseda o activitate proteolitica joasa (1-2%) fiind in forma monomerica,
concentratia lor in celula e mica. Se considera ca apropierea spatiala la agregarea lor duce la
formarea caspazelor active prin auto- sau transscindare. In rezultat, de la procaspaza (masa
moleculara = 30-50 kDa) se detasaza domeniul N-reglator, iar restul moleculei diso- ciaza in 2
subunitati: mare (20 kDa) si mica (aproximativ 10 kDa)
In continuare are loc asocierea lor in tetramer cu 2 centre catalitice independente, ce apare
in citozolul celulei. Sunt descrise si alte cai de activare a caspazei 8.
La faza activarii caspazelor initiale viata celulei poate fi pastrata. Sunt descrisi regla- torii,
care blocheaza sau accelereaza efectul destructiv al caspazelor initiale.

. Activarea procaspazelor prin scindare proteolitica in subunitati cu asocierea lor ulterioara.

Caspaza 8 activeaza caspaza finala (caspaza efector): prin proteoliza se genereaza caspaza 3,
dupa ce procesul MPC devine ireversibil

. Interactiunea functionala intre caspazele initiale si efectoare (finale) subfamiliei caspazei 3.

Caspaza 2 are doua forme, una (ICH-IL) initiaza si alta (ICH-IS) inhiba apoptoza.
Substratele intra- celulare nu sunt redate. Caspaza 3 se poate autoactiva, activand alte caspaze si
DFF, ce duc la liza ireversibila a DNA in fragmente nucleozomale.
2. In celulele, supuse actiunii inductorului apoptozei, brusc se micsoreaza potentialul
membranar, ce duce la majorarea permeabilitatii membranei interne mitocondriale, ca
consecinta la formarea porilor. (Bernardi P si al. 1998). Deschiderea porilor e determinata de
micsorarea cantitatii de glutation redus, NAD(P)H, ATP, ADP.
Recent se confirma ca un rol-cheie in apoptoza il poseda mitocondriile. Unul din
simptomele cele mai timpurii ale apoptozei e depolarizarea membranei interne mitoconcondriale. Atit apoptoza, cit si depolarizarea membranei mitocondriale se protejeaza prin
utilizarea inhibitorilor, ce blocheaza formarea de pori in membrana interna.
O analiza minutioasa confirma prezenta unei legi fundamentale, ce are o arie de rasraspindire majora in lumea animala. Si, in final, se presupune, ca diferite cauze pot provoca
apoptoza, insa numai un singur mecanism permite celulei sa-si realizeze ultimatumul mor- tal.
7

Care-i cauza ca celula a ales anume acest mecanism foarte compus de realizare a apop- tozei?
In 1994 s-a expus ipoteza ca celula aeroba poseda un sistem esalonat de aparare la
formarea superoxidului - O.-2. Acest sistem functioneaza in ansamblu cu mecanismele antioxidante, ce neutralizeaza superoxidul format sau produsele transformarilor ulterioare.
In celulele fara DNA mitocondrial (p) apoptoza poate fi provocata de factorul necro- tic
cancerigen (TNF), dar nu de antimicina A. In celulele martor (p+), ce poseda mitocon- drii cu
DNA, ambele substante induc apoptoza. Se confirma ca natura semnalelor primare ce provoaca
apoptoza e diferita. TNF e un semnal exterior de autodistrugere, caruia celula se supune.
Antimicina A este un inhibitor specific absolut, care blocheaza transportul e- intre hemul bh si
citocroma b .
Dintre proteinele mitocondriale, ca factori apoptogeni sunt si: citocrom c, procaspazele 2, 3,
9; proteina AIF (apoptosis inducing factor), ce prezinta o flavoproteina cu masa mole- culara de
57 kDa.
Citocrom c impreuna cu factorul citoplasmatic APAF-1 (apoptosis protease activating factor
-1) ia parte la activarea caspazei 9. APAF -1 joaca rolul de schelet, unde are loc procesingul
autocatalitic al caspazei 9. Modificarile conformationale, dependente de ATP duc la fixarea
cit.C (desen 4), cu aparitia a noi conformatii. Oligomerizarea duce la deschiderea CAKD
pentru procaspaza 9 cu domeniul identic. In final se formeaza o apoptosoma cu masa
moleculara aproximativ 1,3 mln daltoni, ce contine minimum 8 subunitati APAF-1.
Apropierea conformationala a moleculelor de procaspaze 9 pe fundamentul multimeric
APAF-1-cit.C duce la activarea caspazei 9. Caspaza 9 scindeaza si activeaza procaspaza 3.
Flavoproteina AIF provoaca in celulele HeLa condensatia cromatinei si fragmentarea
DNA, iar adaosul la mitocondriile ficatului de sobolan - eliberarea cit.C si a caspazei 9.
Efectele descrise nu sunt inhibate

de inhibitorul caspazelor - L-VADfmk, care

preintampina apoptoza, indusa de cit.C. AIF - este un efector mitocondrial al MPC ce activeaza
indiferent de caspaze.

. Model de formare a apoptosomei si activarea procaspazei 9.

Fazele procesului apoptotic

Controlul general al numarului de celule ce se efectueaza prin intermediul ciclului celular
este compus dintr-un sistem multicompartimentat in interiorul caruia celula are cel putin 3
optiuni posibile
Celula poate fi:
1) metabolic activa dar nu desfasoara nici procesul de proliferare si nici cel de apoptoza
(celula aflata in faza G0);
2) in curs de desfasurare a procesului de proliferare (G0G1SG2mitoza)
3) pe punctul de a desfasura procesul de moarte celulara fie pe calea programata
(G0D1FD2fragmentare celulara apoptotica), fie pe calea neprogramata
(necroza) (figura 2).

Schema desfasurarii ciclului celular care arata optiunile unei celule aflate in faza G 0. D1
defineste perioada pe parcursul careia se activeaza noi gene a caror expresie proteica este
ceruta pentru inducerea fragmentarii ADN (faza F). D2 defineste perioada insasi celula se
fragmenteaza in corpi apoptotici.

Celulele pot fi induse sa intre pe calea mortii celulare programate din orice faza a ciclului
celular de proliferare (G1, S sau G2). Semnalele locale sau sistemice ale factorilor de crestere ce
regleaza progresia in interiorul ciclului celular sunt specifice tipului celular si sunt independent
determinate ca parte a fenotipului de diferentiere a celulei in cauza. Astfel, acelasi factor de
crestere (ex: factorul transformant de crestere 1) poate avea efecte agoniste sau antagoniste in
cadrul ciclului celular al diferitelor tipuri de celule (ex: inductor al proliferarii celulare in celulele
mezemhimale sau inductor al arestului in G 0 sau progresia prin fazele apoptozei pentru celulele
epiteliale).
Procesul apoptotic poate fi impartit in trei etape distincte:
- angajarea, in care celula care a primit un stimul apoptotic letal devine ireversibil
angajata pe calea mortii;
- executarea, pe parcursul careia apar majoritatea modificarilor structurale;
- clearance-ul, in cadrul caruia resturile celulare sunt indepartate prin fagocitoza.

10

Modificarile structurale ce apar pe parcursul fazei executorii au fost descrise pentru prima
data de Kerr si colaboratorii (2), iar acum sunt din ce in ce mai bine intelese din punct de vedere
al mecanismului.

Morfologia apoptozei

Pe parcursul fazei de executie, apar modificari morfologice si biochimice coordonate in

interiorul nucleului, citoplasmei, organitelor si membranei plasmatice. Modificarile morfologice
care se observa cel mai usor sunt cele care apar in interiorul nucleului. Cromatina condenseaza si
formeaza agregate de-a lungul periferiei nucleare relevand un model conformational semilunar.
Caracterizarea morfologica a cromatinei demonstreaza o degradare ordonata a ADN-ului de catre
o nucleaza endogena dependenta de cation (9), intai in fragmente mari de 30-50 kilobaze (10)
pana la fragmente nucleozomale de 180-200 perechi de baze (11). Totusi, clivarea cromatinei la
fragmente nucleozomale nu are loc in toate tipurile celulare si poate fi inhibata fara a bloca
celelalte modificari ale apoptozei (12,13). Odata cu condensarea cromatinei este alterata
ultrastructura nucleara. Lamina nucleara si reteaua de filamente intermediare care mentine
integritatea anvelopei nucleare si distributia porilor nucleari sunt clivate proteolitic (14-16).
Astfel, distrugerea structurii retelei nucleare ar putea permite alaturarea porilor nucleari (17) si
faramitarea nucleului in fragmente ce contin cromatina, care, majoritatea mentin vestigii ale
membranei nucleare. Celelalte organite citoplasmatice raman intacte din punct de vedere
structural cu toate ca difunctiile mitocondriale sunt asociate cu apoptoza (18)
Modificarile nucleare sunt precedate de reducerea potentialului transmembranar
mitocondrial, necuplarea transportului de electroni de la sinteza ATP-ului si cresterea generarii
de specii reactive de oxigen. In citoplasma apare cross-linkarea de proteine prin actiunea
transglutaminazelor (19), filamentele citoscheletale se agrega in formatiuni paralele si reticulul
endoplasmic se dilata si fuzioneaza cu membrana plasmatica creand cratere in forma de sac la
nivelul fuziunii. Se poate specula faptul ca celula sufera o alterare profunda a citoscheletului. Cu
toate ca, pana in momentul de fata, aceasta problema nu a fost studiata in detaliu, exista exemple
in care distrugerea citoscheletului duce la angajarea celulei pe calea apoptotica, in timp ce,
stabilizarea citoscheletului inhiba apoptoza. In apoptoza, membrana celulara se umfla si se
cuteaza intr-o masura mult mai mare decat in necroza, fenomenul a fost numit zeioza.
Integritatea structurala a membranei este ulterior compromisa prin pierderea asimetriei
fosfolipidice, a microvililor si a jonctiunilor intercelulare. Celula se sfericizeaza, se indeparteaza
11

de vecinii sai si se contracta dramatic si expulzeaza protuberante care se separa in corpi

apoptotici inveliti in membrana. In interiorul tesuturilor, celulele apoptotice si corpii apoptotici
sunt recunoscuti si fagocitati rapid de catre celulele vecine sau macrofage.

Stadiile apoptozei intr-un limfocit. Aceste stadii sunt observate mai bine in culturi
izolate atata vreme cat in vivo ar interveni fagocitoza: (a) Celula normala are o citoplasma
dispersata si cromatina nucleara heterogena. Volumul celulei e de aproximativ 90 fL. (b)
Celula a pierdut o parte din volum si organitele citoplasmatice sunt strans impachetate, se
observa ingramadiri ale cromatinei. In acest stadiu sunt prezente modificarile membranare
care duc la fagocitoza. (c) Celula etaleaza zeioza. (d) Colapsul cromatinei cu aranjarea ei in
forma de semiluna de-a lungul anvelopei nucleare. Volumul celular este acum de 70 fL. (e)
Nucleul are acum aspectul unei gauri negre. (f) Nucleul se fragmenteaza in sfere, iar
membrana se cuteaza vormand vezicule. (g) Fragmentele celulare continute in corpii
apoptotici care, pentru o vreme, continua sa excluda colorantul vital.

Recunoasterea celulelor apoptotice de catre fagocite poate implica interactii ale lectinelor
macrofagelor endogene cu resturi zaharidice N-acetil specifice exprimate pe suprafata celulelor
apoptotice, interactiile specific mediate de receptori cu fosfatidilserina din stratul exterior al
membranei plasmatice si interactiile trombospondina/receptori de suprafata celulara, ce contin
12

resturi incomplet caracterizate, de pe suprafata celulelor apoptotice (20). Exista evidente ce

sugereaza ca mecanismul de recunoastere poate fi diferit in functie de populatia de fagocite.
Semnificativ pentru strategia centrala a acestui tip de moarte celulara este clerance-ul rapid si
eficient al resturilor apoptotice de catre fagocitele vecine, amatoare sau profesioniste, deoarece
previne raspunsul inflamator care, altminteri, ar urma calea distrugerii celulare si deversarea
proteinelor intracelulare si a acizilor nucleici in spatiul extracelular.
Odata ce faza de executie a apoptozei este activata, intregul proces demareaza rapid si
este complet terminat in cateva ore (21). Durata acestei faze este relativ invariabil in raport cu
tipul celular si stimulul apoptotic sugerand ca stadiul final al apoptozei trece printr-o cale
comuna. Totusi, stadiul de angajare, timpul de la receptarea stimulului apoptotic pana la initierea
fazei ireversibile de executie este extrem de variabil si depinde de tipul celular, de stimulul
apoptotic, de situarea in cadrul ciclului celular si de expresia diversilor factori modulatori ai
mortii. Multi factori care influenteaza angajarea sau susceptibilitatea celulara la apoptoza sunt
implicati direct in receptia si transmiterea semnalului apoptotic. Acesti factori reglatori sunt
frecvent selectati pentru a bloca procesul pe parcursul transformarii neoplazice sau dezvoltarii
rezistentei la medicamente si sunt subiectul modificarii virale.
Perioada de fragmentare a ADN poate fi utilizata pentru dividerea in serii temporale a
evenimentelor implicate in apoptoza mai mult decat perioada sintezei de ADN ce este utilizata
pentru impartirea ciclului celular proliferativ (22). Pe parcursul fazei D 1 apoptotice, celula sufera
o reprogramare genetica, proces pe parcursul caruia gene care erau normal exprimate acum sunt
supresate si invers (23-26). Aceste modificari epigenetice au ca rezultat fragmentarea dublu
catenara a ADN pe parcursul fazei F. Pe parcursul acestei faze F morfologia nucleara se schimba
(marginalizarea nucleara a cromatinei urmata de condensarea nucleara si eventual de
fragmentarea nucleului insusi), cu toate ca membranele plasmatica si lizozomala sunt inca intacte
si mitocondria inca functionala. Pe parcursul urmatoarei faze, portiunea D 2, apare inmugurirea
membranei si eventual fragmentarea celulara in clustere de corpi apoptotici inveliti in membrana.

13

Genetica apoptozei
In pofida numeroaselor progrese ce s-au realizat in cercetarea stiintifica este foarte
dificila identificarea moleculelor responsabile de apoptoza cu ajutorul demersurilor biochimice si
moleculare in sistemele mamaliene. Din fericire, nematodul Caenorhabditis elegans reprezinta
un model particular de studiu al reglarii genetice a apoptozei extrem de util (76). Pe parcursul
dezvoltarii embrionare si larvare a nematodului sunt eliminate 131 din 1090 celule in cadrul unui
program foarte bine caracterizat, invariant din punct de vedere spatio-temporal. Astfel, s-a
identificat un numar mare de mutatii ce afecteaza stadii specifice ale procesului apoptotic si
genele corespunzatoare care au fost ordonate intr-o schema genetica .Aceste gene sunt implicate
in decizia de a intra pe calea mortii, in executia acestei cai, in inglobarea celulelor muribunde si
in degradarea resturilor celulare din cadrul inglobarii. Doua dintre aceste gene, ced-3 si ced-4
sunt necesare pentru toate formele de apoptoza din cadrul dezvoltarii si se considera a codifica
efectorii finali ai cai apoptotice. O alta gena reglatoare cheie, ced-9, este necesara pentru supresia
apoptozei in celulele programate sa supravietuiasca (77). Aceasta gene codifica o proteina
omologa cu familia Bcl-2 din sistemul uman. Mai mult decat atat, expresia lui Bcl-2 poate inhiba
apoptoza in nematode si poate chiar substitui partial pierderea functiei lui Ced-9, ceea ce indica
faptul ca cel putin cateva componente ale caii apoptotice sunt conservate in evolutie. Mutatiile
survenite in 6 gene afecteaza inglobarea corpilor apoptotici de catre celulele vecine nonprofesionale. Proteinele intracelulare Ced-2, Ced-5 si Ced-10 semnalizeaza intr-o maniera
comparabila cu omologii lor mamalieni Crkll, DOCK 180 si Rac mediind reorganizarea si
extensia citoscheletului celulei inglobatoare. Ced-7, omoloaga cu ABC-1 activeaza atat in celula
muribunda cat si in cea inglobatoare, posibil in transportul transmembranar de lipide. Ced-1 este
analog receptorilor scavenger din sistemul mamalian; Ced-7 si Ced-1 promoveaza, probabil,
inglobarea interactionand cu proteina adaptoare de semnalizare Ced-6 .

14

Schema genetica a apoptozei in C. elegans. Au fost izolate mutatiile din 14 gene diferite ce
afecteaza apoptoza in diferitele ei etape. Mutatiile ce influenteaza decizia de a murii
afecteaza doar un numar mic de gene. Genele implicate in etapele ulterioare sunt comune
tuturor celulelor somatice din organism angajate pe calea mortii. Activitatea lui ced-3 si
ced-4 promoveaza moartea celulara, iar ced-9 previne acest proces.

Biochimia apoptozei
Celulele care sufera apoptoza, se contracta considerabil, iar electrono-micrografiile
evidentiaza o citoplasma extrem de condensata cu organite ce par a fi normale. Cea mai
plauzibila explicatie ar fi aceea ca celula a pierdut apa si, cum nu se evidentiaza o umflare
imediata, probabil a pierdut ioni izoosmotic. De asemenea, nu au fost descrise leziuni specifice
ale organitelor citoplasmatice, sau ele nu au fost cautate intr-un mod adecvat. A fost observata
umflarea cisternelor reticului endoplasmic.
Biochimic, in celula are loc reducerea sintezei de ARN si proteine urmata de degradarea
lor, dar sincronizarea acestor evenimente in raport cu modificarile morfologice nu este inca bine
caracterizata. Totusi, initial s-a crezut ca tranzitia de la normal la contractarea apoptotica se
15

realizeaza atat de rapid incat nu poate fi observata o stare intermediara, citometria in flux poate
ajuta la caracterizarea modificarii si in combinatie cu sortarea celulara poate inlesni o patrundere
mai profunda in ordinea evenimentelor.
Desi apoptoza este un proces opus necrozei, reprezentand calea fiziologica de moarte
celulara, poate fi de asemenea provocata de stimuli patologici. In general, orice stimul ce
produce necroza prin distrugere celulara directa poate induce apoptoza, in cazul in care celula
initial supravietuieste. In acest sens, apoptoza reprezinta un raspuns celular coordonat la stimuli
vatamatori care nu sunt imediat letali. Nu se poate vorbi de o serie invariabila de evenimente
metabolice ce au loc in cursul apoptozei. Totusi, timpuriu, in apoptoza, in multe tipuri celulare
apare o crestere sustinuta a nivelului de calciu ionizat citosolic. Calciul, poate activa latent
enzime care contribuie la modificarile structurale din cursul apoptozei. Aceste enzime includ o
endonucleaza nucleara calciu dependenta care cliveaza invariabil ADN si o transglutaminaza
care crosslinkeaza proteine citosolice. Proteazele calciu dependente (calpaina) degradeaza
citoscheletul.
In general, procesul apoptotic are nevoie de energie sub forma de ATP, reclama sinteza
activa a ARN si proteina depinde de tipul celular si stimulul apoptotic. In limfocitele mature,
agentii care inhiba ARN-ul sau sinteza proteica in general duc la blocarea apoptozei; din contra,
in neutrofilele imature si in unele linii celulare leucemice, aceeasi compusi amplifica apoptoza.
Una din explicatiile acestei contradictii este ca majoritatea celulelor contin proteine reglatoare
care pot inhiba sau promova moartea celulara fiziologica. Intr-un tip particular celular,
comparand ratele catabolice ale inhibitorilor si promotorilor se poate determina daca sistarea
sintezei de ARN si proteice previne sau induce apoptoza.

16

Evenimente metabolice ce au loc in apoptoza.

In celulele destinate sa sufere apoptoza creste mRNA pentru -tubulina inainte de aparitia
modificarilor morfologice si a clivajului DNA. Intr-o etapa ulterioara, apar si in citoplasma
cantitati crescute de -tubulina. Probabil ca, genele pentru -tubulina sunt degradate impreuna
cu restul DNA-ului nuclear indata ce endonucleaza devine activa (30). Agentii care interfera cu
polimerizarea actinei, cum ar fi citocalasina B, s-a aratat ca previn inmugurirea celulara ce duce
la formarea corpilor apoptotici fara a bloca fragmentarea nucleului sau clivajul DNA (31)
Nucleul este locul producerii majoritatii modificarilor dramatice ce au loc in apoptoza.
Modificarile sunt studiate mai bine cu ajutorul microscopiei electronice de transmisie dar au
fost deja vizualizate in celule vii in urma utilizarii colorantilor fluorescenti cum sunt acridin
oranjul sau Hoechst 33342. Modelul modificarilor difera de la un tip celular la altul dar, in
general, nucleul se contracta si cromatina devine foarte densa, se fragmenteaza si, in final se
leaga strans de anvelopa nucleara.
Aceasta modificare este adesea acompaniata de fragmentarea ADN in subunitati regulate
ce formeaza o scara ca rezultat al ruperii dublu catenare, aparent randomice la nivelul
regiunilor linker dintre miezurile nucleozomale. In fiecare celula exista peste un milion de astfel
17

de rupturi ceea ce releva o situatie imposibil de reparat si ca urmare are loc sistarea transcriptiei
(32).
In ultimii ani a existat o controversa cu privire la dimensiunile fragmentelor de
ADN, produse pe parcursul apoptozei, responsabile de angajamentul ireversibil pe calea mortii
celulare.

Modificarile structurale ale celulei pe parcursul apoptozei. Imaginea superioara reprezinta

o celula normala. Imaginea inferioara reprezinta o celula in cursul procesului de apoptoza;
sagetile indica fragmente de cromatina condensata.

Exista o serie de rapoarte ce precizeaza ca atunci cand celula intra in apoptoza ADN-ul
genomic este degradat in fragmente mici nucleozomale (repetari de cate 200 pb). Totusi au
existat rapoarte ce sustineau ca celulele pot intra in apoptoza pe criterii morfologice fara
producerea scarii de ADN nucleozomal (33-36, 37).
O serie de investigatii au sugerat ca proteinele responsabile de fragmentarea letala a ADN
in apoptoza sunt endonucleaze de tip DNaza I care, pentru activare, depind de calciu (Ca 2+) (11,
38). De asemenea, intr-o serie de tipuri celulare, in care a fost indusa apoptoza sub diferite
forme, s-a demonstrat elevarea sustinuta a nivelului de ioni liberi de calciu intracelular (Ca i) (3943) care s-a sugerat ca ar fi necesari pentru activarea endonucleazelor de aproximativ 23 kD (44,
45). Celulele raspund la o crestere a Cai prin pomparea calciului in interiorul unei organite
18

intracelulare sau in afara celulei prin membrana citoplasmatica. Astfel de transport de Ca2+ este
catalizat de schimbul membranar de Na2+ - Ca2+ si de proteinele ATP-aze Ca2+. Deoarece ATP-aze
Ca2+cere un proton pentru transportul vectorial al Ca 2+ in afara celulei un astfel de transport ar
putea acidifia celula daca nu ar fi imediat tamponat sau transportat in afara celulei (46).
In modelul propus de Filipski in 1990 este privit ca fiind ordonat in bucle de cromatina
bine stabilizate de cate 50 Kb, aceste bucle sunt infasurate in structuri hexamerice numite rozete
si continand aproximativ 300 Kb de ADN. Rozetele formeaza subunitatea de baza a cromatidei
rasucite.
Au fost studiate activitatile endonucleolitice asociate cu fragmentarea ADN cu masa
moleculara mare cu ajutorul tehnicii PFGE (pulsed field gradient gel electrophoresis). S-a
observat, in toate tipurile de celule studiate, o activitate dependenta de Mg2+ capabila de
producerea fragmentelor de la 50 Kb la 300 Kb, iar ionii de Ca au fost necesari pentru
fragmentarea ulterioara la oligonucleozomi (47-49). Aceaste experimente au sugerat ca ar putea
fi necesare doua enzime separate pentru fragmentarea completa a ADN pe parcursul apoptozei.
Totusi, utilizand chelatori ai Ca2+ intracelular (50) s-a observat ca pentru degradarea ADN de
masa moleculara mare sunt de asemenea necesare cantitati nanomolare de calciu, complicand
astfel explicatia fenomenului de clivare. De asemenea s-a observat ca fragmentarea
internucleozomala de ADN poate fi blocata de catre zinc, cunoscut inhibitor al endonucleazelor
Ca2+ si Mg2+ dependente (51, 52).
In continuare s-a demonstrat faptul ca fragmentarea internucleozomala a ADN in
apoptoza nu este randomica (53). Fragmentarea apare preferential in elementele repetate ale
ADN care au un rol in organizarea structurala a cromatinei.

19

Modelul Filipski et al. (1990) ce prezinta structura cromatinei. Sagetile corespund

situsurilor de clivare ale cromatinei.
De asemenea, se pare ca nucleozomii sunt eliberati de preferinta din regiunea domeniilor
rozeta si/sau bucla ce contin elemente repetitive ale ADN pe parcursul fazei secundare de
degradare. S-a aratat ca sensibilitatea generala a cromatinei la nucleaze nu este alterata pe
parcursul apoptozei (54). Aceasta indica faptul ca in conditiile unui nivel ridicat de Ca 2+
fragmentarea de ADN are loc in interiorul buclelor de ADN la un numar strict de loci si nu e
dependent de gradul de pliere al fibrei de 30-nm care determina accesibilitatea generala a
regiunilor linker (55). Luand in considerare toate aceste date se poate spune ca fragmentarea
endogena a ADN pe parcursul apoptozei se produce in 3 etape (fig. 6). Prima etapa incepe cu
activarea unei endonucleaze legata constitutiv de o clasa de SAR (regiuni de atasare a matricei si
citoscheletului) bogate in legaturi A-T, care ataseaza domenii mari ale cromozomului la matricea
nucleara. Concentratia nucleara endogena de Mg2+ este suficienta pentru activitatea ei. Nu este
nici o cerinta de Ca2+ atat timp cat ADN este monocatenar. S-au evidentiat astfel o serie de
fragmente monocatenare de ADN pe parcursul procesului de apoptoza. A doua etapa implica
propagarea acestei degradari la alte clase de SAR. Aceasta propagare are o dependenta de Ca 2+
sugerand ca situsurile si-au imbogatit compozitia in C-G si toata cromatina este redusa la
fragmente de ~ 300 kb. In etapa a treia se cliveaza ADN internucleozomal la regiunile linker din
interiorul buclelor si genereaza scara ADN. Aceasta clivare este relativ independenta de
secventa (in termeni legati de situsurile ce leaga nucleaza) dar necesita Ca 2+ pentru cinetica. De
asemenea, aceasta etapa necesita proteoliza (56). Factorii aditionali implicati in aceasta etapa ar
putea realiza extensia finala a fragmentarii ADN ce difera mult de la un tip celular la altul. Toate
aceste etape de degradare sunt catalizate de o enzima sau doua pool-uri de enzime cu proprietati
DNaza-I like.

Embriogeneza
20

Moartea programata a celulei joaca un rol important in dezvoltarea embrionara a plantelor si

animalelor. Genele implicate in dezvoltarea ontogenetica sunt implicate in apoptoza diferentiata
a organelor in dezvoltare si a diferentierii celulare. Spre deosebire de necroza, apoptoza este
determinata de contractarea si fragmentarea celulei fara varsarea continutului celular inafara
celulei, aceasta faciliteaza fagocitarea de catre macrofagi (wikipedia), iar arhitectura tisulara si
celulara adiacenta este pastrata intacta si ea umple spatiile lasate goale de catre celula apoptotica
Afectarea genelor implicate in declansarea specifica a apoptozei poate da nastere la diferite
malformatii ale dezvoltarii diferitelor organe. De exemplu: perturbarea apoptozei specifice in
dezvoltarea degetelor la om poate provoca sindactilie:

Dezvoltarea celulelor limfocitare B si T sunt controlate de sortarea celulara in maduva osoasa

respectiv timus pentru maturare si indeplinirea functiei pe care trebuie sa o indeplineasca.
Maturarea incompleta a acestor celule declanseaza intracelular cai de semnalizare care duc la
apotoza celulelor incompetente de indeplinirea functiei date ( de exemplu sinteza de anticorpi).
Celulele citotoxice-T sunt capabile sa interactioneze direct cu membrana celulara a celulelor tinta
eliberand substante care induc apoptoza in celula infectata cu un virus sau care nu este capabila
de functionarea normala. Formarea porilor de interactiune cu celulele tinta este data de cercetarea
perforinelor si de granule care contin granzima B, proteaze serinice care impreuna activeaza o
varietate mare de cai de semnalizare cu implicarea caspazelor cu o actiune de taiere a proteinelor
la nivelul asparaginei.

21

Reglarea mitocondriala
Mitocondria indeplineste un rol esential in organismele multicelulare. Fara mitocondrii celula
inceteaza sa respire aerob si moare repede. Proteinele implicate in declansarea apoptozei se leaga
specific de mitocondrie si o distruge partial eliberand diferite molecule care declanseaza moartea
programata a celulei. Aceste molecule pot declansa o umflare a membranei si eliberarea
anumitor componente intramitocondriale. Oxidul de azot este capabil de a disipa potentialul
membranar al mitocondriei astfel membrana este mai permeabila pentru anumite componente.
Proteinele membranare SMAC (second mitochondia-derived activator of caspases) sunt eliberate
in citosol in urma permeabilitatii membranei. Aceste proteine se leaga specific de IAPs
(Inhibotor of Apoptosis Proteins) le dezactiveaza astfel inhibarea apoptozei este distrusa si celula
nu mai poate supravietui si este declansata apoptoza. IAPs de asemenea activeaza protezele
cisteinice cunoscute sub numele generic de Caspaze care declanseaza degradarea celulei.
Prin afectarea membranei mitocondriale de asemenea se elibereaza Citocromul C prin
intermediul canalelor MAC (mitochondrial apoptosis-induced chanel). Citocromul C eliberat din
mitocondrie leaga specific proteina Apaf1 si ATP care impreuna cu pro-caspaza 9 formeaza un
complex proteic care este apoptosoma. Apoptosoma taie pro-caspaza 9 rezultand caspaza 9, care

22

la randul ei activeaza caspaza 3.

.Activarea apoptosomei de catre citocrom C si pro-caspaza 9

Apoptoza versus necroza

Moartea celulara poate fi accidentala sau programata intr-un organism multicelular. Dovezile
sprijina ipoteza existentei unui program de sinucidere inerent in celulele vertebratelor care
este activat atunci cand moartea celulei este dorita pentru binele restului comunitatii celulare.
In tesuturile vertebratelor s-au descris doua modele de moarte celulara cu morfologie
distincta: apoptoza si necroza (3, 4), insa mecanismele lor la nivel molecular nu sunt inca
complet intelese.
NECROZA poate fi descrisa ca si colapsul metabolic celular si apare cand celula nu-si
mai poate mentine homeostazia ionica. Pe masura ce nivelurile de ATP se epuizeaza si gradientul
ionic transmembranar se disipa, celulele se umfla si organitele intracelulare se dilata. Initial se
23

observa inmuguriri reversibile ale membranei, modificari timpurii in conformatia si functia

mitocondriilor si celula devine rapid incapabila de a mentine homeostazia. Depasind un prag,
procesul devinde ireversibil. Membrana celulara poate deveni situsul major al alterarilor
pierzandu-si astfel capacitatea de reglare a presiunii osmotice, celula se umfla si crapa.
Deteriorarile membranelor interne permit eliberarea enzimelor lizozomale, continutul celulei este
imprastiat in spatiul tisular inconjurator si provoaca un raspuns inflamator nespecific.
Necroza este indusa tipic de modificari extreme in mediul inconjurator al celulei, ce
determina leziuni severe si bruste, provocate de exemplu de ischemie, hipertermie mentinuta sau
traume fizice sau chimice. Se presupune ca necroza nu este influentata genetic (5),

. Ilustrarea secventei de modificari ultrastructurale care au loc in apoptoza (2-6) si

necroza (7 si 8). (1)Celula normala. Apoptoza timpurie (2) se caracterizeaza prin
compactarea

si

marginalizarea

cromatinei,

condensarea

citoplasmei

si

plierea

membranelor, nucleara si plasmatica (3). In ultima etapa, nucleul se fragmenteaza si

protuberantele formate pe suprafata celulei se separa pentru a forma corpii apoptotici,
care (4), sunt fagocitati de celulele vecine si (5 si 6) degradate in lizozomi (7). Necroza este
asociata cu gruparea neregulata a cromatinei, umflarea organitelor si distrugerea focala a
membranelor (8). Apoi membranele se dezintegreaza dar, in general, celula isi mentine
intreaga conformatie pana la indepartarea ei de catre fagocitele mononucleare.
24

APOPTOZA este o forma de moarte celulara in care procesul este mult mai subtil. Este
adesea echivalata cu moartea celulara programata, dar este bine sa mentinem cele doua concepte
distincte - cel morfologic si cel escatologic. Apoptoza se refera la o serie de modificari
morfologice pe parcursul procesului de moarte celulara, modificari diferite de cele observate in
necroza, fiind asociata cu procesul normal de reglare a tesuturilor (fig. 1). La vertebrate, moartea
celulara este acceptata ca un proces obisnuit si chiar accentuat previzibil, dar programarea ei
nu se face in sensul acceptat la nevertebrate, ca o moarte a celulelor individuale, care in anumite
cazuri poate fi apreciata, cu mare acuratete, ca fiind programata (6, 7). In ultima vreme suntem
fortati sa acceptam observatia, aparent paradoxala, ca moartea celulara este atat programata cat si
stohastica. De exemplu, pe parcursul dezvoltarii populatiilor de celule B, aproximativ 95 % din
celule vor muri dintr-unul dintr-o varietate de motive (rearanjament genic imperfect sau absenta
stimularii) dar este imposibil de prevazut dinainte care dintre ele se va produce.
Apoptoza apare in celule individuale dispersate, nu in grupuri de celule invecinate, asa
cum se intampla in necroza.
Se pare ca apoptoza prezinta cea mai comuna morfologie atunci cand moartea celulara
este determinata fiziologic. Referindu-ne la mamifere, exemplele includ moartea celulelor cu
perioada de injumatatire scurta (neutrofile); eliminarea celulelor T autoreactive; involutia
celulelor lipsite de factorii de crestere necesari; moartea morfologica a celulelor pe parcursul
evolutiei embrionare si postembrionare timpurii; si omorarea celulelor care servesc drept tinte
celulelor T, celulelor natural ucigase (NK), sau mecanisme citotoxice mediate celular dependente
de anticorpi.
Motivul pentru care celulele trebuie sa moara este diferit de la un tip celular la altul la fel
si mecanismul de declansare. Deseori semnalul de sinucidere provine din mediul inconjurator, ca
in expunerea la sau retragerea dintr-un mediu cu hormoni sau factori de crestere. Acest aspect
este incitant din punct de vedere conceptual, atata vreme cat se traduce prin faptul ca soarta unei
celule este dependenta de activitatea alteia; chiar daca moartea este programata, locusul
programului este in afara celulei care trebuie sa moara. In alte cazuri, de exemplu turnoverul
neutrofilelor, se pare ca celula are un ceas intern autonom care ar controla programul de moarte a
celulei (adevaratul program de moarte celulara autonom a fost identificat la nematode si genele
ce controleaza acest proces au fost elucidate (8). Caile de activare a apoptozei vor fi diferite in
diferite celule, dar mecanismul de moarte in sine va fi mereu acelasi, ceea ce inseamna ca exista
o cale finala comuna. Este foarte important ca in studiul apoptozei sa incercam sa facem
25

distinctia dintre procesele care sunt specifice celulei de cele care sunt specifice mortii. Se pare ca
exista multe mecanisme declansatoare ale cailor de sinucidere, chiar si intr-un singur tip de
celula. Nu toate acestea vor fi recunoscute imediat ca fiind programate. De exemplu, pentru a
activa calea apoptotica, timocitele pot fi semnalizate de catre glucocorticoizi sau de o crosslinkare a receptorului pentru antigen, in acest caz, ambii stimuli fiind considerati fiziologici. Dar,
timocitele vor suferi un proces apoptotic identic dupa expunerea la o doza mica de radiatii
ionizante sau la o otrava. Deoarece nici unul dintre acesti agenti nu este fiziologic, in acest caz
moartea celulelor nu poate fi strict definita ca fiind programata. Totusi definitia poate fi largita in
sensul ca in anumite celule, cand sunt deteriorate nespecific, se poate activa fiziologic o moarte
programata. Aceasta presupune ca deteriorarea sa nu fie foarte severa pentru ca programul sa
poata fi exprimat: daca timocitele sunt mentinute la 43C vor muri prin necroza, dar daca se
revine, suficient de rapid, la o temperatura de 37C, vor muri prin apoptoza. S-a sugerat ca, ar fi
prea periculos pentru limfocite sa incerce repararea unor astfel de tipuri de leziuni, atata vreme
cat o reparare imperfecta ar putea duce la instalarea autoimunitatii sau a leucemiei in astfel de
cazuri celulele activandu-si mecanismul apoptotic.

Recunoasterea si inlaturarea celulelor apoptotice

Evenimentul final, comun pentru majoritatea celulelor apoptotice este reprezentat de
recunoasterea si indepartarea lor de catre fagocite. Celulele apoptotice sunt indepartate inaintea
lizei lor, acest eveniment sugerand ca ele exprima modificari specifice pe suprafata ce
semnalizeaza fagocitelor legarea si inglobarea lor. Aceste fagocite pot fi profesioniste
(macrofagele) sau amatoare (fibroblaste, celule epiteliale si celule musculare netede din peretii
vaselor de sange). Pana acum au fost descrisi mai multi receptori pe macrofage si alte celule ce
leaga celulele apoptotice si mediaza inglobarea lor. Acestia sunt reprezentati de receptori lectin26

like (65), receptorul pentru vitronectine v3 (66), CD36, receptorul de recunoastere al

fosfatidilserinei (67), inca necaracterizat, CD14 (68) si receptori scavanger (69). De curand, s-a
demonstrat ca transportorul ABC1, de asemenea implicat in inglobarea celulelor mamaliene
apoptotice, mediaza transportul anionic fiind omolog genei ced-7 asociata cu fagocitoza corpilor
apoptotici in C. elegans. Mecanismul prin care acesti receptori mediaza fagocitoza celulelor
apoptotice nu este cunoscut, iar liganzii acestor receptori nu sunt inca bine caracterizati. Cu toate
acestea comun multor celule ramane expunerea fosfatidilserinei pe fata externa a membranei
plasmatice, acest fosfolipid parand a fi recunoscut intr-o maniera stereospecifica de catre
subseturi de macrofage, de catre celule melanoma, de celule musculare netede din peretii vaselor
de sange si de celule Sertoli. In mod normal, fosfolipidele de membrana sunt distribuite
asimetric.
Macrofagele sunt fagocite profesioniste ce indeparteaza celulele si corpii apoptotici,
dar la acest proces pot participa si alte tipuri celulare, ca de exemplu celule epiteliale si tumorale
ce pot ingloba celule apoptotice vecine. In timpul inglobarii celulelor apoptotice, macrofagele nu
elibereaza agenti de tipul eicosanoizilor si citokinelor (70). Lipsa acestui raspuns pare a fi
determinata de mecanismul prin care celulele apoptotice sunt ingerate, dat fiind ca celulele
apoptotice, opsonizate pentru a putea fi preluate de receptorii Fc ai macrofagelor, induc, de
exemplu, eliberarea de tromboxan. Totusi, daca celulele apoptotice nu sunt preluate de catre
macrofage, ele se umfla si se dezintegreaza eliberandu-si continutul. Daca ar avea loc un astfel
de eveniment pe parcursul clearance-ului neutrofilelor din situsurile inflamate, eliberarea
continutului granulelor citoplasmatice ar avea consecinte nefaste. Mai mult decat atat, evadarea
nedorita a materialului nuclear din leucocitele moarte, poate fi de asemenea periculoasa,
nucleozomii eliberati din limfocitele apoptotice neingerate pot stimula sinteza de ADN si
imunoglobuline in limfocitele viabile (71). Prin urmare, este posibil ca dezintegrarea limfocitelor
apoptotice (presupus neingerate) sa constituie o sursa de ADN nucleozomal circulant, observat
de altfel la anumiti pacientii cu lupus sistemic eritematos, contribuind la stimularea policlonala a
celulelor B tipica pentru aceasta afectiune autoimuna si tintind autoanticorpi catre paturile
vasculare, cum ar fi glomerulii renali, in care componentele nucleozomale circulante s-ar putea
lega (72).
Exista mai multe mecanisme posibile de recunoastere a celulelor apoptotice de catre
fagocite si de asemenea, mai multe statusuri tinta etalate de celulele apoptotice.

Lectinele fagocitelor
27

Un mecanism obisnuit de interactie intercelulara il reprezinta legarea carbohidratilor de la

suprafata celulara a unei celule de lectinele altei celule, mecanism ce poate fi inhibat specific de
catre zaharuri simple recunoscute de lectine.
Unele din consecintele apoptozei sunt reprezentate de modificarile specifice ale
carbohidratilor de pe suprafata membranei celulare. Se presupune ca pierderea, printr-un
mecanism inca necunoscut, a unui reziduu terminal de acid sialic din lanturile laterale
glicoproteice ar putea sa expuna N-acetilglucozamina, N-acetilgalactozamina si galactoza,
mascate in conditii normale, restituind aceste reziduuri accesibilitatii interactiunii cu presupusele
lectine macrofagice

Trei mecanisme prin intermediul carora fagocitele ar putea recunoaste celulele ce intra in
apoptoza.

Receptori trombospondinici ai fagocitelor

Macrofagele umane derivate din monocite (HMDM) pot recunoaste neutrofile si
limfocite umane apoptotice prin intermediul receptorilor pentru vitronectina (VnR) v3 si
receptorii scavenger din clasa B (CD36) (74). Acesti receptori se leaga de trombospondina ce
serveste drept punte intre macrofage si celulele apoptotice. Se pare ca aceasta recunoastere este
independenta de expunerea fosfatidilserinei le suprafata membranei celulei apoptotice si pare a fi
legata de fenotipul macrofagului si nu de tipul celulei apoptotice.
28

Receptorii pentru fosfatidilserina

Este clar ca macrofagele pot recunoaste fosfatidilserina intr-o maniera dependenta de
doza si de stereospecificitate, fapt ce sugereaza existenta receptorului pentru FS. Au fost descrisi
o serie de receptori cu rol in medierea recunoasterii FS si anume CD68, CD14, anexinele,
receptorii scavenger, beta2 glicoproteina I si gas-6. Exista si date care sugereaza recunosterea FS
de pe celulele apoptotice de catre fagocite amatoare. Nu se stie totusi daca acesti receptori sunt
specifici pentru FS. Cel mai probabil este ca mai multi receptori pot lega FS, dar ramane inca sub
semnul intrebarii daca ei pot recunoaste FS pe suprafata celulara.

Foarte multi ani semnificatia fagocitarii celulelor intacte nedorite a fost subestimata.
Pana nu demult, inglobarea celulelor apototice a fost considerata ca o inlaturare protectiva a
celulelor nedorite (75). Recent clearance-ului celulelor apoptotice i-a fost atribuit o noua
semnificatie. In functie de context, inlaturarea celulelor apoptotice de catre fagocite poate
supresa inflamatia, poate modula deletia directionata a celulelor gazda sau a parazitilor invadanti
de catre macrofage si poate regla raspunsul imun

Clearance-ul fagocitic al celulelor apoptotice.

29

Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia

cancerului

Implicatiile apoptozei in patologie

Dereglarea procesului apoptotic, ce are ca rezultat o moarte celulara excesiva,
insuficienta sau prematura, constituie fundamentul initierii si progresiei multor maladii umane.
Se presupune ca o exacerbare a apoptozei celulelor neuronale ar putea contribui la progresia si
severitatea mai multor dereglari neurodegenerative ce includ maladia Alzheimer, scleroza
laterala amiotrofica, atrofia musculara spinala, maladia Parkinson, maladiile neuromotorii si
chiar atacul cerebral. Apoptoza excesiva la nivelul celulelor T circulante este corelata cu
sindromul imunodeficientei severe si SIDA, in vreme ce manifestarea insuficienta a acestui
proces constituie mecanismul de declansare al anumitor boli autoimune si limfoproliferative.
Inhibarea procesului apoptotic prin pierderea mutatiilor functionale in genele activatoare ale
mortii sau castigarea unor mutatii functionale in genele supresoare de moarte este incriminata in
transformarea neoplazica. Virusurile si-au dezvoltat mecanisme care manipuleaza calea
apoptotica pentru a-si asigura perpetuarea propriei supravietuiri, inhiband apoptoza celulelor
infectate pentru a permite replicarea virala si activand apoptoza mecanismelor celulare de
aparare ale gazdei. Tinand cont de aceste realitati, manipularea cailor apoptotice prin interventie
farmacologica sau genetica promite noi oportunitati terapeutice pentru o serie de maladii.
Circumstantele aparitiei apoptozei se impart in doua mari categori. Apoptoza apare in
tesuturile normale, unde raspunde de deletia celulelor si este de asemenea observata in contexte
patologice specifice. Cel putin intr-o parte din situatiile din categoria a doua, poate fi sustinut
teoretic faptul ca vine in sprijinul unei semnificatii biologice. Supravietuirea celulelor in curs de
distrugere ar putea fi nociva gazdei. In contrast, necroza este totdeauna patologica fiind
consecinta lezarii majore a celulei si nu ii poate fi atribuita nici o functie homeostatica (9).
Celulele raspund la leziune, daca pot, prin apoptoza. Daca un medicament induce
apoptoza intr-un limfocit, de obicei ne furnizeaza mai multe date despre celula decat despre
medicament, deci astfel de experimente trebuie interpretate cu precautie. Implicatiile acestui
proces in terapie sunt evidente: un medicament care inhiba apoptoza poate fi folosit in prevenirea
pierderii celulei acordand timp altor forme de terapie sa inlature infectia. In cancer, dimpotriva,
va avea valoare terapeutica o cale de stimulare a apoptozei in celulele maligne. Modul de
30

obtinere al acestui efect cu specificitate adecvata reprezinta o provocare la fel ca in cazul

agentilor chemoterapeutici uzuali. Desigur, celulele T citotoxice, una din cele mai stralucite
inventii ale naturii, stiu cum sa ucida specific.
O alta potentiala terapie e reprezentata de anticorpii declansatori ai apoptozei, dar foarte
importante sunt si imunotoxinele ce ascund liganzi ce induc apoptoza.
Concomitent cu explorarea potentialului terapeutic al apoptozei este necesara
descoperirea mecanismelor si moleculelor implicate.
Evolutiei i-au trebuit milioane de ani pentru dezvoltarea unui sistem desavarsit, capabil sa
elimine celulele nedorite; noua ne revine dificila sarcina de a descoperi cum sa inducem
organismului comutarea procesului pe on sau off, la comanda.
Legaturile intercelulare caracteristice formelor superioare de viata nu ar fi posibile fara
un mecanism de indepartare individuala a celulelor care nu mai sunt necesare sau care nu mai
functioneaza normal. Reglarea defectiva a mortii celulare programate ar putea juca un rol in
etiologia cancerului, SIDA, bolilor autoimune si bolilor degenerative ale sistemului nervos
central. Manipularea farmacologica a apoptozei ofera noi posibilitati de profilaxie si tratament
acestor maladii.

Transformarea maligna
Deoarece o celula trebuie sa sufere o serie de modificari moleculare pentru a atinge
fenotipul malign si datorita faptului ca aceste schimbari sunt deseori induse de agenti sau
tratamente care, in timp, altereaza celula, orice activeaza supravietuirea celulelor deteriorate sau
initiate promoveaza carcinogeneza.
In majoritatea cazurilor, celulele canceroase sunt diferite de celulele normale din punct de
vedere morfologic. Variatiile legate de marimea si forma celulelor si a nucleilor lor corespund
pleomorfismului celulelor tumorale. Nucleul este deseori marit, cu densitati inegale (hiper- sau
hipocromatism), o membrana nucleara neregulata, angulara, nucleoli proeminenti, singulari sau
multipli. Exista o crestere a raportului nucleo-citoplasmatic. Se observa si celule bizare, cu
nuclei polilobati sau multipli si celule gigantice. Aceste modificari reprezinta semnele citologice
ale malignitatii. Exista si exceptii, in anumite varietati de cancer, celulele tumorale au un aspect
morfologic foarte apropiat de celulele normale; ca urmare diagnosticul de malignitate este dificil
de hotarat si in astfel de situati se apeleaza la alte criterii, in particular arhitecturale.
31

Majoritatea cancerelor se caracterizeaza printr-un numar mare de celule in diviziune.

Aceste mitoze sunt uneori anormale, mitoze tri- sau multipolare. Indicele mitotic, definit prin
numarul de mitoze pe unitatea de camp microscopic, are o valoare data contribuind la evaluarea
prognostica a tumorilor. In realitate, cancerele nu poseda un indice mitotic ridicat, ca cel care se
poate observa in patologia nontumorala. Totusi, in anumite tipuri de cancer, diagnosticul de
malignitate se bazeaza pe indicele mitotic (79).

Apoptoza si cancerul
Oncologii au fost traditional preocupati in principal de proliferarea celulara, cu toate
acestea in ultimul timp atentia lor se indreapta, cu un interes din ce in ce mai mare, spre studiul
apoptoze
Observatia legata de aparitia apoptozei in tumori nu este recenta. Cu peste 20 de ani in
urma s-a sugerat ca apoptoza este responsabila de o mare parte din pierderile celulare ce apar in
tumori, observatii obtinute in studiile cinetice, si nu mai este o noutate extinderea ei si activarea
in tumori ca urmare a aplicarii bine cunoscutelor metode terapeutice: iradierea, chemoterapia
citotoxica, ablatie hormonala (81,82). Totusi, in ultimii ani, extinderea cunostintelor despre
controlul apoptozei la nivel molecular a dus la largirea semnificatiei ei potential oncologice
depasind simpla alimentare a unei explicatii mecaniciste pentru deletia celulelor tumorale. In
particular, descoperirea faptului ca apoptoza poate fi reglata de produsii unor anumite protooncogene si de gena supresor tumoral p53, a deschis noi drumuri viitoarelor cercetari.
Atunci cand modificarile de la nivelul ADN cauzeaza acumularea anormala de celule se
produce transformarea maligna. Ratele comparative, ale mortii celulare si ale diviziunii celulare,
determina viteza de crestere a cancerului. Anumite celule canceroase se divid mult mai incet
decat celulele normale, dar, cancerul continua sa se extinda datorita prelungirii timpului de viata
al celulei.
Multi carcinogeni provoaca rupturi ADN sau interfera cu enzimele necesare pentru
replicarea corecta a ADN. Celula poate raspunde la acest tip de alterare in mai multe feluri: poate
intarzia diviziunea celulara pana la rerpararea leziunii, poate suferii apoptoza sau poate progresa
fara intrerupere in ciclul de crestere celulara.
Apoptoza este o metoda eficienta de prevenire a transformarii maligne deoarece ea
indeparteaza celulele care poseda alterari genetice. Apoptoza anormala poate promova
dezvoltarea cancerului, atat prin permiterea acumularii de celule in diviziune, cat si prin blocarea
32

indepartarii variantelor genetice cu potential malign ridicat. Inca nu se cunosc factorii care
determina celula sa urmeze una din cele trei cai: intrarea in apoptoza dupa leziune, repararea
deteriorarii sau continuarea ciclului celular. Paradoxal, anumite gene care stimuleaza diviziunea
celulara, cum este c-myc, participa la deciderea caii de urmat . Concentratiile de ARN si proteina
pentru c-myc cresc timpuriu in apoptoza si supraexprimarea acestor oncogene induce apoptoza
in fibroblaste .
Oncogena bcl-2 ar putea fi supresorul general al mortii celulare pentru genele care
regleaza direct apoptoza . Toate celulele hematopoetice si limfoide, multe celule epiteliale si
neuronii contin gena bcl-2, intalnita in special in membrana mitocondriala, nucleu si reticul
endoplasmic. Limfoamele foliculare de celule B poseda o concentratie crescuta de proteina Bcl2, datorita translocatiei [t(14:18)] care plaseaza gena bcl-2 sub controlul unui promotor puternic,
cel al genei ce codifica pentru lantul greu al imunoglobulinei. Proteinele virusului Epstein-Barr
cresc nivelul expresiei genei bcl-2 in celulele limfomului Burkitt .
Comparativ cu limfocitele B normale, acelea care exprima bcl-2 supravietuiesc mai mult
in cultura dupa privarea de factori de crestere si sunt rezistente atat la radiatii ionizante cat si la
glucocorticoizi. De asemenea, concentratiile crescute de Bcl-2 protejeaza celulele de apoptoza
indusa de catre c-myc (85). Soarecii transgenici, care au fost inginerizati pentru a supraproduce
proteina Bcl-2, in limfocitele B, deseori dezvolta limfoame imunoblastice cu celule mari si
difuze. La jumatate din aceste tumori cu grad avansat de dezvoltare se remarca translocatia genei
c-myc .
Produsul proteic al genei supresoare tumorale p53 poate intarzia progresia ciclului celular
inaintea initierii sintezei replicative de ADN. Multe cancere umane poseda mutatii sau deletii la
nivelul genei p53 . Proteinele codificate de virusurile oncogene pot de asemenea lega si inactiva
proteina p53. Proasta functionare a p53 poate promova dezvoltarea cancerului prin permiterea
duplicarii DNA in celulele cu mutatii secundare, inainte de o reparare completa. Totusi, p53 este
doar un inhibitor al diviziunii celulare, in alte situatii se comporta ca o apoptogena directa (o
gena ce cauzeaza apoptoza). Superproducerea proteinei p53 normale, in linia celulara leucemica
mieloida, induce rapid moartea celulara prin apoptoza .

33

Relatia dintre proliferarea celulara si apoptoza.

In multe tipuri celulare, proliferarea necesita cel putin doi stimuli externi, uneori numiti
semnale de competenta si progresie. Semnalele de competenta declanseaza evenimentele
metabolice comune atat replicarii cat si apoptozei; semnalul de progresie abate celula spre
replicare, altminteri survine apoptoza.
Apoptoza poate fi considerata o cale alternativa care distruge celulele incapabile sa
strabata punctul de vama inainte de replicarea ADN si se petrece in celulele competente
activate, cand un semnal de progresie este absent sau anormal sau cand o celula nu-si repara o
leziune intr-o perioada critica.
Majoritatea medicamentelor anticancerigene: inhibitori ai topoizomerazei, agenti
alchilanti, antimetaboliti si hormoni antagonisti, produc apoptoza in celulele sensibile (89). In
urma acestor observatii este subanteles faptul ca eficienta lor nu depinde totdeauna doar de
interactia cu o tinta biochimic specifica; un efect asupra evenimentelor metabolice conducand la
apoptoza poate, de asemenea, influenta raspunsul la chemoterapie. S-a descoperit faptul ca, in
diferite cancere umane, concentratia endonucleazelor calciu dependente, care degradeaza ADN
pe parcursul apoptozei, variaza enorm. Tendinta unei celule cancerigene de a suferi apoptoza
poate fi importanta in special pentru terapia tumorilor maligne cu o rata scazuta de crestere, care
sunt de obicei rezistente la agenti citostatici.

Aparitia spontana a apoptozei in tumori

34

Apoptoza poate fi gasita in toate tumorile virtuale, netratate. Desi s-au efectuat putine
studii cantitative precise (90), evaluarile histologice indica faptul ca extinderea apoptozei in
anumite tumori umane se apropie de ceea ce s-a observat in tesuturile cu involutie rapida
evidentiind semnificatia sa cinetica, uneori considerabila.
Factorii responsabili pentru aparitia spontana a apoptozei in tumori sunt, indubitabil,
diversi. Apoptoza, deseori este proeminenta mai ales la locusul de confluenta cu necroza, unde se
presupune ca ischemia moderata este implicata in initierea ei, aceasta este o cauza cunoscuta a
activarii apoptozei in tesuturile non-neoplazice (91, 92).
S-a aratat ca, TNF (factorul de necroza tumoral) induce apoptoza in liniile de celule
tumorale in vitro, astfel, o serie de fenomene apoptotice observate in vivo in tumori ar putea fi
atribuite eliberarii acestei citokine de catre macrofagele infiltrante. In alte cazuri, apoptoza poate
fi rezultatul atacului tumorii de catre limfocitele T citotoxice. Totusi, un nivel ridicat al apoptozei
este observat si in locusurile preneoplazice si in nodulii ce se dezvolta in ficat dupa administrarea
de carcinogeni chimici (93), este improbabil ca factorii mentionati ar putea fi operativi in aceste
circumstante. Este posibil ca prezumtivele mecanisme reglatoare ale populatiilor celulare,
descrise mai sus, actioneaza intr-o etapa timpurie a procesului de carcinogeneza, cu o apoptoza
crescuta ce echilibreaza temporar cresterea proliferarii celulare. In sfarsit, nivelurile crescute de
apoptoza in tumori pot fi rezultatul unui proces intrinsec al acestor celule. Ratele de apoptoza
gasite in tumori similare difera fiind rezultatul expresiei diferitelor oncogene.

Bibliografia :
1https://ro.wikipedia.org/wiki/Apoptoz%C4%83
2https://www.academia.edu/11550272/Fenomenul_apoptozei_celulare
3http://aosr-neamt.ro/wp-content/uploads/2014/03/Apoptoza-I.pdf
4 R.J. Smeyne, M. Vendrell, M.Hayward, S.J. Baker, G.G. Miao, K. Schilling,
L.M. Robertson, T. Curran, and J.I. Morgan, Nature, 363, 166-169 (1993)

5 K. Murao, V. Terpstra, S.R. Green, N. Kondratenko, D. Steinberg and O.

Quehenberger, J. Biol. Chem., 272, 17551-17557 (1997)
35

36