CAP. 1. GENETICA DROJDIILOR.

METODE MODERNE DE
INVESTIGAIE A GENOMULUI DROJDIILOR

1.1 ASPECTE GENERALE DE GENETIC A DROJDIILOR

Drojdiile au ocupat ntotdeauna un loc important n istoria omenirii, datorit utilizrii lor
n producerea pinii, a berii i a vinului. ncepnd ns din secolul al XIX-lea, odat cu cercetrile
ntreprinse de L. Pasteur, drojdiile au devenit subiectul a numeroase studii tiinifice, care au
permis att elucidarea unor aspecte de biologie i, mai trziu, genetic a celulei eucariote, ct i
ameliorarea unor procedee industriale i biotehnologice.
Primele observaii privind ciclul de via al drojdiilor au fost fcute chiar la nceputul
secolului XX, cunoscnd de atunci o permanent dezvoltare. Ele prezint un interes deosebit mai
ales n nelegerea reglajului diviziunii celulare, care este strns legat de procesele de recombinare
intercromozomale si de mecanismele de reparare a materialului genetic afectat de diveri factori
mutageni.
Descoperirea i izolarea primelor secvene cromozomale (originea replicrii - ARS,
centromeri - CEN, telomere - TEL) dateaz din jurul anilor 1980, n prezent, cel mai bine studiate
fiind cele de la Saccharomyces cerevisiae. Pe lng implicarea lor n replicarea ADN (ARS), n
desfurarea diviziunii celulare (CEN) i n meninerea cromozomilor (TEL), aceste secvene iau gsit o aplicabilitate practic n construirea de vectori folosii pentru clonarea, exprimarea i
chiar secreia unor compui heterologi de interes biotehnologic sau profilactic. n acest sens, un
aport deosebit l-a avut i descoperirea n unele tulpini de drojii, a plasmidei 2 m, o
macromolecul de ADN ce prezint mecanisme de replicare i reglaj independente de materialul
genetic cromozomal.
Studiul genomului nuclear a fost completat cu stabilirea metodelor de determinare a
coninutului n baze azotate al ADN i cu apariia, n 1984, a primelor tehnici de
electrocariotipare. Acestea din urm, permit separarea prin electroforez a cromozomilor ntregi
de drojdie sub influena unui cmp electric pulsator i studiul relativ uor al complementului
cromozomal prin analiza gelurilor astfel obinute.
Genomul extracromozomal al drojdiilor este reprezentat, n afar de plasmida 2 m, de
sistemul killer si de ADN mitocondrial. Sistemul killer a fost descris pentru prima dat n 1963,
ca fiind determinat de existena n citoplasm a unor particule de tip viral ce determin sinteza
unor toxine care, eliminate n mediu pot determina moartea celulelor sensibile. Caracterizarea
acestor particule a nsemnat un pas important n nelegerea interaciilor dintre speciile de drojdii
din cuvele de fermentaie din industria berii i vinului.

Elucidarea structurii ADN mitocondrial i studiul mutaiilor care pot afecta diferite gene
mitocondriale, au permis acumularea de date referitoare la procesele de respiraie celular i la
diverse ci metabolice specifice.
n concluzie, se poate spune c o caracterizare genetic complex a drojdiilor, cuprinde
date privind morfologia i ciclul de via i analize asupra structurii fine a genomului lor nuclear
i extranuclear.
Studiul genomului nuclear cuprinde date despre:
-

structura secvenelor origini ale replicrii ORI sau ARS (Autonomously Replicating
Seaquences = secvene de replicare autonom), a centromerilor (CEN) i a telomerilor
(TEL);

coninutul n baze azotate

cariotipul - numrul, dimensiunea i polimorfismul cromozomilor.

Studiul genomului extranuclear se refer la:

genomul mitocondrial;

profilul plasmidial (prezena plasmidei 2 m sau 2 m - like);

sistemul killer.

1. 1. 1. Ciclul de via.
Primele studii privind ciclul de via al drojdiilor dateaz de la nceputul secolului XX i
au dus la evidenierea unei alternane ntre faza haploid i diploid, pentru specii aparinnd
genului Saccharomyces. Cercetri ulterioare au relevat faptul c, n timp ce unele specii pot
prezenta ambele faze, altele exist n natur numai sub una dintre aceste forme, cealalt putnd fi
indus prin modificarea anumitor caracteristici ale mediului de cretere.
La marea majoritate a drojdiilor apariia de noi celule este rezultatul procesului de
nmugurire multilateral, un tip de diviziune celular n care mugurii apar pe o suprafa mare a
celulei. Acest tip este n contrast cu nmugurirea bipolar - n care mugurii apar numai la polii
celulei. Alte specii prezint nmugurire unipolar (mugurii apar numai la un pol al celulei).
Drojdiile genului Schizosaccharomyces difer de alte tipuri de drojdii deoarece se divid exclusiv
prin fisiune, proces reprezentat de apariia unui perete celular aproximativ n centrul celulei,
mprind-o pe aceasta n dou pri. n contrast cu nmugurirea, celulele care se divid prin fisiune
prezint o constricie slab sau nu prezint de loc constricie la nivelul peretelui celular nou
format.
n afar de formarea de celule noi prin nmugurire sau fisiune, unele specii pot dezvolta
hife sau pseudohife. Hifele se caracterizeaz prin lipsa constriciilor la nivelul pereilor

despritori, spre deosebire de pseudohife care prezint perei despritori, formndu-se prin
nmugurire.
Drojdiile se pot reproduce sexuat, cu formare de ascospori, pot forma teliospori sau
bazidiospori. Ascosporii prezint forme variate i aspecte diferite a suprafeei observate la
microscop. Cea mai ntlnit form este cea de plrie, dar mai pot avea i forme sferice, ovale,
alungite, elipsoidale, cu pliuri pe suprafa. Bazidiosporii pot apare din teliospori sau din hife i
au form elipsoidal sau alungit.
Speciile de drojdii care se reproduc sexuat prezint celule 2 de tipuri de mperechere
opuse. La S. cerevisiae, tipurile de mperechere sunt determinate de prezena uneia dintre cele 2
gene alele a sau , plasate la nivelul locului MAT (mating type): MAT a i, respectiv, MAT , pe
braul drept al cromozomului III. Prezena genelor determin sinteza i secreia n mediu a unor
proteine, denumite factori de mperechere, care sunt recunoscute de celulele tipului opus de
mperechere, declannd o serie de evenimente care duc n final la formarea de diploizi MAT a/
MAT .
Unele tulpini de drojdii prezint o gen HO care codific o endonucleaz care produce o
bre monocatenar la nivelul locusurilor de mperechere MAT, producnd interconversia
locusului de mperechere, adic schimbarea tipului de mperechere al celulelor n cel de tip opus
(pentru S. cerevisiae, celulele de tip a devin i invers). Astfel de tulpini se numesc homotalice.
Tulpinile care prezint alela nefuncional ho, nu manifest procesul de interconversie i se
numesc tulpini heterotalice.

1. 1. 2. Analiza genomului nuclear

(A) Secvenele ARS, CEN i TEL
Secvenele ARS au fost descrise pentru prima dat n 1979 la S. cerevisiae, sunt circa 400
secvene /genom i se succed la fiecare 30 40 kpb. La nivelul lor ncepe replicarea ADN din
cromozomi.
O secven ARS este constituit din 2 domenii (Fig. 1):
(1) domeniul A format din 11 pb, cu secven relativ nalt conservat la toate speciile de drojdii
(ACS ARS consensus seaquence) i procent de A/T ridicat (73- 82%):
5' (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) 3'
La nivelul acestei secvene se leag un complex format din 6 proteine (ORC origin of
replication complex) de tip helicaze i ATP-aze, implicate n procesele de iniiere a replicrii
ADN.
Mutaiile de la nivelul acestei regiuni duc la blocarea replicrii ADN.
(2) domeniul B este constituit din 3 subdomenii:

B11 - se leag de complexul ORC, odat cu domeniul A

B21 cu rol structural
B31 este situs de legare pentru proteina Abf1p
Domeniul B are funcie dubl: (i) asigur modificarea conformaional a ADN (plierea) la
acest nivel, anterior legrii complexului ORC, facilitnd astfel aciunea ulterioar a acestuia; (ii)
prin asocierea cu proteina Abf1p, mpiedic asamblarea ADN de la nivelul secvenei ARS n
structuri nucleozomale, ceea ce l face accesibil interaciunii cu proteinele necesare replicrii.
Deleia domeniului B duce la anularea funciei secvenei ARS.

Fig. 1. Structura secvenei ARS la drojdii

Secvenele CEN
Clarke i Carbon (1980) au izolat prima secvena centromeric din cromozomul III de la
S. cerevisiae. Importana deosebit a centromerilor rezid n faptul c la nivelul lor se formeaz
kinetocorii la care se ataeaz fibrele fusului nuclear de diviziune.
Secvenele CEN au aproximativ 120 pb, fiind plasate n interiorul unei regiuni mai mari
de 250 pb, cu rezisten cerscut la atacul nucleazelor. Nucleozomii de la acest nivel au o
structur uor modificat fa de restul fibrei de cromatin, prezentnd o histon Cse4p, care
interacioneaz cu histona H4.
Secvenele CEN sunt formate din 2 regiuni nalt omoloage (CDE I i CDE III) care
flancheaz o regiune unic (CDE II), fiecare dintre acestea interacionnd cu una sau mai multe
proteine (Fig. 2).

Fig. 2. Structura secvenei CEN la drojdii

Regiune CEN
CDE I

Dimensiune Protein ataat

Observaii

9 pb

CBF1 (dimer)

CDE II

78 - 86 pb

Cse4, Mif2

CDE III

11 pb

CBF 3 (tetramer:
3A, 3B, 3C, 3D)

Mutaiile de la acest nivel reduc, dar nu

blocheaz funcia CEN
Secven de baze conservat la toate speciile
de drojdie
Coninut - 90% A/T
Mutaiile de la acest nivel reduc, dar nu
blocheaz funcia CEN
Mutaiile punctiforme de la acest nivel
inactiveaz funcionarea CEN
Proteina CBF 3 asigur asocierea cu fusul de
diviziune i este implicat n deplasarea
cromozomilor n cursul diviziunii celulare.

Trebuie subliniat faptul ca CDE I i CDE III pot prezenta variaii ale secvenei de baze
azotate, pe cnd CDE II este conservat la toate drojdiile :
CDE I: A/G TCAC A/G TG
CDE III: TGTTT T/C TGNTTTCCGAAA
Secvenele TEL
Telomerele reprezint terminaiile cromozomilor i sunt extensii lineare, monocatenare
ale moleculelor de ADN din care sunt constituii acetia. Ele au rolul de a proteja capetele
cromozomilor mpotriva recombinrii, fuziunii cu ali cromozomi sau a degradrii lor de ctre
nucleaze. De asemenea, joac un rol important n determinarea numrului de runde de replicare
pentru o celul normal.
n general, telomerele sunt formate din secvene repetate n tandem de 5 8 pb, cu grad
nalt de similitudine chiar ntre eucariote ndeprtate i deci, relativ puternic conservate n cursul
evoluiei. ntre genuri i specii diferite apar ns variaii n ceea ce privete structura secvenelor
i, mai ales, dimensiunile lor.
La drojdii, secvenele TEL sunt nrudite cu cele de la ciliatul Tetrahymena, fiind formate
din secvene T(G)1-3 repetate de un numr variabil de ori:
Saccharomyces cerevisiae

TGTGGGTGTGGTG sau T (G)1-3(TG)1-6

Candida glabrata

GGGGTCTGGGTGCTG

Candida albicans

GGTGTACGGATGTCTAACTTCTT

Kluyveromyces lactis

GGTGTACGGATTTGATTAGGTATGT

Pe lng aceste terminaii de ADN monocatenar, n structura telomerelor la drojdii, intr

i 2 regiuni subtelomerice notate Y' i X (Fig.3), formate din ADN dublucatenar constituit din
secvene repetate C

1-3

A/TG

13,

mpachetate n structuri denumite telosomi, care sunt de fapt

nucleosomi n care histonele sunt hiperacetilate.

Regiunea Y' este plasat n imediata vecintate a telomerelor, spre captul

cromozomilor, avnd o dimensiune de 5,2 - 6,7 kpb. Ea poate exista n 0 - 4 copii / telomer.
Regiunea Y' se poate muta de pe un cromozom pe altul n timpul diviziunii celulare mitotice
sau meiotice, prin recombinare mediat de RAD52.
Regiunea X se gsete spre interiorul cromozomului, spre centromer i are o dimensiune
variabil: 0,3 3,75 kpb, fiind compus din 5 secvene mici repetitive cu dimensiuni de 35 560
pb.
n interiorul celor dou regiuni Y' i X, au fost identificate secvene ARS cu rol n
replicarea ADN dublucatenar cromozomal la acest nivel.

Fig. 3. Structura secvenei TEL la drojdii

Dimensiunea i funciile asociate telomerelor sunt reglate de gene nucleare:
-

TEL1 i TEL2 controleaz lungimea telemorelor;

PIF1 ADN helicaz care inhib replicarea necontrolat a telomerelor;

EST1 codific polimeraza din componena telomerazei;

TLC1 determin sinteza ARN din structura telomerazei.

Replicarea telomerelor se realizeaz dup un mecanism diferit de cel obinuit de replicare

a ADN dublucatenar, implicnd aciunea unei ribonucleoproteine, telomeraz, care utilizeaz

secvena repetitiv monocatenar TG ca matri n sinteza catenei pereche.
Telomerele au capacitatea de a represa transcrierea genelor plasate n vecintatea
telomerelor, fenomen numit efect de poziie (TPE Telomere Position Effect), datorat
complexrii histonelor cu proteine Rap1, Sir3 i Sir4. Fenomenul este metastabil, adic, ntr-o
populaie de celule, o gen telomer-linkat este transcris n unele celule, iar n altele nu. Cu toate
acestea, genele implicate n metabolismul anumitor zaharuri (SUC - sucroz, MAL - maltoz,
MEL - melibioz), se gsesc plasate preferenial n apropierea telomerelor.

(B) Coninutul n baze azotate a ADN

Determinarea conminutului n baze azotate reprezint, la ora actual, o caracteristic
menionat n toate determinatoarele de specialitate, pentru fiecare specie de drojdie studiat fiind
stabilite procentele ntre care variaz aceste valori. De regul, datele se refer la procentul molar
de guanin i citozin al ADN, notat mol % GC. S-a constatat ca, n general, procentul GC al

drojdiilor ascomicete este de aproximativ 30 - 50% n timp ce la drojdiile basidiomicete este de

50 - 70%. Exceptnd zona ngusta a valorilor de 48 - 52% unde apar unele suprapuneri, clasa
drojdiilor imperfecte poate fi determinat satisfctor prin calcularea procentului GC.
Estimarea coninutului n G+C al moleculelor de ADN se poate realiza prin metode
directe i indirecte:
Metode directe tehnica HPLC (high performance liquid chromatography); se
bazeaz pe hidroliza ADN cu obinerea unui amestec de nucleotide din care se determin, de fapt,
procentul tuturor bazelor azotate;
Metode indirecte - se bazeaz pe faptul c proprietile fizice ale ADN sunt puternic
influenate de coninutul n guanin i citozin din molecul, densitatea unei molecule de ADN
este cu att mai mare cu ct coninutul su n guanin i citozin este mai ridicat existnd o relaie
linear ntre densitatea de plutire a diferitelor tipuri de ADN i coninutul lor n G+C.
Coninutul G+C se poate determina indirect, prin tehnica densitii de plutire a ADN
(buoyant density) - densitatea ADN dublu-catenar crete linear cu proporia bazelor azotate
guanina i citozina; substratul chimic al acestei relaii const n existena a trei puni de hidrogen
ntre perechile de baze G-C, care devin astfel mai compacte i mai dense dect perechile de baze
A-T, unite doar prin dou puni de hidrogen.
Metoda care permite aprecierea coninutului n G+C prin determinarea temperaturii de
topire - Tm a ADN este ns cel mai frecvent utilizat, fiind simpl i cu un grad nalt de
reproductibilitate. Tm (melting midpoint) reprezint temperatura n grade Celsius la care, dintr-o
mas de molecule ADN, jumtate din ele se gsesc n stare dublu catenar i jumtate n stare
monocatenar (sunt denaturate), respectiv temperatura de echilibru ntre ADN dublucatenar
(ADNdc) i ADN monocatenar (ADNmc). Termenul de topire (melting) este utilizat deoarece
nclzirea furnizeaz energia necesar ruperii legturilor de hidrogen. Denaturarea ncepe n
regiunile bogate n A-T i continu progresiv n cele cu coninut crescut n G+C, astfel nct
valorile Tm depind direct de acesta; ele cresc proporional cu mol % GC, datorit cantitii mai
mari de energie necesar pentru a desface cele trei legturi de hidrogen dintre guanin i citozin,
spre deosebire de perechea A-T, care prezint numai dou legturi de hidrogen.
Bazele purinice i pirimidinice din structura ADN absorb radiaiile UV cu =260nm,
lungime de und care este folosit pentru determinarea cantitativ a ADN. Absorbia ADN dublu
catenar nativ la 260nm este mai mic dect absorbia mononucleotidelor sale componente,
fenomenul fiind denumit efect hipocromic i se datoreaz interactiunilor electronice dintre bazele
azotate stivuite din structura dublu-helical a ADN nativ, fapt ce diminueaz cantitatea de
lumin pe care o poate absorbi fiecare baz. Dac ADN dublu catenar nativ este supus denaturrii
termice se produce o cretere a absorbiei luminii la 260nm de circa 40% n funcie de tipul de

ADN, fenomen cunoscut sub denumirea de efect hipercromic. Acest efect crete cu coninutul n
A-T, iar temperatura de topire cu coninutul n G+C.
Prin nclzirea la temperaturi cuprinse ntre 60-1000C moleculele de ADN sufer o rupere
a legturilor de hidrogen ce leag bazele azotate i se separ n molecule monocatenare.
Dinamica procesului de denaturare termic este urmarit prin efectul hipercromic creterea
capacitii de absorbie a radiaiilor UV, la lungimea de und de 260nm i care are loc n timpul
denaturrii. Valorile absorbanei la 260nm (A260) se nscriu n grafic, rezultnd curba de shift
hipercromic (Fig. 4 a ; b)

(b)

(a)

Fig. 4. Aspectul general al curbei de shift hipercromic pentru tulpini de drojdii izolate din medii
poluate cu compui petrolieri
(a - Rhodotorula glutinis ; b Candida parapsilosis)
n funcie de Tm se poate exprima mol % GC, folosind numeroase relaii matematice.
Pentru drojdii se folosesc cele stabilite de Owen (1985) i Frank (1971):
% mol G+C = 2.08 x Tm - 106,4

( dup Owen, 1985)

% mol G+C = 2.44 x (Tm - 53.9)

( dup Frank, 1971)

(C) Structura cariotipului; electrocariotiparea.

Apariia i dezvoltarea tehnicilor electroforetice speciale care permit separarea n stare
intact a moleculelor de ADN cromosomal au facut posibil caracterizarea seturilor de cromozomi
aparinnd unor eucariote inferioare (protozoare i fungi) care, de altfel, prezint dificulti n
aplicarea analizelor clasice citogenetice i genetice. Astfel, n cazul drojdiei Saccharomyces
cerevisiae, analiza grupelor de linkage era, pn nu de mult, singura metod de numrare i
difereniere ntre cromozomi. Prin cartare genetic s-a stabilit existena a 16 cromosomi cu o
dimensiune medie cuprins ntre 500 1000 kpb. Dimensiunile reduse i lipsa diferenierii
cromozomilor n timpul mitozei i meiozei, au constituit un impediment n realizarea cariotipului la
drojdii prin metode clasice aplicabile la celelalte eucariote.

Ideea utilizrii unei separri electroforetice n stare intact a moleculelor de ADN

cromozomale ca alternativ la cariotiparea prin metode clasice a fost mult timp vehiculat, dar acest
lucru a fost posibil numai n 1982 cnd Schwartz i colab. au reuit construirea unui nou sistem de
electroforez i au artat c mobilitile electrice ale moleculelor de ADN de cteva sute de kpb
sunt strns dependente de dimensiunile lor cnd sunt supuse migrrii n geluri de agaroz n
prezena a 2 cmpuri electrice alternative. Apariia electroforezei n cmp electric pulsator
(pulsed field gel electrophoresis - PFGE) i modificrile ulterioare aduse de ali cercettori acestei
tehnici au creat premisele unei noi abordri a studiului cromozomilor de drojdii. Tehnica PFGE
permite separarea moleculelor de ADN cu dimensiuni cuprinse ntre 50 10 000 kpb (10 Mb).
Cmpurile electrice pulsatorii sunt aplicate n diferite direcii. Tehnica este optim pentru separarea
cromozomilor de S. cerevisiae care au de la 200 kb la 3 Mb. Tehnica a mai fost aplicat cu succes i
la

specii

aparinnd

genurilor

Schizosaccharomyces,

Torulaspora,

Kluyveromyces,

Zygosaccharomyces, Hanseniaspora, Candida.

Pentru speciile de drojdii care nu prezint ciclu sexuat i pentru care nu pot fi realizate n
laborator experimente de ncruciri, realizarea hibridizrilor moleculare de tip Southern blott cu
sonde marcate corespunztoare unor gene markeri pentru fiecare cromozom n parte (cromozomi
separai prin PFGE) a permis stabilirea grupelor de linkage. De asemenea, combinarea tehnicii
PFGE cu restricia cromosomilor separai electroforetic a permis realizarea hrilor genetice.
Tehnica PFGE are o larg utilizare i n construirea sau definirea unor biblioteci de cromozomi
cu rol n clonarea genelor i n cartare. n acest sens, n ultimii ani cea mai important utilizare a
PFGE a fost izolarea secvenelor genomice mari inserate n vectorii de tip YAC.
Posibilitatea separrii intacte a cromosomilor a relevat faptul c majoritatea speciilor sunt
caracterizate de un polimorfism de lungime al cromozomilor (chromosome length polymorphism
CLP), proces datorat rearanjamentelor cromozomale din timpul mitozei i meiozei sau care apar
ca urmare a unor mutaii.
Termenul de PFGE rmane ns confuz din cauza numrului mare de acronime utilizate n
cursul anilor. Termenul original a fost utilizate de Schwartz i Cantor (1984) pentru orice sistem
de electroforez care utilizeaz cmpuri electrice alternative. Ulterior au fost atribuite diferite
denumiri unor sisteme PFGE care implic variaii ale geometriei electrozilor, omogenitii i
reorientrii cmpului electric. Marea majoritate a acestor nume sunt utilizate pentru a descrie un
anumit tip de design al aparatului (geometria electrozilor, circuitul electric, etc) i nu un anumit
mecanism de separare a moleculelor de ADN.
Diferenele majore dintre aceste sisteme se refer la: (1) posibilitatea obinerii de benzi
electroforetice clare; (2) viteza de separare a moleculelor de ADN; (3) rezoluia benzilor
electroforetice; (4) suprafaa de gel care permite o bun separare (Tab. 1).

Toate tehnicile PFGE pot fi utilizate pentru separarea moleculelor de ADN de pn la 1

Mb ; tehnicile difer ns prin gradul de dependen a mobilitii moleculelor funcie de masa lor,
prin claritatea i gradul de curbur a benzilor electroforetice rezultate n final.
Acronim
PFGE
OFAGE
TAFE
FIGE
CHEF
RGE
Rotaphor
Waltzer
PACE
ZIFE
ST/RIDE

Sistem de electroforez
Referine
Pulsed field gradient gel electrophoresis
Schwartz i Cantor (1984)
Orthogonal field alternating gel
Carle i Olson (1984)
electrophoresis
Transverse alternating gel electrophoresis
Gardiner i colab. (1986)
Field inversion gel electrophoresis
Carle i colab. (1986)
Contour clamped homogenous electric
Chu i colab. (1986)
field
Rotating gel electrophoresis
Serwer (1987)
Cross-filed gel electrophoresis
Southern i colab. (1987)
Rotating electrodes gel electrophoresis
Biometra
Cross field gel electrophoresis
Anand i colab. (1989)
Programmable autonomously controlled
Clark i colab. (1988)
electrodes
Zero integrated field electrophoresis
Turmel i colb. (1990)
Simultaneous tangential/ rectangular
Kolble i Sim (1991)
inversion decussate electrophoresis
Tab. 1. Acronime pentru sisteme PFGE ( dup Birren, 1993)

Parametrii care afecteaz sistemele PFGE

Sistemele de electroforez speciale de tip PFGE sunt extrem de sensibile la variaii ale diferiilor
parametrii, cum sunt: schimbarea timpului de migrare ntr-o anumit direcie sau cmp (nainte /
invers forward / reverse), tipul i concentraia agarozei, compoziia i concentraia tamponului
de electroforez (Tab. 2).
Parametrii controlai
gelul de electroforez

n Condiiile de migrare

Unghiul de reorientare
Omogenitatea campului electric

Intervalul de schimbare a
directiei de migrare
Gradientul de voltaj
Temperatura
Tipul de agaroz
Concentraia tamponului de
electroforez

Caracteristicile probelor
Concentraia ADN
Concentraia srurilor
Contaminarea cu proteine

Tab. 2. Factorii care influeneaz rezoluia i mobilitatea probelor* n sistemele PFGE

*Modificrile acestor parametrii influeneaz att viteza de separare a moleculelor de ADN ct i
intervalul de dimensiuni ale acestora pentru care poate fi aplicat tehnica respectiv.

Optimizarea parametrilor de electroforez n teniciile PFGE, urmrete asigurarea unei

bune separri a moleculelor de ADN cromozomal de diferite dimensiuni, precum i obinerea
unor benzi electroforetice cu o rezoluie ct mai mare. n acest scop sunt luate n consideraie
informaiile referitoare la :

Gradientul de voltaj reprezint diferena dintre potenialele electrice ale electrozilor din
sistemul de electroforez. Aceasta este de fapt fora care determin migrarea moleculelor de ADN
n gel. Se exprim n voli/ cm de gel. Alegerea unui anumit voltaj este critic pentru scala de
dimensiuni ale moleculelor de ADN care pot fi izolate i influeneaz viteza de migrare a
probelor. Pentru a obine rezoluii comparabile n geluri care au aplicate voltaje diferite, trebuie
schimbate att timpul de migrare ct i intervalul de schimbare a sensului de migrare.
Gelul de agaroz este obinut prin utilizarea unui tip special de agaroz (Agarose for
Pulsed Field Electrophoresis Running Gel - SIGMA). Concentraia agarozei influeneaz att
viteza de separare a moleculelor ct i scala de dimensiuni a moleculelor ce pot fi separate prin
electrocarotipare. Astfel, concentraii mari ale agarozei duc la scderea mobilitii moleculelor,
dar fr un efect clar asupra pattern-ului de separare a acestora. De fapt, rezoluia benzilor este
bun n cazul folosirii unei agaroze cu dimensiuni ale porilor de circa 120 nm (concentraie 1%).
Descreterea concentraiei agarozei este asociat cu : viteza de migrare mai mare ; separarea unor
molecule de dimensiuni mai mari ; benzile din gel sunt mai difuze. Astfel, pentru separarea unor
molecule de circa 1-2500 kb, se folosete agaroz de concentraie 1%, iar pentru dimensiuni mai
mari ale ADN se folete agaroz de concentraie 0.7 0.8%.
Tamponul de electroforez. Mobilitatea i rezoluia probelor de ADN sunt influenate de
tamponul de electroforez. Dei diferena ntre mobilitatea probelor n prezena diferitelor
tampoane folosite (Tris-acetat sau Tris-borat) este de numai circa 20%, aceast diferen este
semnificativ n cazul separrii moleculelor de ADN mai mari de 2 Mb. Viteza de migrare a
ADN este cu 25% mai mare n tampoane cu trie ionic mai mic - TBE 0.5X sau TAE 0.5X.
Forma cmpului electric. Unghiurile de reorientare. Se pare c unele aspecte legate de
forma cmpului electric sunt critice pentru reuita tehnicilor de electrocariotipare. Mai precis,
importante sunt unghiurile formate ntre cele 2 cmpuri electrice aplicate. Obinerea unei rezoluii
bune presupune reorientarea unghiurilor de migrare cu peste 100%. Sistemele standard sunt
proiectate pentru un unghi de 120o. Noile sisteme comercializate au posibilitate de variaie a
unghiului de reorientare. Unghiurile de reorientare mici (106o) permit separarea mai rapid a
moleculelor de ADN mai mari de 2 Mb.
Timpul de puls. n experimentele de electrocariotipare, moleculele de ADN migreaz n
geluri de agaroz n prezena unor tampoane cu trie ionic slab. Un cmp electric de 10 V/cm,
sau mai puin, este aplicat alternativ n dou direcii. Pentru a migra n gel, moleculele de ADN
trebuie s-i schimbe direcia de micare ca rspuns la schimbarea direciei cmpului electric.
Separarea moleculelor se datoreaz faptului c timpul necesar schimbrii direciei de migrare
depinde de mrimea moleculelor de ADN. De cele mai multe ori, timpul necesar reorientrii
moleculelor crete odat cu dimensiunea lor. Ca urmare, un parametru cheie n sistemele PFG l

constituie timpul de puls care reprezint timpul pentru care cmpul electric este aplicat ntr-o
anumit direcie nainte ca aceasta s fie schimbat.
n general, dimensiunea maxim a moleculelor de ADN care pot fi izolate depinde de
timpul de puls. Astfel, acesta variaz de la 0.1 sec pentru separarea de molecule cu dimensiuni
mai mici de 100 kb, pn la 1000 sec sau mai mult pentru molecule de circa 10 Mb.
Tipuri de tehnici PFGE
Tehnica OFAGE (ortogonal field alternation gel electrophoresis) introdus de Carle
i Olson n 1984, utilizeaz 2 perechi de electrozi astfel plasai nct produc cmpuri electrice n
diagonal la unghiuri mai mari de 90o. Datorit neomogenitii cmpului aplicat moleculele de
ADN migreaz pe o traiectorie curb departndu-se de centru, asigurnd totui apariia unor benzi
clare (Fig. 4). Actualmente tehnica a fost nlocuit cu altele mai performante.
n tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis) Olson i Carle (1985) - este
schimbat cu 180o polaritatea cmpului electric la fiecare ciclu cu un timp mai mare (aproape
dublu) pentru direcia spre anod. Relaia ntre viteza de migrare i dimensiunea moleculelor de
ADN este complex i, de regul, impune creterea timpului de schimbare a direciei de migrare,
proces numit ramping. La unele drojdii care prezint cromozomi de dimensiuni mari, cum este
cazul celor din genul Saccharomyces, s-a reuit separarea cromosomilor fr ramping (Spencer,
1989).
n Fig. 5 este reprezentat profilul (pattern-ul) cromozomal al unei tulpini de laborator de S.
cerevisiae, n comparaie cu o tulpina marker - S. cerevisiae YPH 80 (Sigma).
cromozomi

C
X
XI
V i VIII
IX
III
VI
I

Fig. 5. Pattern-ul electroforetic al cromozomilor de S. cerevisiae evdeniat

prin tehnica FIGE (godeuri: 1-5 - S. cerevisiae S288c, 6 - S. cerevisiae
YPH80)
Se observ separarea a 7 cromozomi din cei 16: I - 245 kb; VI - 280 kb; III - 360 kb; IX 450 kb; V i VIII (care co-migreaz datorit dimensiunilor apropiate) - 555 kb; XI - 680 kb.

Cea de-a 7-a band electrofoetic (notat cu C) este reprezentat de molecule de ADN
cromozomal care nc nu s-au separat n condiiile de desfurare a electroforezei.
FIGE este un sistem foarte simplu n care un dispozitiv pemite schimbarea periodic a
polaritii electrozilor ntr-un sistem convenional de electroforez. n sistemele FIGE se ine cont
de 4 parametrii: gradientele de voltaj pentru direcia nainte i invers (forward i reverse) i durata
de migrare a probelor n fiecare dintre cele 2 direcii. Pentru a impune migrarea nainte a probelor
de ADN, produsul dintre gradientul de voltaj i timpul de schimbare trebuie s fie mai mare
pentru direcia forward dect pentru direcia reverse.
Dup modul de selectare a parametrilor menionai, se cunosc mai multe tipuri de FIGE:
(i) standard FIGE -

este folosit acelai voltaj pentru cmpurile electrice forward i reverse cu

durate diferite; (ii) FIGE asimetric sau AVFIGE - pentru cele dou cmpuri electrice cu durate
egale sunt utilizate voltaje diferite; (iii) ZIFE - zero integrated field electrophoresis - pentru cele
dou cmpuri difer att durata ct i voltajele (Tab. 3)
Mobilitatea moleculelor de ADN n cmp electric funcie de mrimea lor este mai
accentuat n cazul FIGE dect al altor tehnici PFGE. Astfel, s-a constatat c n cazul aplicrii
unui timp de puls egal sau a unor voltaje egale pentru cele 2 direcii de migrare, moleculele de
dimensiuni mici i mari migreaz rapid, cele de dimensiuni intermediare migreaz mai ncet, iar
moleculele cu dimensiuni apropiate de limita de detectabilitate, sunt aproape imobile. Cu ct
proporia ntre timpii de puls sau voltajul celor 2 direcii (nainte i invers) de migrare descrete,
cu att crete dimensiunea moleculei de ADN pentru care se nregistreaz mobilitatea cea mai
sczut. Cu toate acestea, tehnica FIGE nu este eficient pentru separarea moleculelor cuprinse
ntre 1 10 Mb. Grosimea benzilor electroforetice crete substranial cu ct moleculele se apropie
de dimensiuni de ordinul Mb, ceea ce nseamn o rezoluie slab.
Sistemul
FIGE

GV - acelai
TS - diferit

AVFIGE GV - diferit
TS - acelai
ZIFE

GV - diferit
TS - diferit

Avantaje
Aparat ieftin, uor de
construit.
Rezoluie optim pentru
molecule de ADN de 150kb.
Rezoluie superioar;
fenomenul de inversie de
band este minim.

Dezavantaje
Comigrare pronunat a
fragmentelor (inversia de band);
benzi difuze; rzoluie de pan la 3
Mb.
Necesit aparatur care s asigure n
plus voltaje diferite pentru cele dou
direcii de migrare.
Timp de migrare mai lung; necesit
aparatur care s asigure n plus
voltaje diferite pentru cele dou
direcii de migrare.

Tab. 3. Comparaie ntre diferitele tipuri de sisteme FIGE (Birren, 1993)

GV - gradientul de voltaj pentru cele dou cmpuri (direcii) forward i reverse; TS - timp de schimbare a
direciei de migrare a moleculelor de ADN n cmp electric (timpul de aciune a cmpurilor electrice)

 Tehnica CHEF (contour clamped homogeneous electric fields) descris de Chu

(1989), Meese i Meltzer (1990) folosete o arie hexagonal n care sunt plasai muli electrozi mici
conectai n serie astfel nct cmpurile electrice se ntretaie n unghiuri de 120o. Benzile rezultate
sunt mai clare i pe acelai gel poate fi ncrcat un numr mare de probe. O variant a acestei
tehnici este RGE (rotating gel) n care se utilizeaz cmpuri electrice ntretiate omogene rezultate
prin rotirea gelului cu 90o la fiecare ciclu.
n TAFE (transverse alternating field electrophoresis) - Gardiner i Patterson
(1989) cmpurile electrice sunt transverse pe gel i, cu toate c sunt omogene producnd benzi
clare, intensitatea cmpului i unghiurile de orientare a moleculelor n cursul migrrii variaz n
lungimea gelului. Deoarece aparatul folosit este vertical, gelul este mai greu de manipulat i
dimensiunea lui este limitat.
Cel mai sofisticat i flexibil sistem utilizat la ora actual n electrocariotipare este
PACE (programmable autonomously controlled electrode). Acest sistem permite controlul
precis i varierea tuturor parametrilor, fcnd astfel posibil studiul relaiei dintre mobilitatea ADN i
timpul de schimbare a direciei de migrare, voltaj, unghiurile cmpurilor electrice aplicate,
concentraia agarozei i temperatura.

1. 1. 3. ANALIZA GENOMULUI EXTRANUCLEAR

(A) Structura ADN mitocondrial

O importan deosebit n studiile de genetic a drojdiilor o au analizele efectuate pe ADN
mitocondrial (ADNmt). Structura genetic a ADNmt este aproximativ aceeai pentru toate speciile
de drojdii, cu meniunea c ntre diferite genuri sau chiar ntre speciile aceluiai gen pot apare
diferene n ceea ce privete dimensiunea i chiar conformaia ADNmt.
Pentru Saccharomyces cerevisiae, ADNmt este reprezentat de o molecul de ADN
dublucatenar covalent nchis, complexat cu proteine histon-like, avnd o dimensiune de 25 kpb
i un coninut foarte ridicat de AT comparativ cu cel nuclear: 75 80% (Fig. 6).
La nivelul ADNmt exist gene codificatoare pentru:

subuniti ale citocrom oxidazei c - CO 2, CO 3, CO 1: oxi1, oxi2 i, respectiv, oxi3

apoproteina citocromului b: cyt b

3 subuniti - 6, 8 i 9 - ale complexului de sintez al ATP

ATP-aza mitocondrial

subunitile ologmicin sensibile ale ATP-azei: oli2, aap1

24 specii moleculare de ARN, grupate ntr-un cluster

specii moleculare ale ARN ribozomal (ARNr): ARNr 15S din subunitatea 30S i
ARNr 21S din subunitatea 50S

proteina din subunitatea ARNr 30S: var 1

ARN 9S complexeaz o protein formnd RNazaP cu rol n maturarea ARNt

Un fapt interesant este acela c la S. cerevisiae, subunitile complexului NADH

dehidrogenaz sunt codificate de gene nucleare i nu mitocondriale, ca n cazul altor specii de
drojdii.
ARNr 21S
CO2

oxi 1

var

ATPaza 9
Citocrom b

oli 1

CO3

oxi 2

box

ATPaza 6

par

oli 2
aap 1
oxi 3

ATPaza 8

ARNr 15S

CO1

exoni

introni

oli 2, aap 1 - gene care codifica pentru subunitatile

oligomicin - sensubile ale ATPazei

oxi 1, 2, 3 - gene care codifica pentru subunitatile

citocrom-oxidazei (CO 2, 3, 1)

box - codifica pentru citocrom b

par - functie inca nedeterminata
var - proteina a subunitatii ribozomale mici

Fig. 6. Harta genetic a ADN mitocondrial la S. cerevisiae

n genomul drojdiilor, intronii sunt rar ntlnii, fiind prezeni la mai puin din 5% dintre
gene, 2 dintre genele purttoare fiind ns situate la nivelul ADNmt: (I) oxi3; (II) cob box.
Codul genetic mitocondrial prezint abateri de la cel universal, 3 codoni fiind tradui
diferit :

Codon

Codul genetic universal

Codul genetic mitocondrial

UGA

STOP

Trp

AUA

Ile

Met

CUA

Leu

Thr

Au fost determinate masele moleculare ale ADNmt a unor specii de drojdii:

Saccharomyces cerevisiae 15.4 X 106 Da - 54 X 106 Da; Schizosaccharomyces pombe - 12.5 X
106 Da; Kluyveromyces lactis - 24 X 106 Da; Yarrowia lipolytica - 29 X 106 Da; Williopsis
(Hansenula) mrakii 36.4 X 106 Da. Pentru toate aceste specii ADNmt se prezint sub form
circular covalent nchis (CCC), cu excepia lui W. mrakii pentru care ADNmt este linear. Pentru
diferite specii de Candida s-au determinat dimensiunile ADNmt ca fiind cuprinse ntre 19 kpb
pentru C. glabrata i 52 kpb pentru C. tropicalis. De asemenea, majoritatea speciilor i tulpinilor de
Candida prezint ADNmt sub form covalent circular nchis (CCC), numai pentru puine tulpini
ADNmt se prezint sub form linear.
Bak i colab. (1969) au stabilit coninutul n guanin i citozin a ADNmt pentru 5 specii
de Candida, cu minima de 13.9% mol GC pentru C. kefyr i maxima de 26.1% mol GC pentru C.
zeylandoides i pentru Sacch. cerevisiae la care % mol GC a fost de 12.7%. n Fig. 7 este
reprezentat o schem general de comparaie ntre diferite specii de Candida fiind urmrite
dimensiunile ADNmt i coninuturile n GC a ADNmt i ADN nuclear.

Fig. 7. Comparaie ntre caracteriticile ADNmt de la diferite specii

aparinnd genului Candida i Lodderomyces

(B) ADN plasmidial 2 m / 2 m like

n nucleul unor tulpini de Saccharomyces cerevisiae a fost determinat prezena unui ADN
extracromosomal, reprezentat de ADN plasmidial 2m, denumit astfel dup dimensiunea
conturului su. Plasmida este mpachetat n cromatina din nucleu i se replic numai o singur dat
n cursul unui ciclu celular, n timpul fazei S, independent de materialul genetic cromosomal.
ADN plasmidial 2 m are o dimensiune total de 6318 pb i este prezent n 60 - 100 copii /
celul, numrul de copii crescnd cu gradul de ploidie. Plasmida reprezint un tip de "selfish DNA",
prezena sa nefiind asociat cu exprimarea unor caractere fenotipice deosebite, ci doar cu un aspect
uor zimat al coloniilor i cu un timp de generaie de 1.5 3% mai mare pentru celulele gazd
(notate cir+), comparativ cu celulele care nu prezint acest tip de ADN (notate ciro).
Din punct de vedere structural plasmida 2 m prezint 2 regiuni unice (U1 i U2) de 2774
pb i, respectiv, 2346 pb, separate de 2 regiuni cu secvene invers repetate (IR) de 599 pb (Fig. 8).

Fig. 8. Structura plasmidei 2 m de la Saccharomyces cerevisiae

Cele dou regiuni unice cuprind secvenele:
REP1 i REP2 care codific pentru proteine necesare segregrii plasmidei i reglrii
expresiei genice;
REP3 (STB) cu rol n segregarea plasmidei i meninerea numrului de copii;
ARS originea replicrii plasmidei ;
FLP1 codific o recombinaz (Flp1p) care se leag specific la nivelul unei secvene din
structura locusului FRT.
Locusul FRT este plasat la nivelul regiunii IR i este format din 3 secvene de cte 13 pb
cu orientare invers i o secven core de 8 pb la capetele creia se leag proteina Flp1p prin
intermediul unui rest de Tyr. Complexul format din FRT i proteina Flp1p apare i are rol n
procesul de recombinare din timpul replicrii ADN plasmidial.
n afar de plasmida 2 m de la S. cerevisiae, pn n prezent au fost identificate 6 structuri
plasmidiale similare (plasmide 2 m - like), numai la un numr redus de specii de drojdii. Toate

aceste plasmide au dimensiuni mici (4647 6615 pb) i conin 2 regiuni cu secvene invers repetate
care mpart genomul n 2 pri aproximativ egale, cu secvene unice (Tab. 4).
Toate aceste plasmide conin 3 sau 4 regiuni codificatoare dintre care una pentru o
protein cu mare omologie de secven cu Flp1p i care este implicat n procesul de recombinare
dintre regiunile invers repetate. Toate plasmidele conin cel puin o secven ARS, fie la nivelul
uneia dintre regiunile unice, fie n imediata lor vecintate (Fig. 9).
Dei principala aplicabilitate a plasmidei 2 m o constituie utilizarea secvenei ARS
uneori, alturi de secvenele REP1, REP2 i REP3 (STB) n construirea vectorilor de tip shuttle
pentru drojdii, determinarea prezenei sale sau a plasmidelor 2 m like, poate fi folosit ca un
indiciu privind posibila apartenen a unei tulpini necunoscute la una dintre speciile la care au
fost identificate aceste forme de ADN extracromosomal.
Dimensiune (pb)
U1
U2
IR
T
2654
1679
959
6251
pSR
Zygosaccharomyces rouxii
pSB1
2300
2900
675
6550
Zygosaccharomyces bailii
pSB2
2457
2004
477
5415
Zygosaccharomyces bailii
pSB3
3168
2665
391
6615
Zygosaccharomyces rouxii
pSM1
2552
2160
352
5416
Zygosaccharomyces fermentati
pKD1
2137
1928
346
4757
Kluyveromyces drosophilarum
2774
2346
599
6318
2 m
Saccharomyces cerevisiae
U1 regiunea unic mare; U2 regiunea unic mic; IR regiunea invers repetat; T ntreaga plasmid.
Plasmida

Sursa de izolare

Tab. 4. Tipuri de plasmide 2 m like ntalnite la drojdii.

n ceea ce privete folosirea plasmidelor 2 m / 2 m - like n scopul stabilirii relaiilor
filogenetice dintre diferitele specii de drojdii gazd, s-a observat c nu exist o corelare ntre
acestea i relaiile filogenetice determinate de similitudinea secvenei de baze a plasmidelor.
Astfel, plasmidele pSB3 i pSR1 sunt cel mai ndeprtate plasmide dac se ia n consideraie
gradul de omologie ntre secvenele REP1; cu toate acestea, ambele plasmide au fost izolate, se
menin i se propag la fel de bine n tulpini de Z. rouxii.

Fig. 9. Structura tipurilor de plasmide 2 m like ( dup Broach, 1991)

(C) Sistemul killer

Producerea de ctre unele specii de drojii de exotoxine cu aciune antimicrobian mediat
de receptori membranari, reprezint un fenomen relativ bine cunoscut, descris pentru prima dat
la S. cerevisiae, de Bevan i Makower (1963). Capacitatea acestor exotoxine de a determina
moartea celulelor aparinnd aceleai specii sau unor specii congenice, le-a conferit denumirea de
toxine killer. Sinteza lor este asigurat de: (a) elemente genetice citoplasmatice, cu transmitere
non-Mendelian, virus-like particles (VLPs), al cror material genetic este reprezentat de
molecule de ARN dublu-catenar (Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii,
Hanseniaspora uvarum); (b) plasmide ADN lineare (Kluyveromyces lactis, Pichia acaciae,
Pichia pastoris); (c) gene nucleare (numr redus de tulpini de Saccharomyces cerevisiae; tulpini
aparinnd speciilor: Pichia farinosa, Williopsis mrakii, Pichia klyveri).
Actualmente, cel mai bine studiat este sistemul killer de la Saccharomyces cerevisiae
(Fig. 10). Tulpinile cu potenial killer aparinnd acestei specii sunt incluse n trei grupe
principale: K1, K2 i K28. Dei aceste toxine difer prin compoziia de aminoacizi, structur i
modul de aciune, prezint mecanisme de sintez, procesare i secreie similare. Celulele
aparinnd aceluiai grup sunt rezistente reciproc la toxina secretat, pe cnd celulele de drojdie
aparinnd la grupe diferite (sau chiar specii diferite) sunt, de regul, sensibile reciproc. Astfel,
spre exemplu, toxina sintetizat de o tulpin slbatic de Candida determin moartea celulelor
aparinnd speciilor C. glabrata, P. anomala, K. lactis, P. membranefaciens, Rh. rubra i S.

cerevisiae. Celulele productoare de toxin killer sunt notate K+, celulele sensibile la toxin K, iar cele care nu prezint caracer killer - K0.
Sinteza toxinelor este asigurat de prezena n citoplasm a dou tipuri de particule VLP:
L-A i M.
particule L-A
denumite i particule helper;
au diametrul de 39 nm, iar prezena lor nu determin moartea celulei gazd, comportndu-se
asemntor virusurilor latente, fr ciclu litic;
materialul genetic este reprezentat de o molecul de ARN dublu-catenar de 4.6 kb, care se
replic asemntor retrovirusurilor;
conine informaia genetic necesar sintezei proteinelor capsidale i unei ARN polimeraze,
necesare pentru ncapsidarea i replicarea att a particulelor L-A, ct i M.
particule M
trei clase: M1, M2 i M28, responsabile de sinteza toxinelor killer specifice (K1, K2 i,
respectiv, K28) i a factorului de imunitate;
particule virale cu aceeai dimensiune ca L-A (39 nm) i al cror material genetic este
reprezentat de mai multe molecule de ARN dublu-catenar de dimensiuni mici: M1 1.8 kb, M2
1.5 kb i M28 1.9 kb.

Fig. 10. Sistemul killer la S. cerevisiae structur i mod de aciune

n literatura de specialitate au fost descrise i dou grupe de gene nucleare care intervin n
meninerea i replicarea particulelor L-A i M: (1) 8 gene superkiller SKI1 SKI8 cu rol n

scderea numrului de copii al M1 i n represarea procesului de traducere a ARNm al M1 i LA; (2) 30 de gene maintenance of killer MAK importante n transmiterea i meninerea
fenotipului killer, acionnd, n principal, la nivelul particulelor M i, mai puin, asupra L-A
(genele MAK3, MAK10 i PET18).
Deoarece fenotipul killer este caracteristic numai unui numr redus de specii de drojdii i,
respectiv, numai anumitor tulpini aparinnd acestor specii, poate fi utilizat i drept criteriu de
identificare taxonomic.