Curs de Biofizic

V rugm: gnditi!

8
Disciplina de Biofizic
i Fizic medical
Prof. dr. Cipriana Stefnescu
ef lucr. dr. Irena Grierosu

Microscopia
optic

 Istoric
Microscopia

optic:
- pri componente ale microscopului optic,
- formarea imaginii,
- caracteristici fizice ale microscopului

Tipuri

de microscopie optic

Rezoluie minim a
unui microscop optic
este de aproximativ
0,2 m, dimensiunea
unei bacterii mici.
Microscopul optic
poate mri n mod
eficient de
aproximativ 103 de
ori dimensiunea unui
obiect.
Microscopul
electronic poate mari
de 104 ori imaginea
unui microscop optic,
de 106 ori imaginea
reala.

Istoric - Primele microscoape optice

Exemplu de evoluie a microscopului

(firma Nikon)

100 ani

 Microscopul

optic:

Lumina traverseaz preparatul

Imaginea este mrit prin intermediul
lentilelor (lentile convergente, din sticl)

Oc

R
Ob
Pl
Mv
mv
c, d

Parti importante ale microscopului optic

(Oc = lentila ocular; Ob = lentila obiectiv; R =
sistem revolver; Mv = macroviza; mv = microviza; c
= condensor;
d = diafragma; l = lampa)

Formarea imaginii la microscopul

optic

OBIECTIV

OCULAR

Condensorul

Ocularul si sistemul de obiective

Caracteristici fizice ale microscopului:

REZOLUTIA
P = 1/d

obiectiv

d = /2n sin u = /2a

Apertura numeric:
a = n sin u
Pentru a creste P (descreste d):
-

descreste (390 - 720 nm)

creste n

MRIREA

u
?

mediu cu
indice n

preparat

lamel\
lam\

Microscopia cu contrast de
faz

Diviziunea celular.
Creterea contrastului prin
mperecherea undelor (ntrziate
la ieirea din preparat);
disc de faza

Premiul Nobel
in Fizica in 1953
Frederik Zernike

Prezinta o lama
sfert de unda
(disc de faza)
care transforma
defazajul luminii
imperceptibil
ochiului uman
intr-o variatie de
intensitate
perceptibila
vizual
(transforma deci
un contrast de
faza in contrast
de amplitudine).
Permite
observarea
celulelor
necolorate.

Microscopia de contrast prin

interferen (DIC sau microscopul
Nomarski)
- Utilizeaza lumina polarizata
pentru cresterea contrastului

Microscopia polarizant

- lumina polarizata
- 2 nicoli
- Cruce de Malta
Pune in evidenta fenomenul de
birefringenta al structurilor, expresie
a anizotropiei acestora.

Microscopia de fluorescen
- utilizeaz markeri fluoresceni -

Principiul fenomenului de
fluorescen:
1. Energia este absorbit de
un atom
2. Electronul sare pe un nivel
superior de energie.
3. Ulterior, electronul revine
la starea initiala si emite un
foton fenomenul de
fluorescen

Fluorescenta si fosforescenta
Absorbtia - timp de 10-15 s
Relaxarea (emisia de lumina
-prin reintoarecerea pe nivelul
fundamenal) - 10-13 s 10-11 s
fluorescenta.
Relaxarea fara emisia de
fotoni = conversie intern
Relaxarea la nivelul
fundamental cu trecerea
succesiva prin etape
intermediare interne ce duc la
prelungirea timpului de viata in
stare excitata = fosforescenta

Diagrama Perrin- Jablonski

Deplasarea Sokes
(diferenta dintre lungimea undei de excitare si cea fluorescenta)

substantele pentru a fi fluorescente trebuie sa

contin niste grupari moleculare numite
fluorofori sau cromofori

aceste grupari pot fi prezente in proba

(naturale), sau pot fi induse artificial (in urma
unor reactii chimie, electrice, etc)

O sursa UV.
Ecran filtrant
care lasa sa
treaca doar
radiatiile UV
excitatoare ale
fluorescentei.

celule epiteliale

GFP - Green Fluorescent Protein

238 aa, 26.9 kDa
Nobel in Chimie 2008

Vezi cursul:
MODELE

The Nobel Prize in Chemistry 2008

was awarded jointly to Osamu
Shimomura, Martin Chalfie and
Roger Y. Tsien "for the discovery
and development of the green
fluorescent protein, GFP".

Aequorea victoria

Premiul Nobel in
Chimie 2014
Eric Betzig,
Stefan W. Hell si
William E. Moerner

Premiul Nobel in
Chimie 2014
Eric Betzig,
Stefan W. Hell si
William E. Moerner

Ultramicroscopia
(microscopia cu fond
intunecat)

Iluminarea este din lateral.

Condensorul este de tip cardioid sau
paraboloid.
Se bazeaza pe fenomenul Tyndall
(de difuzie a luminii).

Fenomenul Tyndall

RECAPITULAR
E

Tipuri de microscopie i imaginea

TEHNIC

REZULTAT

(a) Microscopie optic (preparat nefixat, necolorat).

Lumina trece prin preparat.
Dac celula nu este colorat natural sau artificial,
imaginea are contrast slab.
[Punctele (a)(d) reprezint o celul epitelial jugal.]
50 m

(b)

Microscopie optic (preparat colorat).

Colorarea mrete contrastul, dar necesit fixarea
preparatului.

(c) Microscopie optic cu contrast de faz. Crete

contrastul n celule nefixate, amplificnd diferenele
n densitatea structurii de vizualizat; permite
vizualizarea unor structuri fr fixare, colorare.

(d)

Microscopie de contrast prin interferen

Ca i microscopia optic cu contrast de faz dar utilizeaz
lumina polarizat; imaginea apare n relief, 3D.

(e)

Microscopia de fluorescen. Utilizeaz markeri

fluoresceni pentru vizualizarea unor structuri
intracelulare. Ex.: celul din peretele arterial.

(f)

Microscopie confocal. Utilizeaz lumina LASER i

markeri fluoresceni, pe o seciune care apare cu
un contrast mult mai bun dect n microscopia de
fluorescen. Celule nervoase (verde), celule de
susinere (rou), suprapunerea acestora (galben).
Jos, microscopie de fluorescen (imagine
neclar, preparat mai gros).

50 m

50 m

Examen
de
Biofizic
a

22 iunie

Bibliografie selectiv

Aurengo A., Grmy F., Petitclerc T. - Biophysique, Mdecine-Sciences Flammarion, Paris, 1998.
Dimoftache C., Herman S. Principii de Biofizic uman, Ed. Universitar Carol Davila,
Bucureti, 2003.
Duncan G, Physics in the Life Sciences, Blackwell Scientific Publications, The Alden Press,
Oxford, 1990.
Durand A., Escany J-M., Naoun A. La biophysique en 1001 QCM, Ed. Ellipses, 2004.
Goldfarb D. Biophysics DeMYSTiFieD. McGraw-Hill Companies, 2011.
Herman S. Aparatura medical. Principiile fizice ale aparaturii medicale
moderne,Ed.Teora,Bucureti, 2000.
Nlting, Bengt. Methods in Modern Biophysics. Springer. 2003.
Pascu M., Rusu V., Vasile C., Spectrometria in IR in medicina si farmacie, Editura BIT, 2003.
Popescu A., Bazele Opticii, Ed. Universitii Al. I. Cuza, Iai, 1988.
Rusu V., Baran T., Brniteanu D. D. - Biomembrane i patologie, vol. I, Ed. Medical, Bucureti,
1988, 63-92, 286-292.
Rusu V. Note de curs. 2010.
Rusu V. Nobel Retrospectiv 1905 1995 Laureaii premiului pentru fiziologie i medicin,
Ed. Omnia, Iai, 1996.
Rusu V si colab. Lucrri practice i demonstraii de Biofizic i Fizic Medical, Ed. Gr. T.
Popa Iai, 2003.
Rusu V. Dicionar medical, Ed. Medical, Bucureti, ed. IV, 2011.
Skoog D. A., Holler F. J., Nieman T. A., Principes danalyse instrumentale, De Boeck Universit,
Paris, 2003.
tefnescu C, Rusu V. Biophysics and Medical Physics: An Introduction, Ed. Tehnopress, 2008.