Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC)

Introducere
Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC [108]) acoper azi, n
proporie
aproximativ 80%, analiza substanelor moleculare: organice, organo-metalice i
anorganice
inclusiv compuii foarte polari sau labili termic precum i compuii cu mas
molecular
ridicat (naturali sau sintetici). De aceea, mpreun cu cromatografia de gaze
constituie un
punct de sprijin important n analizele chimice moderne.

Aparatura:
Sistemul cromatografic va fi conectat si pregatit in vederea utilizarii. Schema
bloc a unui cromatograf de lichide este redata in figura de mai jos:

Figura 1. Schema generala al unui sistem de cromatografie lichida

Rezervor de solventi:Un cromatograf de lichide este echipat cu unul sau mai
multe rezervoare de sticla de capacitati diferite.
Faza mobila se filtreaza si se degazeaza inainte de folosire. Filtrarea se face la vid
prin trecerea eluentului printr-o membrana de teflon cu porii de 0,2 m.
Degazarea se efectueaza prin ultrasonare timp de 15 minute. Inaintea intrarii
eluentului in pompa el este filtrat inca odata de catre filtrul de otel inoxidabil
existent la capatul conductei de admisie in pompa.
Pompa este considerat una dintre cele mai importante componente ale HPLC
deoarece permite realizarea unui debit constant al eluentului prin ntreg
sistemul: injector,

coloan, detector mrind deosebit de mult viteza separrii. ntr-un cromatograf

de lichide pot
exista una sau mai multe pompe.
Valva de injectie :Valva de injectie de inalta presiune este prevazuta cu o bucla
de injectie de 20 L. Aceasta bucla se umple prin injectarea unui exces de solutie
de analizat (minim 2-3 ori volumul declarat al buclei). Aceasta metoda de injectie
ofera o introducere precisa a unui volum constant de proba.
Coloana cromatografica:Coloana cromatografica este piesa cea mai
importanta dintr-un cromatograf, fiind sediul procesului de separare
cromatografica. Corpul coloanei este confectionat din otel inoxidabil cu
dimensiunile 4,6 mm (diam. intern) x 200 mm (lungime), fiind umplut cu faza
stationara chimic legata (particule de silicagel de 5 m acoperiti cu un strat
monomeric de octadecilsilan (C18)).
Se cunosc pn n prezent mai multe mecanisme de separare prin coloane, care
depind
mult de fazele mobil i staionar. Mai exact, depind de natura fenomenului
fizico-chimic pe
care se bazeaz retenia difereniat i separarea
Faza staionar
Silicagelul (SiO2) este considerat materialul cel mai important utilizat ca faz
staionar. Acesta a devenit, n ultimii 20 de ani, doar suportul adevratelor faze
- fazele
chimic legate - ceea ce nu schimb importana sa. Silicagelul s-a obinut la
nceput n form
granular, neregulat, apoi n form sferic.
Faza mobil
Faza mobil sau eluentul n LC nu reprezint un mediu inert ca gazul purttor
din GC.
De aceea alegerea fazei mobile se face aici n perfect concordan cu faza
staionar. Astfel
faza mobil difer destul de mult n funcie de tipul interaciunilor componentelor
separate cu
faza staionar din coloan. Singurele caracteristici generale sunt urmtoarele:
(1) faza
mobil trebuie s aib o viscozitate cobort, (2) aceasta trebuie s dizolve bine
componentele, (3) nu trebuie s afecteze funcionarea coloanei i (4) trebuie s
permit
funcionarea detectorului.
Tehnica HPLC s-a dezvoltat o dat cu perfecionarea detectorilor. Am amintit c
detectorii n cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la
ieirea eluentului
dintr-o coloan i care pot nregistra continuu substanele separate de ctre
aceasta. Deci
detectorii constituie acea parte a instrumentaiei care permite s se observe
modul cum
decurge separarea prin coloan fr a se vedea componenii propriu zii ci doar
semnalul lor.
Detectori spectrofotometrici n UV-VIS

Acest grup de detectori sunt cei mai folosii detectori pn n prezent, att n LC,
ct i
n HPLC. Pentru a putea fi utilizai, compuii separai cromatografic trebuie s fie
colorai adic s absoarb lumina pe domeniul de lungimi de und al detectorului. Un
mare avantaj al acestor detectori este faptul c sunt insensibili la micile variaii
dedebit i temperatur.
Detectorii policromatici mai frecvent utilizai n cromatografele HPLC
moderne
permit i selectarea lungimii de und la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra
electronic
absorbana celulei la mai multe lungimi de und simultan
Detectori refractometrici
Detectorii refractometrici, au la baz legile refraciei luminii. Principiul de
funcionare al acestor detectori are la baz legea lui Fresnel - de transmitere a
luminii prin
medii transparente avnd un indicele de refracie dat. Astfel, un fascicul luminos
(mono sau
policomponent) trece printr-o celul cu dou compartimente unul coninnd doar
eluentul pur
iar cellalt faza mobil care prsete coloana