PATOLOGIE MOLECULARA

METODE DE DETECTARE A MODIFICARILOR GENETICE IN PATOLOGIA

TUMORALA OSOASA

RT-PCR

Reprezinta metoda de electie ( dupa unii autori) de detectare a translocatiilor

cromozomiale. Aceasta tehnica are doua etape. In prima etapa, AND-ul
complementareste sintetizat din ARN utilizand enzima revers transcriptaza. In a doua
etapa ADNc este amplificat prin PCR conventional utilizand exoni primary pentru
secventele caracteristice ce flancheaza punctele de rupere ale translocatiei. Produsele de
amplificatie sunt separate prin electroforeza in gel de agaroza. Optional, continutrul AND
din gelul de agaroza poate fi transferat pe o membrane de nilon si incubat cu probe de de
ADN complementare secventei presupuse ( Southern Blot). Aceasta metoda determina o
crestere a sensibilitatii si specificitatii. Atentie: este importanta utilizarea martorilor
pozitivi si negative ( cu apa, fara RT). Punctele de rupere ale translocatiei sunt in general
la nivelul secventelor intronice; totusi ele nu sunt situs specifice. Ca rezultat, structurile
de fuziune generate la nivel de ADN genomic sunt mai putin predictibile decat cele de la
nivel ARN, unde este present un numar constant de exoni din fiecare gena. De aceea
ARN este materialul preferat de detectie in sarcoame. Desi RT-PCR se realizeaza si din
piesele fixate in formalina si incluse la parafina, cea mai buna sursa de ARN de calitate il
constituie fragmentele inghetate.

FISH

Termenul de hibridizare se refera la procesul de asociere a doua secvente complementare

de AND si ARN. Aceste probe sunt marcate cu molecule fluorescente permitand
detectarea secventei de interes. Aceasta tehnica permite detectarea fuziunilor cand
probele gena-specifice sunt utilizat6e pentru fiecare gena implicate in fuziune, sau
alternative, detectarea rearanjamentelor genice ale unei singure gene( eg. EWS) utilizand
probe ce flancheaza punctele de rupere ale translocatiei denumite probe break-apatrt.
Avantajul FISH in reprezinta obtinerea de rezultate valide cu o cantitate redusa de tesut
sau cand nu exista decat material inclus la parafina. Totusi, dezavantajul acestei tehnici il
constituie necesitatea unui microscop cu fluorescenta. Tehnica CISH in care
imunofluorescenta este inlocuita cu o molecula cromogenica are o performanta similara
FISH.

Mutatii cu semnificatii diagnostice.

Translocatii specifice si tipurile tumorale associate.

Sarcomul sinovial prezinta o translocatie cromozomiala caracteristica, t (X;18), care

rezulta din fuziunea genei SS18 (SYT ) cu genele SSX la nivelul cromozomului 18.
Genele SSX prezinta doua copii diferite SSX1 si SSX2 localizate in cele doua subregiuni
ale cz.Xp11 (23 si respectiv 21). Fuziunea codifica un factor de transcriptie nuclear
aberant ce altereaza remodelarea cromatinei inducand probabil modificari in patternurile
de expresie genica . Transcriptiile pot fi detectate in aproape toate sarcoamele sinoviale
prin RT-PCR. Sarcoamele sinoviale reprezinta un exemplu clar de corelatii ce pot exista
intre tipul de transcriptie , profnostic si fenotip tumoral.

85% din pacientii cu tumora Ewing incluzand PNET au fuziuni EWS-FLI1; fuziunile
EWS-ERG sunt prezente in 10% din cazuri si 3% corespund fuziunilor intre EWS si alti
membri ai familiei de factori de transcriptie ETS. Acestea sunt caracteristice pentru acest
tip de neoplazie deoarece studiile PCR effectuate pe alte tumori cu cellule mici rotunde
ce intra in dg dif nu prezinta aceste fuziuni genice. In plus fata de factorii de prognostic
folositi de obicei in clinica ( stadiul, localizarea tumorii primare, dimensiuni, varsta si
raspuns terapeutic) studii recente au evaluat contributia heterogeneitatii moleculare in
prognosticul tumorii Ewing. Acest neoplasm prezinta cel putin 18 posibilitati structurale
de fuziune genica. Doua surse posibile de variabilitate exista. Pe de o parte , partenerul de
fuziune ( LI1, ERGETV1, E1A si FEV) sip e de alta parte localizarea punctelor de rupere
la nivelul genelor implicate. S-a stability ca pentru tumora Ewing localizata, pacientii
care exprima transcriptia cea mai frecventa ( fuzionarea EWS-exon7 la FLI1-exon6) au
prognostic mai bun decat aceia cu alte tipuri de transcriptie.

Translocatiile nu apar numai in tumorile maligne ci si in leziunile pseudoneoplazice cum

ar fi chistul osos anevrismal in care t( 16;17) genereaza fuziunea genelor CDH11-USP6.

Intelegerea mecanismelor moleculare implicate in geneza diferitelor neoplazii osoase

poate avea consecinte importante in managementul therapeutic al pacientilor.