Separarea doxiciclinei i a produilor si de degradare prin metoda de analiz HPLC

Masterand: Simona tefanovici Specializarea: Chimia produselor cosmetice i farmaceutice

1. Introducere n ultimii ani s-a remarcat o cretere a utilizrii doxiciclinei n practica medical, fa pt care nu se datoreaz n principal proprietilor sale antibacteriene, ci efectului su inh ibitor asupra unui grup de enzime;astfel, ea e mentionat ca matrice a metaloproteinazelo r. Aceste metaloproteinaze sunt enzime care intervin n cazurile inflamatorii, precum: gingi vite i ulceraii aftoase. Doxiciclina, ca medicament din clasa tetraciclinelor, se distri buie uor n marea majoritate a esuturilor, cum ar fi: dentina, smalul dinilor neerupi i gingii, m otiv pentru care s-a dovedit a fi eficient n tratamentul afeciunilor inflamatorii ale g urii.

Determinarea prin HPLC a doxiciclinei i a produilor si de degradare s-a dovedit a fi relativ dificil. Muli dintre aceti produi de degradare sunt epimeri , deci se aseamn structural foarte mult cu doxiciclina, dar i ntre ei (fig.1a i b), aprnd constant pro bleme n ceea ce privete separarea lor. O alt problem de separare prin HPLC apare atunci cnd sunt folosite coloane ODS, deoarece timpul de retenie e mare din cauza hidrofobicitii cr escute. Totui aceast problem poate fi ocolit dac faza mobil e suficient de acid astfel nct permit ionizarea tetraciclinei, lucru posibil prin creterea hidrofilicitii i reducere a timpului de retenie. Pentru determinarea tetraciclinelor n formulele farmaceutice, s-au utilizat mult e metode HPLC, folosind silica gel, grafit poros, faze staionare pe baz de silice sa u polimeri. Majoritatea acestor metode sunt complexe, necesit un timp de analiz ndelungat , une le sunt foarte scumpe, iar altele nu pot reda separarea tetraciclinelor de produii lor de degradare.

n acest articol a fost descris o metod HPLC simpl i selectiv pentru separarea doxiciclinei i a unor produi ai si de degradare: 6-epidoxiciclina i metaciclina. Ace ast metod ndeplinete cerinele Farmacopeei Europene n privina selectivitii pentru aceste substane. ncercri anterioare de separare a celor doi produi de degradare au ntmpinat ari dificulti. Astfel, metoda propus este adecvat pentru evaluarea calitativ a acestor co mpui n produsele farmaceutice.

Figura 1. a b

doxiciclina i epimerii si

produi de degradare ai doxiciclinei

2. Experimente 2.1. Reactivi Ca reactivi s-au utilizat doxiciclina, metaciclina i 6-epidoxiciclina. De asemen ea, s-au mai folosit acetonitril, metanol i acid percloric. Toi reactivii utilizai sunt de p uritate analitic. 2.2. Cromatografie. Aparatur S-au folosit: un sistem HPLC cu separare termic a produilor, detector UV, un Integrator Chromjet i un autosampler Merck. Coloanele folosite n vederea separrii s unt: Hypersil ODS C18, C8 de diferite diametre. Lungimea de und a detectorului a fost setat la 350 nm, iar debitul stabilit pentru separarea doxiciclinei i a produilor de degrad are este de 1.0 ml/min. Compoziia fazei mobile este: acetonitril : ap : acid percloric = 26:74 :0.25, echilibrat la pH 2.5 cu NaOH 5M. Probele i standardele au fost dizolvate n faza mob il, iar 20 l de prob au fost injectai la temperatura camerei n sistemul HPLC. 2.3. Prepararea soluiilor

Soluiile test de doxiciclin (40g-ml), metaciclin (7ug/ml) i 6-epidoxiciclin (7ug/ml) au fost preparate prin dizolvarea lor in faza mobil. Standardele de cali brare (3-40 g/ml pentru doxiciclin i oxitetraciclin i 0.5-7 g/ml pentru metaciclin i 6epidoxiciclin) au fost preparate din soluiile stoc, dup cum urmeaz: s-au cntrit cu precizie 0.020 g doxiciclin HCl i 0.003 g 6-epidoxiciclin i metaciclin, fiecare ntr-u pahar de 200 ml. Se dizolv n aproximativ 100 ml faza mobil, dup care se completeaz cu faza mobil pn la un volum prestabilit. Aceasta este solutia S, care e apoi diluat corespunztor. Soluia SI: 10 ml de soluie S diluat la 25 ml, soluia SII: 15 ml de SI d iluat la 25 ml, SIII: 15 ml de soluie SII diluat la 25 ml, SIV: 10 ml SIII diluat la 25 m l, SV: 5 ml SIV diluat la 10 ml. Probele au fost filtrate printr-o sering cu filtru de nylon c u diamentru foarte mic, nainte de a fi injectate n sistemul HPLC.

3. Rezultate i discuii 3.1. Cromatografie

A fost posibil o separare eficient a metaciclinei i 6-epidoxiciclinei, att una fa de alta,ct i fa de doxiciclin, utiliznd doar o coloan Luna de 5 m C8 250x4.6 mm. Prin aceast metod, pentru compuii investigai s-au obinut valori ai timpilor de retenie , c re sunt aproximativ la fel cu cei obinui prin metoda oficial a Farmacopeei Europene ( 30 minute). De asemenea i cerinele de rezoluie i simetria picurilor sunt ndeplinite de a ceast metod (fig.2 si tab.1).

Figura 2. Exemplu de cromatogram: pic1 doxiciclina.

metaciclina, pic2

epoxiciclina, pic3

Tabel 1. Timpi de retenie si rezoluie Substan Timp de retenie (min) Rezoluie Metaciclin 22.22

6-epidoxiciclin 23.30 1.2a Doxiciclin 25.16 1.9b

a b

ntre metaciclin i 6-epidoxiciclin ntre 6-epidoxiciclin i doxiciclin

Principalele avantaje ale acestei metode fa de cea oficial sunt timpul considerabi l redus necesar efecturii analizei i faptul c probele sunt mai uor de preparat. Studii preliminare asupra capacitii de separare prin aceast metod descris, dar pentru alte tetracicline, arat o separare bun pentru toi compuii investigai (fig.3), ceea ce indic faptul c metoda poate fi aplicat n analiza diferitelor tetracicline. Figura 3. Exemplu de cromatogram: pic 1 tetraciclina, pic 2 demeclociclina, pic 3 clortetraciclina, pic 4 minociclina, pic 5 metaciclina, pic 6 6-epidoxiciclina, pic 7 doxiciclina

3.2. Faza mobil 3.2.1. Compoziia fazei mobile

Au fost testate compoziiile pentru faza mobil ce conine o soluie tampon de acid percloric, ap si acetonitril in rapoarte diferite (30-50%), ajungndu-se la concluz iile: cu ct faza mobil conine mai mult soluie tampon, cu att timpul de retenie al tetraciclinelor crete, se obine o rezoluie mai bun, dar se observ i o lrgire a picurilor. n urma te mai multor compoziii pentru faza mobil, a fost selectat raportul de 26% pentru ace tonitril, ca fiind ceea ce permite separarea doxiciclinei i a produilor si de degradare. 3.2.2. Faza mobil. pH n alegerea valorii pH-ului fazei mobile, un rol important au avut trei factori: n primul rnd, doxiciclina trebuie s se prezinte sub forma sa ionizat pentru a putea crete tim pii de retenie, prin urmare, pH-ul fazei mobile trebuie s fie mai mic dect pKa-ul doxicicl inei, care este 3.4. n al doilea rnd, la un pH foarte mic, timpul de via al fazei staionare din coloan e redus cu mult, mai ales la pH mai mic de 2; iar n al treilea rnd, cu ct valorile pH -ului scad, crete numrul de izomeri analogi obinui. n urma acestor considerente, s-a ales o valoa re a pH-ului de 2.5. 3.3 Validarea metodei analitice Pentru a valida metoda HPLC s-au realizat o serie de teste . Parametrii inclui i n metodologia de validare a metodei cromatografice sunt: 3.3.1. Liniaritatea Scopul procedurii:se dorete s se demonstreze c exist o relaie liniar ntre concentraiile soluiilor analitului de interes care se injecteaz n coloana cromatogra fic i ariile picurilor generate n cromatogramele corespunztoare.

Pentru cei trei compui s-a fcut cte o curb de calibrare. Concentraiile investigate au fost ntre 3 si 60 g/ml pentru doxiciclin i 0.5-7 g/ml pentru 6-epidoxiciclin i metaciclin

Coeficientul de corelaie nu indic liniaritatea dac nu are o valoare ce depete r = 0,9 9.

Coeficienii de corelare (R2) au fost: 0.9990 pentru doxiciclin, 1.0000 pentru 6epidoxiciclin i 0.9994 pentru metaciclin. 3.3.2. Selectivitatea

Scopul procedurii:se doreste s se demonstreze c metoda cromatografic propus are capacitatea de a separa substana activ n raport cu impuritile nrudite chimic rezultat prin degradarea acesteia. Selectivitatea metodei pentru separarea doxiciclinei de compuii si de degradare a

fost studiat trecnd cantiti exacte de tetraciclin prin faza mobil. Aa cum s-a artat fig.2 i tab.1, compuii au fost separai cu o rezoluie corespunzatoare. Aadar, o analiz bun nseamn c toate perechile de picuri care elueaz succesiv sunt separate cu o rezoluie d e cel puin 1,5. 3.3.3 Precizia i acurateea Scopul procedurii: se dorete s se demonstreze c aplicarea metodei, n mod repetat, asupra aceleiai probe, genereaz rezultate similare. Prin repetarea analizelor (n=7) au fost determinate deviaia standard relativ (R.S .D.) pentru aria de sub curb (AUC) i timpii de retenie pentru cele trei substane. Media v alorilor R.S.D. obinute pentru timpii de retenie a fost de 1.16%, iar pentru ariile de sub curb: 1.44% (tab.2). Criteriul acceptat pentru valoarea abaterii standard relative (RSD) n st udiul preciziei metodei este RSD . 2% (n . 6).

Tabel 2. Precizia Compus R.S.D. (%) AUC R.S.D. (%) Doxiciclin 1.16 1.12 6 - epidoxiciclin 1.15 1.63 Metaciclin 1.16

1.58

4. Concluzii

S-a dezvoltat o nou metod pentru separarea doxiciclinei i a produilor si de separare, 6-epidoxiciclin i metaciclin, metod care s-a dovedit c este fiabil, relativ ieftin i simpl n ceea ce privete procedurile ce trebuiesc aplicate, comparativ cu metoda Farmacopeei Europene. Rezultatele arat c metoda descris poate fi folosit n analizele calitative ale celor trei compui, iar cercetri suplimentare vor putea determina aceste limite calitativ e ale metodei. Simplitatea metodei prezentate o face s fie o alternativ potrivit la metod ele oficiale folosite n controlul calitativ al doxiciclinei.

Acest studiu indic, de asemenea, faptul c metoda poate fi folosit att pentru analiza calitativ ct i n analiza cantitativ a multor tetracicline, ns pentru confirm a acestui fapt sunt necesare cercetri suplimentare.