CAPITOLUL 9 TESTAREA TOXICITII PENTRU FERTILITATE I REPRODUCERE

9.1. Introducere
Teratogenii sunt substane chimice sau medicamente care determin toxicitate embrionar inducnd malformaii structurale, disfuncie fizic, modificri comportamentale sau anomalii genetice. Expresia rspunsului teratogenic (efectul embriotoxic al unui compus asupra creterii i dezvoltrii fetale) se manifest de obicei la natere sau n perioada imediat postnatal. Un agent chimic poate interaciona i cu funcia reproductiv prin inducerea toxicitii, timpuriu, n ciclul reproductiv (primul trimestru), prin afectarea fertilitii sau prin interferena cu procesul de implantare. Astfel, interaciunea iniial a unui ovul fertilizat cu un presupus teratogen poate mpiedica instalarea sarcinii i induce avortul spontan. Toxicologia reproductiv implic i studiul efectelor adverse ale agenilor xenobiotici asupra evenimentelor anterioare fertilizrii, incluznd spermatogeneza i ovogeneza. Aceste rspunsuri au creat necesitatea de a defini, dezvolta i efectua corect teste pentru evaluarea agenilor chimici care ar putea interaciona cu reproducerea uman. ntrebuinarea medicamentelor n terapie i expunerea la ageni ocupaionali i de mediu n timpul sarcinii au crescut dramatic n ultimii ani. Studiile epidemiologice arat c 90% dintre femei au ingerat cel puin un medicament n timpul sarcinii (FDA, 1995). n plus, rata expunerii ambientale i ocupaionale la ageni chimici periculoi inainte sau n timpul sarcinii a crescut substanial. Excluznd vitaminele prenatale, suplimentele de fier i medicamentele tocolitice, femeile sub 35 de ani primesc n medie, n timpul sarcinii, trei medicamente prescrise; acest numr crete la 5 pentru femeile care au peste 35 de ani.

Dintre substanele chimice la care femeile sunt expuse din neatenie n timpul sarcinii menionm insecticidele, ierbicidele, fungicidele, metalele (mercur) i hormonii de cretere (n alimente procesate). Pentru majoritatea acestor ageni chimici i medicamente nu au fost efectuate studii controlate nainte de lansarea pe pia, deoarece aceste studii nu au fost aprobate pentru majoritatea agenilor terapeutici sau non-terapeutici. O complicaie posibil rezult din capacitatea medicamentelor terapeutice, substanelor chimice ambientale i produselor din plante de a se infiltra n mediul matern fetal. Dei majoritatea medicamentelor sunt testate pentru potenialele lor embriotoxice sau teratogenice prin studii efectuate pe animale, multe substane chimice nu sunt nc testate. Reglementrile SUA nu cer deocamdat companiilor farmaceutice i chimice s asigure aceste informaii. De asemenea, majoritatea programelor de dezvoltare a medicamentelor nu presupun de obicei studii de screening sau urmrire a efectelor potenial teratogene asupra femeilor nsrcinate, n fazele preclinice i clinice sau n perioadele postmarketing. Agenii chimici ambientali nu au fost, n general, supui testrii teratogene. Nu exist date despre embriotoxicitatea uman pentru o multitudine de substane chimice n uz (Barile, 2008).

9.2. Istoria i dezvoltarea testrii teratogene

Dezastrul produs de talidomid n 1961 a iniiat un efort semnificativ din partea corpurilor legislative SUA i europene pentru a stabili programe ale testrii teratogenicitii. Iniial talidomida nu prea a avea efecte teratogene pe speciile testate, cu excepia iepurilor, dar, curnd dup introducerea pe piaa european, medicamentul a fost asociat cu dezvoltarea unui defect de natere rar, denumit focomielie. Proporiile epidemice ale efectului teratogen al talidomidei au dus la adoptarea Amendamentului Harris-Kefauver n SUA (1962). Acesta a impus cercetri toxicologice i farmacologice preclinice extinse nainte de lansarea comercial a unui compus terapeutic.

9.3. Scurt descriere a fiziologiei materno fetale

9.3.1. Dezvoltarea fetal prenatal Creterea i dezvoltarea prenatal implic nceputul, creterea i maturizarea anatomiei i fiziologiei de la fertilizare (concepie) la parturiie (natere). Primul trimestru (primele 10 sptmni) este caracterizat ca perioada de dezvoltare embriologic n timpul creia progreseaz diferenierea celulelor stem precursoare, culminnd cu apariia membranelor fetale i a discului embrionar. Restul sarcinii (11 40 sptmni) implic dezvoltarea fetal, n timpul creia organele i esuturile cresc i se maturizeaz. Aceste procese permit creterea i dezvoltarea prenatal. Astfel, la om, durata perioadei gestaionale normale este de 9 luni (sau 280 de zile de la prima zi a ultimei perioade menstruale, n cazul unui ciclu regulat de 28 de zile). Dezvoltarea postnatal ncepe la natere i progreseaz pn la adolescen. Figura 9.1 ilustreaz ciclul vieii reproductive. Stadiile majore ale reproducerii (zonele gri) sunt compuse din evenimente care se petrec n timpul formrii i dezvoltrii embrionului (gri nchis), de-a lungul secvenelor de timp paralele (casetele gri).

Figura 9.1 Ciclul vieii reproductive i perioadele de potenial toxicitate embrionar i reproductiv 3

n consecin, cele mai sensibile perioade ale expunerii la substane toxice corespund evenimentelor ciclului reproductor (mperechere, clivare, gestaie, parturiie). n general, expunerea n stadiile timpurii ale dezvoltrii fetale este asociat cu consecine teratogenice mai severe. n plus, doza i durata expunerii sunt importante pentru evaluarea mecanismelor de toxicitate reproductiv. 9.3.2. Primul trimestru Primul trimestru corespunde dezvoltrii embriologice i fetale timpurii. Principalele evenimente ale primului trimestru includ:
-

clivarea (zilele 1 6): o serie de diviziuni celulare ce au loc dup fertilizarea ovulului de ctre spermatozoid, determin formarea i transportul morulei i blastocistului prin trompa uterina,

implantarea (zilele 7 10): adeziunea, ataarea i penetrarea mucoasei endometriale de ctre blastocist; se formeaz i se extind trofoblastul, cavitatea amniotic i masa celulelor interioare. Dezvoltarea ulterioar a acestor elemente are loc n sptmnile 3 i 4 (nceputul embriogenezei),

placentaia (sptmnile 2 10): ncepnd cu ziua 10, se formeaz vase de snge n jurul periferiei blastocistului pentru a dezvolta placenta; aceast structur membranar multistratificat este compus din infiltrarea vililor corionici i evideniat de apariia vaselor sanguine fetale,

embriogeneza (sptmnile 5 10, simultan cu placentaia): transformrile discului embrionar produc un embrion distinct i uor de recunoscut. Datorit evenimentelor importante ale acestor faze, primul trimestru reprezint

o perioad a dezvoltrii i creterii prenatale foarte sensibil la stimuli externi, cum ar fi medicamentele i agenii chimici.

9.4. Mecanismele toxicitii n perioada de dezvoltare

9.4.1. Susceptibilitatea Primele 8 10 sptmni ale embriogenezei sunt o perioad sensibil pentru expunerea la medicamente sau substane chimice. De exemplu, expunerea la compui exogeni n 21 de zile de la fertilizare prezint cel mai mare potenial pentru
4

embriotoxicitate, determinnd moartea ftului. Expunerea n sptmnile 3 8 are potenial teratogen. Efectele se disting prin dezvoltarea defectelor anatomice, metabolice sau funcionale majore care precipit avortul spontan (Buschman,2006). Expunerea la ageni toxici n trimestrul doi sau trei are potenial teratogen mai mic. Totui, aceast expunere poate interfera cu dezvoltarea i maturarea sistemelor organice critice, determinnd subdezvoltare sau alterare a funciei organice normale. 9.4.2. Doza rspuns i doza de prag Schimbul de nutrieni, gaze i deeuri dintre circulaiile matern i fetal ncepe din sptmna 5 de la fertilizare, cu iniierea formrii placentei. Circulaiile matern i fetal nu se amestec. n schimb, sngele matern intr n spaiile interviloase (sinusuri) ale placentei prin artere materne perforate, apoi se scurge n venele uterine pentru ntoarcerea n circulaia matern. Sngele fetal intr n placent printr-o pereche de artere ombilicale i se ntoarce n circulaia fetal prin vena ombilical. Arterele ombilicale se mpart n capilare, sunt nconjurate de trofoblati sinciiali i formeaz o reea de vili corionici. Substanele solubile, gazele i nutrienii din circulaia matern intr n sinusuri, nconjoar i scald vilii corionici i traverseaz epiteliul i esutul conjunctiv al vililor nainte de a penetra celulele endoteliale capilare fetale. Materialele sunt apoi transportate ctre embrion prin vena ombilical. Agenii chimici intr n circulaia fetal la fel cum traverseaz orice barier membranar. Rata de schimb ntre ciculaia matern i cea fetal depinde de echilibrul stabilit de-a lungul placentei i de rata de penetrare a agentului chimic prin barierele endoteliale i epiteliale. Medicamentele i agenii liposolubili, gazele dizolvate infiltreaz uor membranele placentare i se regsesc n concentraii mari n sngele venos. Astfel, compuii pot circula liber n embrion la 30 60 de minute de la administrarea matern. n plus, substanele exogene pot altera tonusul dinamic al vaselor de snge placentare, modificnd schimbul de nutrieni, gaze i deeuri. Cteva substane chimice, cum ar fi gazele, restricioneaz transportul de oxigen ctre esuturile fetale, schimb dinamicile biochimice ale celor dou circulaii i interacioneaz cu funcia endocrin a placentei. Gradul de penetrare chimic a
5

barierelor placentare depinde mai puin de numrul i grosimea straturilor i mai mult de interaciunile fizicochimice dinamice ale substanei chimice i placentei. Deoarece esuturile embrionare cresc rapid i au o rat mare de turnover al ADNului, ele sunt vulnerabile fa de muli ageni care nu induc reacii toxice la copii sau aduli. Unele clase de ageni necesit expunere repetat, continu sau n doze mari pentru a determina o reacie. Alte substane chimice mai potente, cum ar fi posibilele carcinogene, afecteaz celulele i esuturile rapid proliferative. Efectele lor sunt semnificative i apar cu frecven nalt.

9.5. Teratogenia
9.5.1. Agenii teratogenici Potrivit definiiei teratogenului menionat la nceputul acestui capitol, un rspuns teratogen la un agent chimic implic un efect embriotoxic asupra creterii i dezvoltrii fetale. Efectul se manifest la natere sau n imediata perioad postnatal. Aproximativ 25% din rspunsurile teratogene sunt datorate susceptibilitiilor genetice i aberaiilor cromozomiale, n timp ce 75% nu au cauze cunoscute. Colegiul American pentru Medicin Ocupaional i Ambiental recunoate cteva clase de ageni teratogeni umani cunoscui pe care i prezentm n tabelul 9.1.
Tabelul 9.1 Clase de teratogeni recunoscute de Colegiul American pentru Medicin Ocupaional i Ambiental (dup Barile, 2008) Clase de ageni teratogeni Exemple umani cunoscui Radiaie ionizant Infecii materne Arme atomice, iod radioactiv, radioterapie Citomegalovirus, virusuri herpetice I i II, parvovirus B19, virus rubeolic, sifilis, toxoplasmoza, virus encefalitic cabalin venezuelean Boli materne Alcoolism, cretinism endemic, diabet, deficit de acid folic, hipertermie, fenilketonurie, boala reumatic i bloc cardiac congenital Obiceiuri comportamentale Alcoolism cronic, abuz de droguri, fumat adictive Substane chimice Metale (compui de mercur i plumb), ierbicide, solveni ambientale industriali, policlorobifenili (PCB) Medicamente Muli ageni terapeutici

9.5.2. Factori asociai cu teratogenia Orice agent chimic ar trebui suspectat de un rspuns teratogen cnd condiiile de expunere sunt suficiente pentru a da o reacie toxic. De exemplu, doza rspuns i timpul de expunere al unui anume agent determin adesea severitatea leziunii i tipul de defect care apare. n general, rspunsul teratogen este direct proporional cu rspunsul toxic. Timpul de expunere este alt component important deoarece vulnerabilitatea la expunerea chimic este mai mare n perioada de dezvoltare embrionar (primul trimestru) dect n perioada de dezvoltare fetal (trimestrele doi i trei). Experiena talidomidei este un exemplu clasic de expunere important n timpul organogenezei. Specificitatea malformaiilor a fost legat de timpul de expunere n timpul sarcinii (dup ultimul ciclu): 35 37 de zile, urechile; 39 41 de zile, braele; 41 43 de zile, uterul; 45 47 de zile, tibia; 47 - 49 de zile, policele. De asemenea, tipul i severitatea anomaliilor cauzate de un agent teratogen sunt dependente mai degrab de susceptibilitatea genetic a femeii nsrcinate dect de susceptibilitatea ftului. Variaiile metabolismului matern pentru un anumit medicament determin ce metabolii ajung n final la ft. Expunerea fetal este de asemenea afectat de diferenele existente n membranele placentare, rata de formare, transportul placentar i biotransformarea (Choen, i colab., 2001). n final, principiile toxicocineticii i farmacocineticii diferitelor clase de compui influeneaz gradul de penetrare a membranei placentare. n general, cu ct un agent este mai liposolubil, cu att este mai mare potenialul de expunere fetal prin circulaia matern fetal. Aceti factori, ct i caracteristicile compuilor individuali, determin probabilitatea unui agent chimic de a cauza un defect genetic. Probabilitile sunt clasificate astfel:
-

risc absolut: rata de apariie a unui fenotip anormal printre indivizii expui unui agent. Alcoolismul matern cronic crete cu pn la 45% riscul naterii unui sugar cu sindrom alcoolic fetal;

riscul relativ: raportul ratei condiiei ntre cei expui unui agent i populaia general neexpus. Un risc relativ mare poate totui indica un risc absolut
7

sczut (un risc relativ mare de 10 pentru o condiie rar cu inciden de 1 la 100.000 corespunde unui risc absolut sczut de 1 la 10.000);
-

riscul atribuibil: rata unei condiii atribuite expunerii la un agent, n special la teratogeni cunoscui (risc de 90% de apariie a focomieliei la pacienii expui in utero la talidomid). Cunoaterea potenialului teratogen al expunerii n timpul sarcinii la substane

chimice i medicamente a facilitat diseminarea informaiei ntre ageniile reglementatoare, cadre medicale i public. 9.5.3. Teste animale pentru teratogenie Testarea toxicitii n faza de dezvoltare are ca scop identificarea efectelor poteniale ale expunerii prenatale asupra unui organism uman sau animal n dezvoltare. Pentru medicamentele utilizate n terapia uman, aceast informaie poate fi folosit pentru a limita expunerea populaiei. Pentru a simula un rspuns teratogen uman cunoscut sau posibil, testul implic administrarea unui compus chimic specific ntr-un interval de doze capabile s iniieze efecte toxice pe o specie animal. Ideal, specia ar trebui s fie susceptibil genetic la o varietate de clase chimice i animalele ar trebui s se afle ntr-o faz sensibil a dezvoltrii embrionare. Gradul de susceptibilitate este mai puin asociat cu o specie programat genetic pentru sensibilitate chimic, dar este asociat mai ales cu o serie de factori care au proprieti de biotransformare specifice unui grup animal. Prin urmare, capacitatea matern i/sau fetal de biotransformare a compuilor poate modifica efectul net al unui substane teratogene. Astfel, reaciile de biotransformare activ pot predispune un embrion la efecte teratogene prin formarea de intermediari reactivi. Alternativ, dei absena reaciilor de biotransformare rapid poate reduce producia metaboliilor activi, lipsa mecanismelor de inactivare poate prelungi expunerea ftului la compusul activ iniial. Cea mai comun abordare de identificare a teratogenilor este efectuarea testelor de toxicitate pe dou specii, de obicei roztoare i iepuri, pentru evaluarea medicamentelor umane (International Conference on Harmonization, 1994) i pentru
8

testarea pesticidelor i a agenilor chimici ambientali (U.S. Environmental Protection Agency, 1998). Motivul acestei abordri este c nicio singur specie nu este definitiv predictiv pentru teratogenia uman i nicio specie nu este mai sensibil la teratogeni (Riecke, Stahlmann, 2000). Roztoarele i iepurii sunt preferai deoarece:
1. par s aib indici sczui de anomalii congenitale spontane; 2. ngrijirea i costurile sunt rezonabile; 3. se nmulesc repede; 4. au timpi gestaionali relativ mici (cteva sptmni).

Timpii gestaionali pentru roztoare i iepuri sunt de 21 de zile, respectiv 32 de zile. Astfel, pentru a detecta potenialul efect teratogen, agentul chimic trebuie administrat la 7 10 zile de la implantare. Aceast perioad de clivare celular i embriogenez reprezint o fereastr ngust pentru detectarea teratogenilor i a toxicitii de dezvoltare i reproductive la aceste specii. 9.5.3.1 Protocoalele standard Metodologiile standard pentru screening-ul teratogeniei sunt ndeplinite pentru a asigura o expunere suficient n perioadele critice post implantare. Protocolul este prezentat n tabelul 9.2. Administrarea unui agent chimic este proporionat pe parcursul a 6 zile post implantare pentru a determina potenialul teratogen. Relaiile doz rspuns sunt bazate pe defecte observabile i msurabile.
Tabelul 9.2 Metodologia standard pentru testarea teratogeniei pe animale Perioada de timp Ziua 0 Zilele 6 15: roztoare Zilele 6 18: iepuri ~ ziua 20: roztoare ~ zilele 30 31: iepuri Protocol mperecherea animalelor; determinarea impregnrii prin prezena dopului vaginal succesului

Administrarea agentului chimic (trei grupuri de dozaj, 10 roztoare sau 5 iepuri per grup) Eutanasierea animalelor, necropsia femelelor i fetuilor, identificarea anomaliilor macroscopice; efectuarea analizelor fetale patologice, histologice, fiziologice i biochimice 9

9.6. Embriotoxicitate
Metodele clasice pentru testarea substanelor embriotoxice se realizeaz pe roztoare i iepuri, n principal datorit perioadelor gestaionale relativ scurte. Procedura implic expunerea femelelor nainte sau imediat dup concepie pentru toat durata gestaiei. nceputul secvenei de expunere depinde de datele dorite ale toxicitii. De exemplu, pentru a determina efectele unui agent chimic asupra dezvoltrii i creterii ftului, perioada de expunere ncepe la cteva zile dup fertilizare, n jurul perioadei implantrii. Intervalul de timp trebuie determinat cu atenie pentru a nu interaciona cu mperecherea. Roztoarele i iepurii sunt cei mai folosii n experimentele embriotoxice datorit naterilor multiple, de obicei 8 10 embrioni per sarcin, permind evaluarea agentului chimic n funcie de numrul de fetui afectai. De exemplu, un indicator particular este selectat pentru o cuantificare a toxicitii i obiectivul final este monitorizat pentru fiecare embrion. Valoarea minim acceptat pentru acest indicator este considerat drept toxic. Cu ct este mai mare numrul de embrioni care prezint toxicitate potrivit acestui criteriu, cu att este mai mare scorul i agentul chimic este mai toxic. Numrul de experimente este planificat pentru a optimiza resursele i efortul, pentru un numr dat de ageni chimici care pot fi evaluai n doze diferite pentru indicatori variai ai fiecrui fetus (Webster i colab., 1997). Seciunile urmtoare subliniaz protocoalele variate disponibile pentru testarea embriotoxicitii. 9.6.1. Cultura embrionar 9.6.1.1. Tehnici de pre-implantare De la prima descriere a culturii de embrioni pre-implantai n 1913, metoda i-a artat importana n embriologia experimental i biologia reproductiv. Tehnica este descris pentru culturile de embrioni pre-implantai de oarece, iepure i om. n general, embrioni vechi de 3 6 zile (morule de 3 zile, blastociti de 6 zile) sunt ndeprtai din animale mature sexual i transplantai n vase de cultur coninnd medii suplimentate cu ser bovin fetal sau mediu condiionat fr ser.
10

Culturile sunt expuse la substana de testat n timpul perioadei de incubare i examinate microscopic sau monitorizate pentru cretere i proliferare prin proceduri biochimice. O varietate de indicatori de viabilitate celular sunt folosii pentru a evalua citotoxicitatea xenobioticelor n celulele stem embrionare derivate din blastociti de oarece. Astfel, culturile de embrioni pre-implantai pot oferi sisteme de celule stem interesante pentru testarea toxicitii embrionice dup expunerea la xenobiotice. 9.6.1.2. Cultura embrionar post-implantare O metod clasic pentru potenialul embriotoxic care necesit ndeprtarea de embrioni ntregi de la femele este cunoscut ca i cultura embrionar post-implantare. Tehnica implic ndeprtarea chirurgical a embrionilor n vrst de 1 2 sptmni de la roztoare, dup care li se permite aclimatizarea la mediu de cultur celular pentru cteva ore. Fetuii viabili sunt expui apoi dozelor diferite de ageni chimici i sunt determinate efectele asupra creterii i dezvoltrii. Metoda este impresionant deoarece schimbrile structurale apar rapid, n cteva zile, iar embriotoxicitatea este monitorizat n cultur n timp ce creterea i diferenierea progreseaz. Aceast metod are beneficiul adiional de a permite investigaii ulterioare cu alte substane teratogene. n plus, cultura de embrioni in vitro aduce oportunitatea de a studia aciunile directe ale toxinelor suspectate, fr influena hormonilor i farmacocineticii materne. Retardul creterii legat de doz i frecvena malformaiilor sunt monitorizate macroscopic i depind de perioada de gestaie a embrionilor extrai (Jelinek, 2005). Cultura embrionar post-implantare este corespunztoare screening-ului substanelor embriotoxice deoarece implic perioada de dezvoltare fetal care include morfogeneza i organogeneza timpurie. Aceast metod este corespunztoare screening-ului substanelor chimice cu potenial teratogen deoarece monitorizeaz multiple procese celulare care reflect natura complex a dezvoltrii embrionare. Perioada identificrii toxicitii este limitat pn la a doua sptmn deoarece dezvoltarea culturilor embrionare de roztoare necesit dezvoltare placentar. n
11

consecin, tehnica reflect activitile substanelor chimice n timpul ctorva evenimente celulare coordonate, dintre care menionm proliferarea, migrarea, asocierea, diferenierea i moartea celular. n mod ideal, desfurarea corect a tehnicii presupune:
1. un numr suficient de fetui viabili extrai pentru testare, 2. dezvoltare embrionar fr blocaje, progresiv i continu, 3. cunoaterea rspunsurilor i mecanismelor toxicitii chimice, 4. uoara manipulare i interpretare a protocolului i o frecven sczut de

rezultate fals negative,

5. administrarea de concentraii aproximativ echimolare identice expunerilor

terapeutice sau ambientale, control sistematic al dozei i timpului de rspuns,

6. eliminarea factorilor materni care pot interfera cu rspunsul la agent al

sistemului test. Ocazional, rspunsul la agenii citotoxici al embrionilor post-implantare de roztoare poate necesita activare metabolic. Astfel modificri ale protocolului pot cere incubarea embrionilor in mediu coninnd agentul de testat plus fraciuni hepatice S9. Dei procedura folosete creterea n cultur ca i component a protocolului, nu trebuie confundat cu metodele de cultur celular in vitro (capitolul 16). Culturile embrionare necesit preparare i sacrificare animal extensiv i ofer puine avantaje pentru studii de prescreening de mare anvergur. 9.6.1.3. Culturile de organ Organele fetale sunt meninute n cultur n stadiul celular primar prin stabilirea de culturi de organ i imersia parial sau complet a esutului n mediu de cretere. Pentru scurt timp, esutul fetal este plasat pe filtre microscopice sau pe plastic acoperit cu componente ale matricii extracelulare. Aceast abordare a fost folositoare n cultura mugurilor de membre pentru cteva specii de animale, ntr-un mediu coninnd ser sau definit chimic. Dezvoltarea i diferenierea morfologic sunt monitorizate microscopic fiind folosii i indicatori biochimici.
12

Cteva organe au fost investigate intens pentru fenomene de embriotoxicitate, se includ aici culturi primare de celule epiteliale tip II din plamnii fetali de obolan. Astfel, avantajul culturii de organ const n capacitatea sistemului in vivo in vitro de a aciona ca un model pentru detectarea toxicitii de organ int. 9.6.1.4. Ghiduri internaionale n 1999, Organizaia pentru Cooperare Economic i Dezvoltare (OECD) a propus recomandri internaionale pentru sisteme de clasificare chimic pentru toxicitatea reproducerii. Ghidurile descriu sistemele folosite curent de organizaiile i rile membre, incluznd Uniunea European, SUA, Canada i Australia. Ele prezint de asemenea evaluri i comparaii ale sistemelor n uz, metode de clasificare a riscului, cerinele de date, mecanismele pentru clasificarea substanelor i consecinele regulatorii ale clasificrii. O anex enumer substanele clasificate n Uniunea European ca toxice pentru reproducere. n SUA, ghidurile testrii toxicitii de dezvoltare sunt elaborate pentru a aduce informaii generale asupra efectelor expunerii animalelor de testat nsrcinate asupra organismelor n dezvoltare. De asemenea sunt elaborate i ghiduri ale testrii neurotoxicitii pentru a prezenta efectele funcionale i comportamentale ale expunerii prenatale, incluznd informaii asupra teratogeniei i embriotoxicitii. Testarea reproducerii i fertilitii analizeaz funcia gonadal, ciclul estrogenilor, comportamentul de mperechere, concepia, gestaia, parturiia, lactaia, ablactarea, i creterea i dezvoltarea urmailor. Revizuirile propuse ar trebui s mreasc sensibilitatea studiilor n identificarea altor efecte cum ar fi dezvoltarea cartilaginoas, spermatogeneza i maturizarea sexual.

9.7. Toxicologia reproducerii la mascul

9.7.1. Spermatogeneza Testiculul este compus dintr-o serie de tubi seminiferi contori nconjurai de tunica albugineea, tunica vaginal i esut vascular i conjunctiv de suport. Tubii sunt compui din trei tipuri celulare: celule spermatogenice (germinale), celule Sertoli i
13

celule interstiiale Leydig. Cnd prolifereaz n timpul spermatogenezei, celulele germinale se divid meiotic i migreaz de la membrana bazal spre lumenul tubului. Continund progresia spre lumenul tubular, spermatogonia se difereniaz n spermatocite primare, spermatocite secundare i spermatide. Spermatogeneza continu pentru 5 sptmni la om i implic diferenierea spermatidelor n spermatozoizi. Spermatozoizii se metamorfozeaz din celule rotunde care ader la suprafeele apicale ale tubilor seminiferi n spermatozoizi maturi, cu form caracteristic. Faza final a diferenierii permite eliberarea spermatozoizilor maturi n ductele eferente. Transportul final al spermei mature implic traversarea unei rute extinse prin ductele reproductive, cu stocare eventual n veziculele seminale. Spermatozoizii sunt produi continuu de-a lungul vieii reproductive a masculului. Perioadele de dezvoltare, difereniere i eliberare a spermei variaz de la o specie la alta. Tabelul 9.3 subliniaz caracteristicile spermatogenezei n funcie de specie i expune factorii care influeneaz spermatogeneza (Seed i colab., 1996).
Tabelul 9.3 Caracteristicile difereniale ale spermatogenezei Specia Caracteristici reproductoare masculine Vrsta la pubertate (spt) Greutatea testiculelor (g) Lungimea unui ciclu de epiteliu seminifer (zile) Caractere ale spermei colectate: volum (ml) concentraie total per ejaculare producie/g testicul procent mobilitate capacitare (ore) mperechere natural Comportament sexual oarece 4-6 ? 8,9 obolan 6 3,5 12,9 Cine 32 13 13,6 Iepure 20 6,4 10,7 Om 520 34 16

+ +

+ +

3,0 100 300 23 80 4 + +

0,5 300 160 25 80 6 + +

1,5 100 150 4,4 50 5 + +

14

Cerinele fizice ale spermatogenezei sunt suportate de celulele Sertoli, n timp ce ntreinerea endocrin este asigurat de celulele Leydig prin secreie de testosteron. n plus, controlul endocrin al acestor procese este reglat prin eliberarea de FSH i LH din hipofiza anterioar. Eliberarea de FSH i LH este la rndul ei reglat prin procese inhibitorii de feedback negativ datorit eliberrii din hipotalamus a GnRH, ca i prin inhibiia direct prin nivelele sanguine ale FSH i LH. Figura 9.2 ilustreaz mecanismele de control prin feedback endocrin care asigur reglarea hormonal a gametogenezei feminine.

Figur a 9.2 Mecanisme de control prin feedback endocrin al GnRH, FSH i LH

9.7.2. Teste de reproducere Procesul meiotic care guverneaz dezvoltarea spermei este din punct de vedere fiziologic, morfologic i genetic un stadiu vulnerabil al ciclului reproductiv masculin. Fiecare stadiu de diviziune este unic i se poate petrece simultan n zone diferite ale tubilor seminiferi. Astfel, dei o leziune toxic are capacitatea de a afecta orice celul ntr-un anume stadiu, este mai puin probabil ca toate celulele testiculare s fie
15

afectate n mod egal. n plus, protecia fa de xenobiotice i influene exterioare este conferit de formarea unei bariere snge testicul de ctre celulele Sartoli. n ciuda acestor efecte protectoare, cauzele genetice induc 10 15 % din cazurile de infertilitate masculin uman sever, incluznd aberaiile cromozomiale i mutaiile unei singure gene. n plus, impactul chemoterapiei citotoxice asupra gametogenezei a demonstrat efecte citostatice semnificative. Prin urmare, pentru a evalua i nelege mecanismele legate de rolul xenobioticelor asupra gametogenezei masculine, o serie de indicatori ai toxicitii reproductive masculine sunt disponibili pentru a detecta leziunea toxic. Ei includ teste pentru producia, viabilitatea i morfologia spermei i experimente cum ar fi proba letal dominant, menit s determine efectele toxice ale agenilor chimici asupra mperecherii, comportamentului sexual, fertilitii i sarcinii. Tabelul 9.4 expune o varietate de teste folosite pentru evaluarea toxicitii reproductoare masculine (civa dintre parametrii au fost deja prezentai n tabelul 9.3).
Tabelul 9.4 Teste recomandate ale toxicitii reproducerii masculine Parametru test Producia de sperm Caracteristici Msurarea: volumului ejaculator, concentraiei spermei, numrtoarea total a spermei, motilitate, morfologie, capacitare mperechere n serie Masculi sunt tratai cu doze unice sau repetate de agent i mperecheai continuu cu femele netratate Studii extinse de Administrare subcronic de agent de testat pe parcursul mperechere mai multor cicluri spermatogenice nainte de mperecherea n serie cu femele netratate Indice de fertilitate Procentul de mperecheri din care rezult sarcini reuite n perioada de timp Proba letal dominant Expunere unic, repetat, acut sau cronic a masculilor pe parcursul unui ciclu spermatogenic complet, apoi mperechere n serie cu femele netratate; obiectiv: monitorizarea leziunilor cromozomiale severe sau mutaii letale ale celulelor germinale

Reducerea acut a indicelui de fertilitate dup tratament sugereaz un efect advers asupra spematozoidului matur, pe cnd descoperirea efectelor ntrziate indic interferene cu spermatogeneza. Examinarea morfologic a testiculelor i tubilor este inclus pentru a confirma datele. Studiile acute i extinse de mperechere pe roztoare
16

i iepuri necesit unul sau mai multe cicluri de turnover al epiteliului seminifer, realizate n sptmni sau luni de tratament. Combinaiile acestor probe sunt capabile de screeningul att al toxicelor puternice, ct i al celor slabe, pe baza parametrilor doz rspuns. Efectele antifertilitate, influenarea implantrii, efectele pre- i post-spematogenice i letalitatea fetal sunt evaluate cu o coordonare a protocoalelor corect planificat i executat. Concluziile efectelor toxice sunt obinute pe baza aciunii directe asupra procesului meiotic i pe baza influenei sistemului neuroendocrin, care include feedback-ul hipotalamo-hipofizar, efectele asupra reglrii autonome a ereciei i ejaculrii i comportamentul de mperechere. Cu toate c aceste protocoale aduc informaii importante pentru determinarea toxicitii de reproducere poteniale, metodele nu au fost bine dezvoltate n toate laboratoarele i sunt n continu evoluie. Lipsa standardizrii metodelor nu permite un flux liber de informaii ntre laboratoare. Pentru a rezolva diferenele dintre metode, mai multe grupuri recente de lucru au convenit s discute optimizarea metodelor pentru evaluarea parametrilor spermei la speciile animale.

9.8. Toxicologia reproducerii la femel

9.8.1. Ovogeneza Ovarele, gonadele pereche ale femelei, conin foliculii primordiali n care are loc ovogeneza. Ovogeneza este definit ca procesul dezvoltrii i formrii ovocitelor secundare mature. Foliculii provin din celule germinale primordiale i reprezint celulele stem embrionare corespunztoare ciclului reproductor feminin. Procesul meiotic este mai complex la mamiferele femele, n principal datorit ntreruperii ciclurilor. Meioza I ncepe n viaa fetal i se oprete la natere cu dezvoltarea ovogoniei. Un numr determinat genetic de ovogonii se dezvolt i rmn dormante pn la pubertate, cnd sunt recrutate pentru a continua diviziunile meiotice lunare. De fapt, ovogoniile reprezint ntregul lot de celule germinale disponibile pentru reproducere meiotic i sunt consumate ntr-o rat de 100 200 de foliculi
17

primordiali per ciclu menstrual. La pubertate, ovocitele primare completeaz meioza I , care produce ovocitul secundar. n aceast etap, ovocitul secundar este n stadiu haploid (n) i este nconjurat de zona pelucida i celulele granuloase, n interiorul foliculului secundar. Ovocitul secundar ncepe meioza II, apoi este oprit n metafaza meiozei II fiind eliminat (cu numr haploid de cromozomi) prin ovulaie i capturat de trompa uterin. Ovulaia const n ruptura foliculului, descrcarea i capturarea ovulului de trompa uterin. Corpul galben se formeaz din colabarea foliculului rupt i secret progesteron. Dup fertilizare, ovocitul secundar se divide ntr-un ovul matur. Pronucleul spermatozoidului i ovulul fuzioneaz i formeaz un zigot diploid. Stadiile imediat urmtoare sunt caracterizate de diferenierea zigotului n fazele de morul i blastocist, acesta din urm continund cu implantarea n zilele 7 10. Ciclul menstrual i dezvoltarea ovocitului secundar sunt reglate de FSH i LH, n timp ce foliculii i corpii galbeni secret estrogeni (Storgaard i colab., 2006), respectiv progesteron. Hormonii regleaz mecanismele de feedback care controleaz funciile ovariene (figura 9.2); femelele diferitelor specii variaz considerabil n perioada i secvena ovogenezei. Tabelul 9.5 prezint un numr de parametrii caracteristici ai femelelor speciilor de laborator, comparativ cu omul.
Tabelul 9.5 Caracteristici difereniale ale ovogenezei Caracteristici feminine reproductoare oarece 4-6 6-8 25-80 4-6 10-14 8-12 2-3 19-21 6-12 1 obolan 7-10 9-14 250-300 4-5 10-16 10-14 8-10 22 8-12 1 Specia Cine 7-9 10-14 10 kg Variabil >96 10 63 63 4-8 14 Iepure 24 32 5000 Variabil 9-14 31 31 7-10 3-5 Om 520 624 55 kg 28 1-2 24 260 1-2 30-35

Vrsta la pubertate (spt) Vrsta la maturitate sexual (spt) Greutate adult (g) Durata ciclului menstrual (zile) Durata ciclului estrogenilor ore Numr de ovocite la ovulaie Durata ovulaiei (ore) Durata gestaiei (zile) Produi de concepie per sarcin Viaa reproductoare

18

9.8.2. Teste ale reproducerii Procesul meiotic care guverneaz ovogeneza este fiziologic, morfologic i genetic mai vulnerabil la injurie chimic dect spermatogeneza. Procesul meiotic este mai uniform; stadiile de difereniere sunt secveniale i de obicei nu au loc simultan pentru mai mult de un ovul n ntreg ovarul. Prin urmare, este foarte probabil ca leziunea toxic s afecteze profund dezvoltarea ovulelor mature n orice perioad a ciclului menstrual. Pentru a evalua mecanismele legate de rolul xenobioticelor n gametogeneza femelei, n tabelul 9.6 sunt discutai civa indicatori ai reproducerii feminine.
Tabelul 9.6 Evaluarea parametrilor testelor de toxicitate ale reproducerii feminine Parametru Statut endocrin Caracteristici Manipulare chirurgical Nu Nu Da Da Da Da Da Da Da

Integritate hipotalamo-hipofizar n asociere cu nivele normale de gonadotropine Recuperare de blastocist Indicaie de fertilizare i dezvoltare preimplantar; diviziune mitotic rapid Determinarea fertilizrii Numrarea spermatozoizilor care nconjoar ovocitul sau embrionul tnr la iepure Determinarea spermei n Numrul spermatozoizilor blocai n stratul mucos stratul mucos ca indicaie a transportului spermei Rata de clivare Monitorizat in vitro pentru cteva zile post-fertilizare; monitorizarea diviziunilor mitotice Implantarea Examinare histologic Dezvoltarea fetal Dezvoltarea endodermului, ectodermului, mezodermului Morfologia tractului Examinare macroscopic i histologic reproductor Rata de transport a Indicator pentru maturarea embrionar i embrionului n oviduct dezvoltarea endometrial

Tabelul 9.7 prezint o varietate de combinaii recomandate de teste ale toxicitii reproducerii feminine care sunt capabile de screening att al toxicelor puternice, ct i al celor slabe, pe baza parametrilor doz rspuns. Efectele antifertilitate, influenarea gametogenezei feminine, implantarea, efecte asupra pre- i
19

post-organogenezei i anomaliile fetale sunt evaluate printr-o coordonare a protocoalelor corect planificat i executat. Concluziile efectelor toxice sunt derivate din analiza etapelor implicate n reproducerea la femel.
Tabelul 9.7 Teste recomandate ale toxicitii reproducerii feminine Parametru Studiu de o singur generaie (studii de fertilitate i teratogenie) Studii pe multiple generaii Caracteristici Agent administrat femelelor cu 15 zile anterior nceperii programului de mperechere; tratamentul continu n timpul sarcinii Tratament identic studiului pe o singur generaie pn cnd nou-nscuii ajung la statut reproductiv; studii monitorizate pe 2 3 generaii Tratament identic studiului pe o singur generaie Indicatori Determinarea indicelui de fertilitate, a indicelui de mperechere, a indicelui de gestaie; examinri histopatologice i microscopice Anomalii comportamentale, fiziologice i biochimice ale descendenilor ca rezultat al expunerii materne Funcia comportamental, lactaia, funcii neurologice senzoriale, motorii i cognitive

Studii postnatale

n final, tabelul 9.8 prezint o descriere a testrii secveniale i evalurii toxicitii reproducerii. Desfurarea secveniat a studiilor permite evaluarea sistematic a datelor testelor toxicologice, minimiznd n acelai timp duplicarea inutil a resurselor animale i de laborator.
Tabelul 9.8 Testarea secvenial Secvena I II III Protocoale Tratament separat cu substana test al masculilor sau femelelor Fertilizare normal: femele netratate mperecheate cu masculi netratai; administrare de agent post-fertilizare Evaluarea efectelor embriotoxice i teratogene n timpul dezvoltrii prenatale; examinarea dezvoltrii postnatale incluznd efectele asupra naterii i supravieuirii fetale, lactaiei, ablactrii i maturizrii

20

21