1

1.3.Concepia actual despre citologie Citologia este o ramur a tiinelor biologice, care studiaz structurile funcionale i fenomenele biologice generale comune tuturor celulelor, evideniind legile generale de desfurare a proceselor vitale la nivelul celular i molecular de organizare. Manifestndu-se ca o tiin integrativ, ea folosete noiuni de morfologie, biochimie molecular i celular, fiziolgie celular i genetic molecular. Ultimul deceniu se remarc prin intensificarea studierii nivelului molecular al proceselor celulare. Celula este considerat ,astfel, un microcosmos, n care structurile i funciile interacioneaz armonios, fiind determinate i reglate genetic, nct s se realizeze o eficacitate maxim. Dezvoltarea biologiei celulare i moleculare se datoreaz pe de o parte perfecionrii tehnicilor de studiere a celulei, iar pe de alt parte progreselor teoretice (conceptuale). 1.4.1.Tehnicile de studiere a celulei. Sunt reprezentate de tehnici de microscopie (optic sau electronic) i de tehnici de cercetare ( fizice, biochimice, debiologie celular i molecular , etc). 1.4.1. Tehnicile de microscopie optic i electronic Microscopia optic folosete fotonii pentru realizarea imaginilor, asigurnd mriri de 1500-3000 de ori (n mod obinuit de 1400 ori), cu o putere de rezoluie de 0,2 micrometrii (m).(Fig.1.1)

Fig.1.1 Formarea imaginii n microscopul optic 1.Sursa de lumin; 2.Dispozitiv de uniformizare luminii;3.Condensor;4.Preparat;5.Lentil obictiv;6.Imagine obiectiv;7.Lentil ocular;8.Imagine final.

i dozare a format n

Microscopia n contrast de faz, permite examinarea celulelor vii. Utilizeaz: microscoape cu

2 interferen, pentru aprecierea cantitativ a masei unor componente tisulare; - microscoape cu interferen difereniat, pentru studierea suprafeei celulelor. Microscopia de fluorescen evideniaz moleculele cu fluorescen natural ( vitamina A, catecolaminele) sau fluorescena indus. Se folosete n imunohistochimie pentru detectarea reaciei antigen-anticorp. Microscopia cu ultraviolete folosete lumina ultraviolet pentru detectarea unor amino acizi sau a acizilor nucleici. Microscopia cu lumin polarizat pentru studierea formaiunilor cristaline. Microscopul confocal Permite obinerea de imagini ale structurilor din diferite planuri ale seciuniilor examinate. n microscopia optic clasic,mai ales n cazul obiectivelor cu putere de mrire mic, se produce o suprapunere a imaginilor din 3 planuri nvecinate (planul focalizat, planul superior i inferior), pe cnd n microscopia confocal este focalizat un singur plan foarte subire din seciunea histologic, putndu-se obine imagini foarte clare din fiecare plan. Sursa de lumin este reprezentat de un fascicul de lumin punctiform ( de tip laser), care este ndreptat spre seciunea de examinat. Diferitele structuri din seciune, reflect razele de lumin care sunt captate de o oglind mobil i ndreptate spre o diafragm cu un un orificiu foarte ngust ctre un detector (similar ocularului). La nivelul detectorului ajung numai razele cu origine n planul focal, n timp ce razele provenite din planurile situate deasupra sau sub planul focal sunt blocate. Se obine o claritate mai mare, a structurilor din diferite planuri succesive ale preparatului, fapt ce permite localizarea fiecrei componente tisulare n planul focalizat. Semnalul luminos captat de detector poate fi amplicat prelucrat i afiat pe un monitor. Microscopul confocal permite focalizarea, la un anumit moment, a unui singur plan din preparatul examinat. Prin deplasarea n plan vertical a focarului lentilei obiectiv, se pot obine imagini ale unor planuri succesive, ca profunzime (asemntor cu ceia ce face tomograful n clinic), realiznd "seciuni optice", fr a fi nevoie de o secionare a preparatului. Imaginile planurilor succesive sunt stocate n memoria unui computer, care le "ansambleaz" obinnd o imagine tridimensional a preparatului examinat. Microscopul confocal permite examinatorului s obin "tomografia" unor seciuni histologice, fiind folosit pentru studirea citoscheletului, a

3 dispunerii cromozomilor n nucleu,etc. Dac este dotat cu lumin flurescent se pot obine imagini confocale fluorescente. Microscopul electronic se bazeaz pe utilizarea fluxurilor de electroni pentru realizarea imaginilor, permind obinerea unor grosismente teoretice mai puternice de 10.000 de ori dect n microscopia optic. Se ajunge la o putere de rezoluie egal cu 0,1 nanometri (nm).Exist dou tipuri principale de microscoape electronice: - microscopul electronic de transmisie i microscopul electronic de baleaj (scanning).(Fig.1.2)
Fig.1.2 Formarea imaginii n microscopul electronic 1-Catod; 2-Anod; 3-Lentila (bobina)condensator;4-Preparatul; 5Lentila (bobina) obiectiv; 6-Imaginea primar; 7-Lentila (bobina) de proiecie; 8Imagine final.

Microscopul electronic de transmisie (Transmission electron microscope - TEM) poate fi: convenional (CTEM), cnd diferena de potenial ajunge pn la 100.000 voli; sau - de nalt voltaj (HVEM), cnd diferena de potenial ajunga la 800.000 voli. Componentele eseniale ale unui microscop electronic de transmisie sunt: Catodul sau sursa de electroni, reprezentat de un filament de tungsten nclzit. Anodul, care relizeaz diferena de potenial. Un sistem de electromagnei, care acioneaz ca nite lentile condensator, lentile-obiectiv i lentile de proiecie. Un suport pentru preparat sau portobiect, reprezentat de o gril metalic fin pe care se fixeaz seciunea de esut, inclus n mas plastic. Un ecran pe care se capteaz imaginea. Un dispozitiv de fotografiere a imaginii. Puterea de rezoluie este de 2 Angstromi(), n practic ajungndu-se la 1,2 nanometri.
Fig.1.3 Formarea imaginii la microscopul de baleaj (scanning) 1-Catod; 2-Anod; 3-Lentil (bobin) condensator; 4-Bobin de scanare; 5Preparat; 5'-Detector de electroni; 6-Amplificator electronic; 7-Ecran de proiecie;8-Imagine final.

4 Ca fixatori se folosesc glutaralaldehida, pentru constiutieni proteici i tetraoxidul de osmiu pentru lipide i fosfolipide. Se realizeaz seciuni de ordinul nanometrilor cu ajutorul unor ultramicrotoame, nzestrate cu cuite de diamant. Ultraseciunile sunt incluse n mase plastice i ntise pe grile de cupru. Pentru realizarea contrastului ntre diferite ultrastructuri se folosesc substane precum citratul de plumb i acetatul de uranil. La examinare se observ c structurile cu densitate mare disperseaz (mprtie) electronii, aprnd de culoare nchis, n timp ce structurile cu densitate mic, care permit trecerea electronilor far a-i devia apar clare. n cazul microscoapelor electronice de nalt voltaj ( HVEM ), diferena de potenial atinge un milion de voli. Electronii pot ptrunde prin celule ntregi sau preparate de civa microni (cca. 2 microni). Se obine o imagine detaliat a organizrii tridimensionale, permindu-se vizualizarea texturii celulare interne i a unor detalii de structur, cum arfi de exemplu elemntele citoscheletului. Microscopul electronic de scanning (Scanning electron microscope SEM ) se carcterizeaz prin faptul c electronii nu trec prin preparatul studiat, ci mtur (terg) suprafaa acestuia, nct se va obine o imagine tridimensional a accidentelor de suprafa. Puterea de rezoluie este de cca. 100 Angstromi.
Cnd electronii folosii de TEM sau SEM bombardeaz preparatul se produc radiaii X cu lungimi de und caracteristice elementelor lovite de electroni. Prin analiza acestor raze X cu aparate adecvate se pot obine estimri calitative i cantitative foarte exacte asupra elementelor cu numrul atomic mai mare de 12.

1.4.2.Tehnici fizice .biochimice,de biologie celular i molecular Tehnici fizice: - Fracionarea celulei prin centrifugare difereniat permite obinerea n stare pur a unor componente celulare, precum complexul Golgi, aparatul mitotic, ribozomi, etc.
O contribuie deosebit la perfecionare acestei tehnici a adus-o G.Em.Palade care a pus la punct centrifugarea n gel de sucroz.

- Criofracturarea permite despicarea membranelor celulare ngheate, la nivelul planului median al bistratului lipidic. - Autoradiografia localizeaz materialul radioactiv din esut.

5 - Historadiografia realizeaz o microradiografie cu raze X a unui preparat histologic. - Difracia razelor X, care a permis descifrarea structurii spaiale a proteinelor i a acizilor nucleici. - Difracia i dispersia de neutroni, prin care s-a descifrat organizarea molecular a cromatinei. - Rezonana magnetic nuclear de nalt rezoluie, ce se utilizeaz pentru studierea interaciunilor moleculare n membranele biologice. - Rezonana magnetic n impulsuri, folosit la studiul permeabilitii membranelor pentru ap i ioni. - Rezonana electronic de spin, ce folosete ca markeri specifici substane cu electroni impari care se ataeaz i evideniaz molecule de ADN, de proteine,etc. Spectrofluorometria,ce permite studierea vscozitii membranelor, difuziunea, rotaia proteinelor. Tehnici biochimice n biologia molecular se utilizeaz: - Electroforeza n gel de poliacrilamid, pentru studiiul proteinelor i acizilor nucleici. - Marcrile bazate pe fotoafinitate a unor pri din moleculelele integrate n structuri celulare. - Reconstituiri de structuri i funcii celulare din componentele purificate. - Imunocitochimia evideniaz reaciile dintre antigen i anticorp. Tehnici complexe de biologie celular i molecular Sunt reprezentate de: - Tehnica ADN-ului recombinat. - Producerea de anticorpi monoclonali cu ajutorul hibridoamelor, ce a permis descifrarea mecanismelor care regleaz exprimarea genei. - Sinteza artificial a genelor. - Manipulri de gene, etc. 1.5. Progrese conceptuale. Progresele teoretice sau conceptuale au permis mbogirea, dezvoltarea i aprofundarea cunotiinelor de biologie celular i molecular. Sunt reprezentate de: - Analiza i sinteza informaiilor obinute de morfologia celular, biochimia i biofizica celular, fiziologia celular, genetica molecular, imunologia celular i molecular, virusologie,etc. n acest concept se manifest dou tendine opuse: una de acentuare a sintezei i alta de extindere a sferei de sintez. - Molecularizarea informaiilor , care const n descifrarea structurilor i funciilor pn la nivel molecular. Acest fapt a dus la

6 schimbarea denumirii acestei ramuri a tiinelor biologice din "citologie general" n "biologie celular" i apoi n "biologie celular i molecular". - Integrarea informaiilor obinute prin toate metodele i de la toate nivelele ntr-un tot unitar, nct biologia celular i molecular studiaz n mod complex i complet aspectele morfofuncionale ale celululelor, observabile la microscopul optic, ultrastructurile relevate de microscopul electronic, organizarea i fiziologia molecular, realiznd o imagine exhaustiv a nivelului celular de organizare a materiei vii.

2. CELULA CA SISTEM BIOLOGIC

Prin sistem biologic se nelege un ansamblu de elemente (componente) interconectate ntr-o formaiune complex, relativ stabil, formaiune care se comport ca un ntreg, cu proprieti i funcii distincte cantitativ i calitativ de proprietile elementelor componente. Exist sisteme lipsite de via (abiotice), precum particulele subatomice, atomii, moleculele i sisteme dotate cu via ( biotice )cum ar fi celulele, esuturile, organele, organismul, populaia, biocenoza i biosfera. Celula (cellula) este primul sistem biologic care manifest cea mai important caracteristic a materiei vii - capacitatea de auto reproducere. Formele de "via molecular", identificate pn n prezent, ca "prionii" (microorganisme patogene, formate din particule proteice, far acizi nucleici) i virusurile (microorganisme ce conin acizi nucleici i proteine) sunt capabile s se reproduc numai n interiorul celulei. Celula, ca sistem, prezint urmtoarele caracteristici: Este un sistem deschis, pentru c are n permanen schimburi de energie i substan cu mediul extracelular. Are un caracter istoric, aprnd la un anumit moment al evuluiei materiei vii i putnd s dispar, atunci cnd materia vie i va produce o alt form mai eficient de organizare dect celula. Are caracter informaional, deoarece recepioneaz, acumuleaz, prelucreaz i transmite informaii cu ajutorul codului genetic. Prezint trei categorii de programe, legate de capacitile sale structurale i funcionale: a- programul " pentru sine", ce asigur autoconservarea celulei ( de expl. n culturile de celule); b- programe ale sistemelor componente, ca de exemplu programele organitelor sau ale complexelor moleculare; i c- programe superioare care asigur existena sistemelor superioare ( esut, organ, organism).

7 Echilibrul dinamic, ce se manifest printr-o "pendulare" continu, fa de o stare morfofuncional optim, stabil. Autoreglarea sau "feed back"-ul, prin care i controleaz procesele interne, n funcie de relaiile cu mediul prin mecanisme de tip cibernetic. Heterogenitatea intern este nsuirea de a fi alctuit din elemente componente mai mult sau mai puin diferite ( de expl. mitocondrii, ribozomi, microfilamente, microtubului,etc.) Integralitatea, prin care celula ca sistem, nu se reduce la suma nsuirilor elementelor componente, ci prezint nsuiri noi (structurale i funcionale) pe care nu le au aceste elemente considerate izolat. Aceast nuire permite desfurarea funciilor biologice fundamentale: metabolismul, reproducerea, adaptarea, meninerea strii de stabilitatea difereniat,etc. Pe baza acestor caracteristici, concepia actual despre celul o definete ca fiind: unitatea elementar a lumii vii, produs al evoluiei, cu structur complex, n relaie de autonomie i echilibru dinamic cu mediul nconjurtor, avnd ca proprieti eseniale metabolismul, autoreproducerea, creterea i dezvoltarea. 2.1. Arhetipurile celulare Exist dou arhetipuri (arhetip = model primar, dup G.E.Palade) celulare: procariotele (procariot =prenucleat, fr nucleu distinct) i eucariotele (eukariot= cu nucleu distinct). 2.1.1. Procariotele Sunt reprezentate, n principal, de bacterii i de algele albastre verzi (denumite i cianobacterii). Ele sunt mai mici (1-10 m) dect celulele eucariote i lipsite de membrane intracelulare. Organitele celulare sunt puine ( numai ribozomi) sau absente. Nucleul nu apare distinct, genomul (totalitatea genelor) nefiind separat de citoplasm. Prezint un cromozom unic, dispus n citoplasm i reprezentat de un ADN circular neconjugat cu proteine. ARN-ul i proteinele sunt sintetizate n acelai compartiment, n citoplasm. Nu au aparat mitotic, deoarece se nmulesc prin sciziparitate. i realizeaz locomoia prin flageli simpli. Au metabolism aerob sau anaerob. Sunt delimitate de o membran plasmatic, ce trimite prelungiri endocelulare, denumite mezozomi, dublat la exterior de un perete celular. Nu prezint citoschelet, nu au cureni citoplasmatici, iar endocitoza i exocitoza sunt absente. De obicei sunt monocelulare.

2.1.2.Eucariotele Sunt reprezentate de protiste, fungi, plante i animale. Au dimesiuni mai mari (5-100 m) dect procariotele. Prezint un sistem complicat de membrane intracelulare, care delimiteaz unele componenete intracelulare (nucleul) i unele organite (mitocondriile, reticulul endoplasmic,complexul Golgi,etc). Au un nucleu distinct, n care este situat genomul, ce cuprinde mai muli cromozomi. Molecula de ADN este foarte lung i conjugat cu proteine. ARN-ul este sintetizat i procesat n nucleu, n timp ce proteinele sunt sintetizate n citoplasm. Au citoschelet compus din proteine filamentoase, cureni citoplasmatici i desfoar procese de endocitoz i exocitoz. Prezint aparat mitotic.Se divid prin mitoz i meioz. 2.2 Morfologia general a celulelor eucariote Dimensiunile celulelor eucariote sunt extrem de variate. Ele se exprim n urmtoarele uniti de msur: micrometrul, nanometrul i angstromul. Unitile de msur folosite n morfologia microscopic Denumire Micrometrul ( = micronul ) Nanometrul Angstrom Simbol m ( ) nm A Valoare 1 m =0,001 mm = 10 6 m 1 nm = 0,001 m = 10-9 m 1A=0.1nm=10-4um=10-10m

Limita practic de rezoluie a ochiului uman este de cca. 0,1 mm, a microscopului optic de 0,2m, iar a celui electronic de 2 angstromi( ). Pentru fiecare categorie de celule, dimensiunile sunt relativ constante, indiferent de specie sau mrimea organului. Diferenele de greutate a aceluiai organ la specii diferite sunt generate de numrul de celule pe care l conin i nu de volumul celulelor.
De exemplu, nefrocitele i celulele musculare cardiace au dimensiuni apropiate la hominide, ecvine i canide.

Limitele de rezoluie in morfologie A. Cu ochiul liber 0,1 milimetri (mm) Ovocitul de pasre Ovocitul uman Amoeba

9 B. Cu microscopul optic 0,2 micrometri sau microni ( sau m) Celule, Hematii, Neuroni Nuclei Mitocondrii Bacterii, etc Ribozomi, Virusuri, Organite celulaere Macromolecule molecule

C. cu microscopul electronic

2 Angstromi () sau 0,2 nanometri (nm)

* Prin rezoluie se nelege distana minim dintre dou puncte n care acestea pot fi percepute ca imagini seperate

Fig.2.1.Diagrama unitilor de lungime

Dimensiunile medii ale diametrului celulelor se ncadreaz ntre 10-30 m, dar n organismul animalelor exist i celule mai mici, precum: neuronii din stratul molecular al scoarei cerebrale ( de cca.4-4 m), eritrocitele (5-7 m), precum i celule ce ajung la dimesiuni foarte mari, un exemplu constituindu-l ovulul ce atinge un diametru de 150-200 m la mamifere, 3,5 cm la psri i 10 cm la stru. Neuronii motori din coarnele ventrale ale mduvei spinrii au un corp ce atinge un diametru de 200 m, iar dac se iau n considerare i prelungirile ajung la o lungime de 1-1,5 m sau mai mult, n funcie de talia animalului. Fibra muscular striat are un diametru de ordinul micronilor, dar lungimea este foarte variat, de la 1 la 12 cm.

10 Volumul celulelor variaz n limite foarte largi de la 200 la15000 micrometri cubi (m3), menndu-se constant pentru un anumit tip de celul, independent de mrimea organului, aspect cunoscut sub denumirea de "legea constanei volumului". Vrsta i funcia determin variaii n mrimea celulelor. Se observ o reducere a volumului celular n cursul embriogenezei timpurii, n cursul mbtrnirii i o cretere volumetric n timpul dezvoltrii postnatale. Se stabilete un raport nucleo/citoplasmatic optim, un raport al suprafeei celulei fa de volum i un raport ntre metabolism i volumul celulei. Masa (greutatea) unei celule este de aproximativ 10-12 g, iar cea a unui ovocit uman de 10 -8 g.

Fig.2.2. Forma celulelor 1-Ovula; 2-Hematie de mamifer; 3-Eritrocit de pasre; 4-Neutrofil de mamifer; 5Spermatozoid; 6-Celule poliedrice;7-Celule pavimentoase; 8-Celule cubice; 9-Leiocit; 10-Neuron piramidal; 11-Neuron piriform; 12-Celul mezenchimal; 13-Fibroblast;14-Melanocit,15-Adipocit alb; 16-Histiocit; 17-Celul prismatic cu platou striat; 18-Celul caliciform.

Forma celulelor, inial sferic se modific n cursul diferenierii i maturrii celulelor. Forma celulelor este controlat att de factori externi ca presiunea i vscozitatea mediului, ct i de factori interni ca activitatea funcional, vrsta, vscozitatea citoplasmei, structura intern i caracteristicile suprafeei.(Fig.2.2 ) Forma celulelor se adapteaz la funcie, respectndu-se o lege general a biologiei, conform creia se obine maximum de randament funcional cu minimum de cheltuieli materiale i energetice.Astfel,celulele contractile sunt fuziforme sau cilindrice, iar celulele specializate n conductibilitate prezint numeroase prelungiri. Numrul celulelor este extrem de mare, ajungnd la ordinul de milioane de miliarde (1014).

11
Celulele sanguine reprezint populaia cea mai numeroas, reprezentat de mai multe zeci de miliarde. Numrul hepatocitelor i al neuronilor este de circa 100 de miliarde, iar cel al nevrogliilor este de aproximativ 10 ori mai mare dect numrul neuronilor.

Durata vieii celulei sau ciclul celular reprezint intervalul de la apariia unei celule pn i termin propria sa diviziune.
Variaz de la 10-20 minute pn la 109 minute. Celulele bacteriene triesc cteva zeci de minute, celulele epiteliale 1-2 zile, hematiile 127 zile, iar unele celule musculare i nervoase toat viaa individului. La om, n fiecare secund au loc peste 4 milioane de diviziuni celulare, ntr-o zi au loc cca. 350 bilioane diviziuni, iar ntr-un an 1014 diviziuni, numr egal practic cu numrul total al celulelor ce alctuiesc corpul omului adult.

2.3. Compartimentarea celulelor eucariote Celula eucariot prezint trei componenete principale: membrana, nucleul i citoplasma.(Fig.2.3) Membrana poate fi situtat la periferie, realiznd pe de o parte delimitarea celulei de mediul extracelular, sau poate fi dispus n citoplasm, unde formeaz un sistem de membrane intracelulare cu o suprafa deosebit de activ biologic, de 10-20 ori mai mare dect cea a membranei periferice.

Fig.2.3. Schema unei celule eucariote ideale 1-Membrana celular;2-Nucleul; 3Citoplasm; 4-Lizozom primar; 5Poliribozomi liberi; 6-Reticul endoplasmic rugos; 7-Reticul endoplasmic neted; 8Complex Golgi; 9-Microfilamente; 10-Microtubuli; 11Centrioli; 12-Corpuscul bazal; 13-Microvili; 14-Cil; 15- Fagozom; 16-Peroxizom; 17Caveol acoperit; 19-Nucleoli; 20eterocromatin; 21- Cistern perinuclear; 22-Por nuclear; 23Mitocondrie; 24-Corp rezidual; 25-Granule de secreie; 26-Pictur de lipide; 27Granule de glicogen; 28-Pseudopode.

Membranele intracelulare, endomembranele sau citomembranele difer ntre ele prin structur, compoziie chimic i funcie. Ele mpart celula n dou compartimente: compartimentul matriceal sau plasmatic "P" i compartimentul intracisternal sau "E". Exist i un compartiment secundar sau de tip "C", reprezentat de matricea mitocondrial i a cloroplastelor.

12 Totodat endomembranele delimiteaz nucleul i unele organite celulare (lizozomii, reticulul endoplasmic,complexul Golgi). Exist i organite nedelimitate de membrane (ribozomii,centriolii, corpusculii bazali, microfilamentele, filamentele intermediare i microtubulii).