DIAGNOSTIC SEROLOGIC IN INFECTIA HIV

1. DIAGNOSTIC SEROLOGIC IN INFECTIA HIV/SIDA

TESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta
ELISA de detectie a Ac antivirali
TESTE RAPIDE

TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta

WESTERN BLOT
RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA) IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

2. DETECTIA DIRECTA A VIRUSULUI SAU A PRODUSELOR VIRALE

IZOLARE VIRALA DETECTIA ANTIGENEMIEI p24 ELISA de detectie a Ag virale DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL

TESTE DE TRIAJ

Principiul ELISA de detectie a anticorpilor antivirali

Anticorpii sunt detectati cu ajutorul unui CONJUGAT ce contine un marker enzimatic (cel mai frecvent peroxidaza) apoi evidentiati prin o reactie de culoare la adaugarea SUBSTRATULUI. Reactia este citita cu ajutorul spectrofotometrului, existnd n fiecare reactie ELISA martori pozitivi si negativi; in final se citesc densitatea optica sau absorbanta pentru fiecare proba si martor. In protocolul de reactie sunt precizate criteriile de validare a probei (respectiv, raportul valorilor absorbantei citite la spectrofotometru pentru martorii pozitivi si negativi) si criterii de pozitivitate (prin compararea cu valorea prag (n engleza - "cut-off").

ELISA de detectie a anticorpilor antivirali

TEHNICA INDIRECTA

ETAPE 1. Incubare ser pacient 1h la 37C 2. Spalare 3. Incubare conjugat (Ac anti IgG uman x enzima)- 1h la 37C 4. Spalare 5. Incubare substrat 20 30 min la temp camerei 6. Citire la spectrofotometru DO probe, martori, cut off, zona gri

TESTE DE CONFIRMARE Tehnica WESTERN BLOT

Principiu: WB este o tehnica de detectie raspunsului imun antiviral defalcat pe grupe antigenice distincte (de ex. pentru infectia HIV: anticorpi anti-gp120, anticorpi anti-gp41, anticorpi anti-p24, etc). ETAPE: 1. SDS-PAGE electroforeza in gel de policacrilamida in prezenta unui detergent anionic (sodium dodecyl sulphate). 2. BLOT (transfer) - transferul antigenelor virale din gelul de policacrilamida pe o membrana de nitroceluloza 3. DETECTIA ANTICORPILOR din serul pacientului prin punerea in contact a serului de cercetat cu membrana de nitroceluloza, si urmarirea aparitiei benzilor colorate induse de prezenta anticorpilor prin aparitia reactiei imunoenzimatice.

(2)

(1)

Etapele WESTERN BLOT

(1) SDS-PAGE (2) BLOT (transfer) (3) DETECTIA ANTICORPILOR
(3)

WESTERN BLOT detectia Ac serici (3)

Substrate Stop

Antiviral antibody

color

gp160 gp120

Western blot in infectia HIV

Criteriul minim de pozitivitate
2 env + 1 gag

p66

p55 p51

gp41

p31 p24

p17 p10/11 p7/9

DIAGNOSTIC SEROLOGIC IN INFECTIA HIV

ELISA
NEGATIV= ABSENTA INFECTIEI HIV POZITIV IN DUPLICAT

WESTERN BLOT
NEGATIV

POZITIV= INFECTIE HIV

! Ferestra serologica
risc rezidual al transfuziei = 2/1 milion

INDETERMINAT
repeta la 6-8 saptamini alt test de confirmare

Ag p24- 1.48/1 milion ADN proviral1.48/1 milion ARN HIV 1.01/1 milion