PROIECT BIOTEHNOLOGII SI BIOREMEDIERE

BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE

Elaborat de stdentii :

BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE

Biotehnologia este o

tiin

complex , ce se caracterizeaz

prin utilizarea

integrat a biochimiei microbiologiei, biologiei celulare i a ingineriei genetice. (fig. 1.1).

Figura 1.1. Biotehnologia o tiin -Bios care nseamn via ,

complex

Denumirea de biotehnologie provine de la cuvintele grece ti: -Tehnikos care nseamn tehnici i -Logos care nsemn studiu al. Biotehnologia este aplicat in diverse domenii, cum arfi: agricultur , industria alimentar produc ie industrial , mediu i medicin . Biotehnologia alimentar se refer la prelucrarea industrial a diferitelor materii prime cu ajutorul microorganismelor unor procese tehnologice. i enzimelor proprii sau a unor agen i biologici (microorganime,enzime) ad uga i n scopul realiz rii unor produse sau a amelior rii

PREPARATE ENZIMATICE

Aspecte generale Enzimele sunt din punct de vedere structural proteine constituite din aminoacizi, iar din punct de vedere func ional ac ioneaz ca ni te biocatalizatori biologici care au rolul de a permite realizarea unor reac ii cu o vitez m rit . Enzimele sunt utilizate drept catalizatori n condi iile n care exist chimici, deoarece prezint urm toarele avantaje: 1. Au capacitatea de a cataliza reac iile chimice n condi ii blnde de temperatur , pH, presiune. Aceasta permite un consum mai redus de energie i nu necesit echipamente scumpe rezistente la coroziune. 2. Enzimele sunt catalizatori specifici, deseori stereoselective, care nu conduc la ob inerea de produ i de reac ie secundari nedori i. n aceste condi ii nu sunt necesare cheltuieli mari privind rafinarea i purificarea produsului ce urmeaz a fi fabricat. 3. Comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din punctul de vedere al mediului compu i biodegradabili care nu necesit costuri semnificative de epurare. 4. Anumite enzime nu sunt limitate numai la ac iunea n mediul apos, putnd ac iona i la interfa a dintre dou faze, ap : solvent organic sau ap :ulei etc. Totu i exist i o serie de dezavantaje: - au stabilitate limitat ; - de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singur dat . Clasificarea enzimelor. Enzimele se clasific Comisia de Enzime a Uniunii Interna ionale de Biochimie (1979). Conform acestor clasific ri exist 6 clase principale grupate conform cu reac iile pe care le catalizeaz astfel: 1. Oxidoreductaze care catalizeaz hidrogen, oxigen sau electroni; 2. Transferaze care catalizeaz transferul unei grup ri de pe o molecul pe alta; 3.Hidrolaze ce catalizeaz covalente; 4.Liaze, care catalizeaz oxidare; 5.Izomeraze ce catalizeaz rearanjarea structural a moleculelor; scindarea leg rutilor chimice altfel dect prin hidroliz sau scindarea hidrolitic (implic apa) a leg turilor chimice reac ii de oxidoreducere, transfer de atomi de conformsistemului stabilit de i catalizatori

6.Ligaze sau sintetaze care catalizeaz formarea de noi leg turi te tip C-N, C-O, C-C, C-S, cu consumare de ATP. Utiliz ri ale enzimelor n industrie: Principalele domenii n care enzimele i-au g sit utiliz ri sunt: - Fabricarea unor produse prin transformarea enzimatic a amidonului; - La fabricarea altor produse alimentare : produse lactate, bere, sucuri, vin, panifica ie; - n compozi ia detergen ilor; - Industria textil , hrtiei i a furajelor pentru animale; - Sinteza catalitic a unor substan e chimice; - Analiza alimentelor, diagnoz chimic - Inginerie genetic ; Biotehnologia preparatelor enzimatice este un domeniu de baz al biotehnologiei, avnd drept scop studierea tehnicilor de ob inere a preparatelor enzimatice folosind materii prime de origine animal , vegetal liber sau imobilizat i microbian , sub form pentru a fi folosite ca agen i biologici n industria alimentar , n i terapie;

industria furajelor, industria textil , detergen ilor farmaceutic , cosmetic , chimic , etc. Prin utilizarea preparatelor enzimatice, tehnologiile tradi ionale se transform ponderea de utilizarea a preparatelor enzimatice n diferite ramuri. biotehnologii, devenind mai eficiente i mai pu in poluante. n figura 1.2. este prezentat

Figura 1.2. Poderea utiliz rii preparatelor enzimatice A a cum se observ din datele de mai sus, cea mai mare pondere o are utilizarea n industria alimentar , urmat de industria detergen ilor. n figura 1.3. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice produse pe plan mondial. Cea mai mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de amilaze.

Figura 1.3. Principalele tipuri de preparate enzimatice Tipuri de preparate enzimatice. Preparatele enzimatice se comercializeaz purificare: Preparate enzimatice solide: 1. Preparate enzimatice brute, sub form m cinarea mediului fermentat; 2. Preparate sub form analitic cristalizat , enzime pure utilizate preponderent n chimia i ingineria genetic ; de pulbere, ob inute prin uscarea i sub diverse forme i grade de

3. Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate n amestec cu substan e crioprotectoare, care sunt urcate n vacum la temperaturi de -20......-50 C.

Preparate enzimatice lichide

1. Preparate enzimatice brute, form

sub care se livreaz

enzimele extracelulare

(eliberate de c tre microorganisme n mediul de cultur n timpul fermenta iei). 2. Preparate par ial purificate, n care se adaug conservan i pentru a le m ri stabilitatea n timp. In tabelul de mai jos sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice, sursele din care se ob in i aplica ile n industria alimentar . Surse de enzime Preparatele fabricate la scar industrial folosesc trei tipuri de surse: esuturi animale i vegetale saumicroorganisme. Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din industria c rnii (ficat, pancreas, inim , rinichi, creier, mucoas surse este pe scar stomacal i intestinal ). Utilizarea acestr din ce n ce mai redus , fiind nlocuite de sursele microbiene,

deoarece sursele animate prezint o serie de dezavantaje, cum ar fi: produc ia limitat , apari ia unor boli cum ar fi encefalopatia spongiform la bovine. Principalele enzime de origine animal care se ob in sub form de preparate sunt chimozin (renina) care se extrage din stomacul de miel sau vi ei care se utilizeaz pentru coagularea laptelui la fabricarea brnzeturilor. O alt enzim este industria farmaceutic . Sursele vegetale sunt reprezentate de semin e(germinate sau negerminate), r d cini, fructe, sev , latexuri, frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru ob inerea preparatelor enzimatice ridic o serie de probleme, cum ar fi: prezen a unor substan e poten ial d un toare s n t ii omului (ex. Compu ii fenolici) sau a unor compu i toxici de comtaminare. Aceste dezavantaje face ca sursele de origine vegetal s fie destul de pu in utilizate. Principalele enzime ob inute din surse vegetale sunt. : - papaina, proteaz ob inut din latexul fructelor de Caryca Papaia. Enzima este utilizat pentru enderiyarea c rnii sau n industria berii; - ficina, proteaz ob inut din latexul fructului de smochin (Ficus carica), utilizat pentru degradarea proteinelor miofibrilare. - bromelina, proteaz ob inut din sucul de ananas ( Ananas comosus ), folosit pentru hidroliya proteinelor colagenice. -amilaza pancreatic care are utiliz ri n

Alte enzime de origine vegetal sunt lipoxigenaza dinsoia i complexul enzimatic din mal ( amilaze, proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale acestor enzime nu sunt purificate, fiind sub form reprezint principala surs de f in de soia sau de mal . Microorganismele pentru ob inerea de preparate enzimatice. Avantajele

utiliz rii microorganimelor constau n: - microorganismele se pot ob ine n cantit i mari (biomas ) prin cultivare n instala ii speciale pe medii de cultur ieftine (t r de soia sau floarea soarelui, zer) ; - ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt fa animalelor; - produc ia de enzime de c tre microorganisme poate fi m rit optime fizice i chimice pentru producerea de enzime; - propriet ile enzimelor i specificitatea de ac iune difer cu natura microorganismelor produc toare, astfel industrial se pot ob ine preparate care corespund ntocmai scopului dorit. - preparatele enzimatice ob inute pot avea activit i diferite cu predominan a unei activit i. Tehnologii de ob inere a preparatelor enzimatice Schema tehnologic general de ob inere a preparatelor enzimatice este prezentat n figura Tehnologia de ob inere a preparatelor enzimatice implic opera iile indicate n schema prezentat n fig. 1.4. din care rezult ca preparatele enzimatice pot fi ob inute sub form de: - preparate enzimatice brute-uscate; - preparate enzimatice brute lichide concentrate; - preparate enzimatice purificate concentrate, respective i uscate. prin selectarea i utilizarea de tulpini mutante, inalt performante (productive) i prin stabilirea condi iilor de cel al plantelor sau de gru, extract de porumb, melas , roturi

Figura 1.4. Schema tehnologic general de ob inere a preparatelor enzimatice Procesele biotehnologice de ob inere a preparatelormicrobiene sunt complexe, realizarea lor presupune parcurgerea a trei etape: 1. Preg tirea mediului de cultur , prin prelucrarea mecanic i fizico chimic a materiilor prime ce intr n compozi ia mediului de cultur (fermentativ). Aceast etap presupune opera ii de dozare, m run ire, solubilizare, sterilizare etc. 2 Etapa biologic care const n ob inerea culturilor starter intermediare i a culturii de produc ie, urmat de etapa fermentativ prorpiu-zis . 3. Etapa de separare, purificare i standardizare a enzimelor. A. Preg tirea mediului de cultur Materii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de cultur . Materiile prime trebuie s asigure principalii nutrien i microorganismelor n de carbon (surs de energie) pentru vederea dezvolt rii lor n timpul fermenta iei. Surse de carbon. Principala surs microorganisme o constituie glucidele, sub form de glucoz , fructoz , galactoz care

sunt u or asimilabile, n timp ce maltoz , zaharoza i lactoza sun asimilate doar dac microorganismele posed enzime capabile s le transforme n monoglucide. Poliglucidele pot fi utilizate doar de c tre microorganismele apte s sitetizeze enzimele care s le hidrolizeze extracelular n monoglucide capabili s difuzeze prin membrana celular . Ca surse de carbon n re etele mediilor industriale se folosesc urmatoarele: - Melasele care provin de la rafinarea zah rului. - Extractul de porumb, este reprezentat de extractul ob inut din industria amidonului dup ce sufer o concentrare pn la 50% S.U. - Le iile sulfitice provin din industria hrtiei ca urmate a transform rii masei lemnoase n pulp celulozic sub ac iunea bisulfitului de calciu. Surse de azot. Azotul din mediul de cultur are rol anabolic, participnd la biosinteza proteinelor structurale, a enzimelor i acizilor nucleici.

Figura 1.5. Schema bloc pe opera ii de ob inere a preparatelor enzimatice microbiene brute Tehnici de fermenta ie Pentru produc ia de preparate enzimatice de originemicrobian se poate aplica dou tehnici de baz : Fermenta ia de suprafa n care se utilizeaz unmediu solid pe care se cultiv microorganismul (de regul un mucegai filamentos). Aceast tehnic are avantajul c mediul de cultur va deveni un mediu bogat n activitate enzimatic ; Fermenta ia de submers , n care mediul este lichid ce se afl ntr-un reactor unde to i parametrii fermenta iei sunt perfect controla i. Aceast ultim tehnic este superioar primei metode din punct de vedere tehnologic i biochimic. Dintre speciile de microorganisme ce se folosesc men ion m urm toarele : Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Saccharomyces cerevisiae, Endothia parasitica, Penicillium emersonii, Kluyveromyces lactis, Bacillus

amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola. La sfr itul fermenta iei microorganismul trebuie distrus cu condi ia p str rii intacte a activit ii enzimatice. Microorganismele cultivate pot produce enzime extracelular sau intracelular. n func ie de tipul acestora variaz i procedeul de extrac ie. n ceea ce prive te tipurile de culturi submerse, ne putem situa n unul din urm toarele cazuri: Procedeul nealimentat, n care caz toate ingredientele mediului de fermentare sunt preg tite n fermentator la pH-ul i temperatura dorit nainte de a introduce inoculum. Dup introducerea inoculum, fermenta ia principal ncepe i finalizarea ei se urm re te prin prelevarea de probe, n mod steril, care arat : - cre terea microorganismelor (biomas , vscozitatea mediului) ; - concentra ia n enzim (activitatea enzimatic a mediului) ; - consumul de glucide ; - nivelul de proteine. La procedeul nealimentat se pot monta diferi i senzori care arat : - pH-ul care se poate regla prin adaus de baze sau acid ;

- temperatura care se poate regla prin debitul de circula ie al apei reci n mantaua fermentatorului sau n serpentina din interiorul fermentatorului ; - nivelul de spum care se poate combate cu un antispumant aflat ntr-un rezervor ata at fermentatorului; - presiunea care se regleaz prin supape care se deschid la presiuni de 1 pn la 3 bar ; - coeficientul respirator QR care se m soar prin cantitatea de CO2 produs fa cantitatea de oxigen consumat ; - nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza efluen ilor. Procedeul alimentat, n care se ncepe cu un volum de 10 30% de substrat n care se introduce inoculum, dup care fermentatorul se alimenteaz cu restul de mediu, dup care oprirea fermenta iei se face dup un anumit timp fixat experimental. Acest procedeu se aplic n cazul n care sinteza enzimelor ar fi reprimat de concentra iile ridicate ntr-unul din nutrien ii mediului de cultur provoca cre terea vscozit ii, care trebuie s fermentatorului poate fi repetat sau n cazul cnd cre terea n timp. Alimentarea 30%, care microorganismelor, n func ie de concentra ia n unul din componen ii mediului, ar fie reglat de mai multe ori efectundu-se sutiraje (evacu ri) de

programate, dar ntotdeauna trebuie l sat n fermentator un volum de serve te n acest caz drept cultur de produc ie.

Fig. 1.8. Cultivarea submers a microorganismelo Procedeul continuu necesit alimentarea continu a fermentatorului cu mediu i folosirea unei culturi concentrate de microorganisme. n acest caz, bioreactorul (fermentatorul) de dezvoltare a celulelor este cuplat cu o unitate de micro sau ultrafiltrare. n figura 1.9. se arat biomasa. schi a unei astfel de instala ii format dintr-un bioreactor cuplat cu o unitate de ultrafiltrare la care exist i posibilitatea de a recicla

Procedeul continuu Avantajele unui astfel de procedeu sunt urm toarele : -se poate detoxifica mediul de cultur prin eliminarea produsului de inhibare ; -celulele reciclate devin perfuzate ; -cantitatea de mediu de cultur care se introduce n bioreactor este controlat de cantitatea de permeat care traverseaz membrana de ultrafiltrare ; -celulele au posibilitatea de a se dezvolta pn substan uscat /l, n cazul drojdiilor) ; eficace fa de la concentra ii relativ mari (~ 300 g

-aceste concentra ii mari de celule se constituie ca o barier contaminarea exterioar ;

-retenatul poate fi evacuat i el periodic, fiind constituit din biomas care con ine enzime intracelulare, dup care este trecut la prelucrare ulterioar (extrac ie) ;

-permeatul de la ultrafiltrare, care con ine enzime nu mai are celule microbiene i poate fi, deci, stocat sau dirijat direct la o opera ie n aval de purificare sau concentr are. Neajunsurile acestui procedeu de ob inere a biomasei i enzimelor sunt urm toarele : -membranele trebuie s fie rezistente la sterilizarea cu vapori de ap substan e chimice ; -costurile energetice sunt destul de ridicate; -mediul de cultur poate fi colmatant pentru membrana de ultrafiltrare; -chiar la densit i mari de celule, la sfr itul ciclului de dezvoltare este posibil de ultrafiltrare, fapt care conduce la mic orarea vrstei medii a celulelor care r mn n sistem. O variant a procedeului continuu de ob inere a biomasei/ enzimelor const n folosirea bioreactorului cu membran . C. Etapa de separare a enzimelor Extrac ia. La procedeul discontinuu (nealimentat) i cel alimentat, dup terminarea fermenta iei se separ partea solid insolubil (celule i produse insolubile) de partea lichid care con ine enzimele, separare care se poate face prin centrifugare, filtrare frontal sau microfiltrare. Solu ia steril ob inut este apoi ultrafiltrat pentru a concentra enzimele. n cazul n care enzimele sunt destinate a intra n compozi ia unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se stabilizeaz cu polioli (sorbitol, glicerol) i/sau s ruri (NaCl, MgSO4), respectiv se adaug bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat). n cazul n care enzima (enzimele) intr comercial pulbere, ultrafiltratul se suplimenteaz fi realizat o filtrare steril . Pentru a ob ine n compozi ia unui preparat i se usuc prin cu un suport o oarecare liz a celulelor, ceea ce face necesar o purjare a bioreactorului prin unitatea i la igienizare cu

atomizare (suplimentarea se face cu amidon, dextrine). nainte de atomizare mai poate i enzimele intracelulare, biomasa din fermentator, separat de partea lichid , este supus lizei. Liza poate fi realizat chiar de enzimele proprii microorganismelor ce alc tuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum ar fi lizozimul din albu ul de ou, preparate enzimatice exogene complexe de natur bacterian care con in chitinaz , mananaz , glucanaz , proteaze, cteodat n combina ie cu adaosul de metabisulfit.

n cazul n care enzima este periplasmic , un oc osmotic este suficient pentru a elibera enzimele. Se poate realiza i o liz mecanic (folosire de presiuni mari de 600 1000 bar, urmat de detenta brutal ) Se pot folosi i ultrasunetele cu frecven e mai mari de 20 MHz pentru liza celulelor i deci pentru eliberarea enzimelor intracelulare. Odat eliberate, enzimele intracelulare sunt supuse opera iilor aplicate extracelulare. eparatele enzimatice se comercializeaz de regul pulbere, de microgranule, precum i sub form lichid . Preparatele enzimatice sub form de pulbere sunt formulate cu un suport cum ar fi amidonul, maltodextrinele, zah rul, sarea. La aceste preparate se controleaz granulometria, umiditatea (~ 6%). Suportul trebuie s nu fie higroscopic pentru a se evita formarea de cocoloa e. n preparatele comerciale pulbere sau lichide, con inutul de enzim este redus raportat la suport i de aceea cantitatea de preparat comercial este mult mai mare, n compara ie cu nivelul de enzim con inut. n ceea ce prive te preparatele comerciale microgranulate, acestea se ob in dintr-un ultrafiltrat care se amestec cu un suport (sare, amidon solubil, maltodextrine etc.). Cantitatea de substrat este astfel calculat nct s se ob in titrul enzimatic dorit n microgranule. Amestecul respectiv este pulverizat mpreun cu un agent liant care reprezint 0,1% pn la 0,5% fa de masa suportului. Pic turile pulverizate sunt uscate ntr-un turn de uscare, cu aer la 70 - 90C. Preparatele comerciale lichide sunt formulate n general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se utilizeaz n propor ie de 20 50% fa de preparatul lichid. La aceste formul ri se adaog o substan bacteriostatic (de exemplu benzoat de sodiu n propor ie de 0,1 0,2%). Enzime imobilizate Imobilizarea unei enzime (sau a unui system multifunc ional) nseamn legarea sau fixarea acesteia de un suport care trebuie s ndeplineasc urm toarele condi ii : -s fie insolubil n ap ; -s asigure p strarea propriet ilor catalitice ale enzimelor, respectiv specificitatea de ac iune ; -s asigure ac iunea enzimei la un pH i temperatur optime, apropiate de cele ale enzimelor libere (neimobilizate). i enzimelor sub form de

Avantajele imobiliz rii enzimelor sunt urm toarele : cre terea stabilit ii enzimei, ca protein este n leg tur consecin i ca activitate catalitic . Aceast stabilitate cu diminuarea gradului de libertate al macromoleculei, ceea ce are

asupra varia iilor de conforma ie a enzimei (se diminueaz aceste varia ii).

Imobilizarea conduce i la cre tere a concentra iei locale a proteinenzimei care are un efect stabilizant; se poate lucra n flux continuu din punct de vedere al catalizei enzimatice, dar i din punct de vedere al regl rii automate a parametrilor de lucru; enzima nu p trunde n substratul ce se trateaz n cursul catalizei enzimatice; se poate modula micromediul n care ac ioneaz refolosirea treptat enzima imobilizat (concentra ie se poate substrat, nc rcarea suportului cu enzim , grup rile hidrofile); a enzimei, deci cu aceea i cantitate de enzim transforma o cantitate mai mare de substrat; se poate lucra n sistem semicontinuu sau continuu, putndu-se automatiza procesul, ceea ce asigur un control riguros al parametrilor de lucru; are loc o cre tere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat i al concentra iei acestuia; se poate stopa reac ia enzimatic la momentul dorit i se evit trecerea enzimei n produsul transformat; costurile globale de produc ie sunt mai mici n compara ie cu procedeele n care se folosesc enzime libere; se pot folosi i enzime care nu sunt trecute n liste GRAS (Generally Reconized as Safe); Exist i dezavantaje, cum ar fi: costuri privind imobilizarea; pierderi ale activit ii enzimatice, o investi ie ini ial n utilaje mai mare, un proces mai complex din punct de vedere tehnic i o supraveghere mai atent ; utilizarea numai a unor substraturi solubile.

Aspecte teoretice privind enzimele imobilizate. n cazul enzimelor imobilizate se observ un comportament cinetic diferit fa de cel al enzimelor libere, solubile. Activitatea enzimatic scade ca urmare a imobiliz rii. Acest lucru se datoreaz schimb rilor conforma ionale ale enzimei dup imobilizare. O astfel de modificare apare n primul rnd n cazul leg rii covalente a enzimelor de suport. Un alt aspect este influen a mediului, n cazul enzimelor imobilizate acesta este diferit de cel apos. Factorii critici care trebuie lua i n considera ie la folosirea enzimelor imobilizate Ace ti factori se refer la - eficien a economic a imobiliz rii determinate de : -costul enzimei, costul suportului, costul tehnicii de imobilizare ; - activitatea enzimei imobilizate care este influen at produsului (lor) de transformare ; - caracteristicile substratului ce trebuie transformat ; - stabilitatea enzimei care trebuie men inut activ un timp ct mai ndelungat ; - contaminarea microbiologic a sistemului enzim /suport n timpul utiliz rii reactorului respectiv. Microorganisme utilizate n industria alimentar BACTERIILE utilizate n industria alimentar apar in urm toarelor genuri: Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii sub form de coci sferici sau ovali, grupate n diplo sau form de lan uri. Sunt Gram pozitive, facultative anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii fiind capsulate. Importan i pentru industria alimentar sunt: Streptococii mezofili : Streptococcus lactis (Lactococcus lactis subsp. lactis), Str. cremoris (Lactococcus lactis subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus lactis subsp. diacetilactis); Streptococii termofili: Str. thermophilus. Ace ti streptococi lactici sunt homofermentativi, produc acid lactic L(+) i prezint urm toarele activit i: - activitate fermentativ : fermenteaz lactoza i glucoza; - activitate proteolitic ; - produc diacetil i acetoin din acid citric ( n principal Str. diacetilactis). de : tehnica de imobilizare; i a caracteristicile materialului suport, viteza de difuzie a substratului la enzim

Genul Leuconostoc Acest gen cuprinde bacterii cu form sferic , lenticular , grupate n perechi sau lan uri, imobile, asporogene, Gram negative, facultativ anaerobe. Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine (acid nicotinic, tiamin , biotin ) i zaharuri fermentescibile. Nu sunt proteolitici i nu reduc azota ii. Specii de Leuconostoc formeaz polimeri (dextran). Se dezvolt bine la 20-30 C. Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc cremoris (citrovorum); Leuconostoc lactis; Leuconostoc dextranicum; Leuconostoc mezenteroides. Aceste specii sunt heterofermentative i se dezvolt greu n laptele f r adaos de stimulatori. n produsele lactate, leuconostocii au dou func ii de baz : - produc compu i de arom (diacetil, acetoin ); - produc ochiuri de fermentare prin formare de CO2 n unele tipuri de brnzeturi (Edam, Goude, Tilsit). Ambele func ii sunt realizate prin metabolismul citratului, dar leuconostocii produc CO2 i din lactoz . Leuconostocii intervin deci n metabolismul glucidelor i al citratului. Metabolismul glucidelor Fermentarea glucidelor de c tre leuconostoci se face pe calea fosfocetohexozelor, dintr-un mol de hexoz regenerndu-se cte un mol de ATP. Genele care codific etapele ini iale ale ferment rii lactozei (ca de altfel i ale metaboliz rii citratului, producerii de proteaze) sunt localizate n plasmide. Metabolismul citratului Metabolismul citratului de c tre leuconostoci este acela i ca i la streptococi cu men iunea c leuconostocii produc diacetil i acetoin la pH sc zut. Acetoina se poate forma pe dou c i: - prin decarboxilarea acetolactatului; - din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, ntr-o reac ie care necesit NADH sau NADPH. Aceast ultim cale este redus sau chiar lipse te n cazul lui Str. diacetilactis, din cauza capacit ii limitate a acestuia de a produce acetil- CoA, unul din precursorii diacetilului n afar de industria laptelui, leuconostocii se utilizeaz ipentru: - fermentarea unor produse vegetale (varz , castrave i,m sline) intervenind n cadrul microflorei spontane sau sub form de culturi concentrate; - fermentarea malolactic a vinurilor; - produc ia de dextran. n industria laptelui se folosesc culturi lactice care con in streptococi acidifian i (Str. lactis i Str. cremoris), precum i bacterii produc toare de arom i unele specii de Leuconostoc i Str. diacetilactis, ultimul fiind aromatizant i acidifiant. Genul Pediococcus. Acest gen apar ine familiei Streptococaceae i cuprinde bacterii sub form de coci perechi sau tetrade. Metabolismul acestor bacterii este predominant fermentativ, homolactic. Se produce acid lactic racemic (DL) din glucoz , fructoz , manoz . Sorbitolul i amidonul nu sunt fermenta i. Multe specii sunt catalaz negative, dar se ntlnesc i specii care au activitate catalazic independent de hem. P. acidilacti, n culturi starter, este utilizat pentru ob inereade produse din carne fermentate la temperaturi mai ridicate,deoarece are o dezvoltare bun la 42-52 C, producnd rapid acidul lactic i deci scade efectiv pH-ul, produsul ob inut avnd gust acri or. Atunci cnd se utilizeaz la fermentarea unor produse de carne la temperatura de 16-27 C, produc ia de acid lactic este mai lent i implicit se pot dezvolta i microorganismele care contamineaz carnea, durata de fermenta ie fiind mai mare.

P. pentosaceus produce o fermenta ie rapid cnd substratul con ine un glucid fermentescibil, temperatura de fermentare fiind cuprins ntre 15-27 C.. Avnd n vedere c pediococii produc acid lactic i bacteriocine, ei exercit o ac iune inhibitoare fa de microorganismele patogene i cele de alterare (stafilocici, salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii gram negative, drojdii). n produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pHulde la 5,6 la 4,5-5,2 ceea ce face ca proteinele s fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce favorizeaz sinereza i deci uscarea produsului. Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce contribuie la realizarea unei texturi ferme a produsului finit. Genul Lactobacillus. Acest gen apar ine familiei Lactobacillaceae. Aceast familie cuprinde bacterii sub form de bastona e de lungimi i grosimi variabile, precum i cocobacili scur i, a eza i obi nuit n lan uri n faza de nmul ire logaritmic . Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe. n general sunt catalaz negative citocrom-oxidaz negative, nu reduc azota ii, nu lichefiaz gelatina. Au activitate proteolitic i lipolitic redus . Glucidele cele mai bine fermentate sunt: lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales n faza de dezvoltare), apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza). Pentru dezvoltare necesit substan e minerale i toate vitaminele din grupul B. Se dezvolt bine n mediu cu pH 5,5-5,8, dar i la pH 5 . Se pot dezvolta n limite largi de temperatur (5-53 C), dar temperatura optim este cuprins ntre 30 i 45 C. n func ie de temperatura optim de dezvoltare lactobacilii pot fi: termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, temperatura optim fiind 37-45 C; mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura optim de dezvoltare fiind 26-30 C. Utilizarea culturilor de lactobacili: n industria laptelui se utilizeaz Lactobacillus lactis i Lactobacillus bulgaricus, singuri sau n amestec la fabricarea iaurtului, chefirului, cumsului, brnzei Ementhal, brnzeturilor italiene. Lactobacillus helveticus este i el implicat n unele din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui acidofil, laptelui acidofil nefermentat i a altor produse acidofile. Lactobacillus casei se utilizeaz pentru ob inerea produsului yakult. n industria c rnii intereseaz Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus i n special Lactobacillus plantarum care se caracterizeaz prin faptul c nu produce CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2 din gluconat. Riboza este fermentat la acid lactic i acid acetic. Posed activitate aldolazic , glucozo 6P dehidrogenazic . Prin fermenta ie lactic se produce acid lactic racemic (DL). Lactobacillus plantarum este facultativ anaerob, nu produce NH3 din arginin . Poate acidifica laptele i are temperatura optim de dezvoltare la 30-35 C. Nu necesit pantotenat, tiamin , niacin pentru dezvoltare. Lactobacillus plantarum ca i Lactobacillus sake pot descompune acidul gluconic cu formare de acid acetic ceea ce este dezavantajos n cazul salamurilor la care se folose te glucono delta lactona ca acidifiant chimic. Lactobacillus plantarum poate reduce NaNO3 dac pH-ul mediului este mai mare de 6,0 i nu exist zaharuri fermentescibile n mediul de cultur . Lactobacillus sake i Lactobacillus curvatus produc H2O2 n prezen a O2 atmosferic. Cei doi lactobacili se

ntlnesc frecvent n salamurile crude f r adaos de culturi starter (sunt componen i ai microflorei spontane a compozi iei de carne). Alte utiliz ri Lactobacilii intereseaz i n fermentarea m slinelor, verzii, castrave ilor, gogonelelor, n producerea spirtului i drojdiei presate n vederea acidifierii pl mezilor, la fermentarea unor produse fermentate din cereale (brag , cvas), la fabricarea acidului lactic prin fermentare etc. Genul Micrococcus i Staphylococcus Microorganismele din genurile Micrococcus i Staphylococcus apar in familiei Micrococaceae care cuprinde bacterii sub form de coci. Se pot dezvolta n medii care con in 15% NaCl. Pentru industria c rnii intereseaz anumite specii de micrococi i stafilococi care sunt folosite pentru: - capacitatea lor de a reduce azota ii la azoti i (contribuie la formarea culorii c rnii s rate n prezen de azota i); - activitatea lor catalazic ; - activitatea de acidificare, proteolitic i lipolitic . Dintre speciile de micrococci intereseaz Micrococcus aurantiacus i Micrococcus varians. Pentru industria laptelui, micrococii formeaz partea principal a popula iei nelactice din laptele crud i respectiv brnzeturile fabricate din laptele crud. Din brnza Cheddar fabricat din lapte crud a fost izolat Micrococcus freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub form de cultur pur n scopul acceler rii form rii aromei brnzei fabricate din lapte pasteurizat datorit activit ii proteolitice i lipolitice. Tot n scopul matur rii unor brnzeturi cu past presat s-a utilizat un preparat enzimatic i anume Rulactina ce con ine o metalproteaz cu activitate strict endoproteinazic ob inut din Micrococcus caseolyticus. Din genul Staphylococcus intereseaz speciile de stafilococi coagulaz -negativi, nepatogeni cum ar fi: Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus, Staphylococcus simulans. Combina iile de micrococi i stafilococi sunt eficace pentru activitatea azotat-reductazic i catalazic . n aceste combina ii, Staphylococcus carnosus ac ioneaz mai bine dect micrococii n formarea culorii, reducnd azota ii la azoti i i respectiv azoti ii la oxid de azot, chiar n condi ii de aciditate ridicat a substratului. Aroma produselor la care este utilizat cultura starter de Staphylococcus carnosus este superioar . Genul Streptomyces. Specii din genul Streptomyces pot altera alimentele, producnd mirosuri i gusturi dezagreabile, altele (pu ine la num r) sunt patogene. Genul Propionibacterium. Bacterile din genul Propionibacterium fac parte din familia Propionibacteriaceae. Bacteriile propionice fermenteaz carbohidra ii, piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice tip lapte sunt: Propionibacterium freundreichii (cu subspeciile freundreichii, globosum i shermani), Propionibacterium theonii, acidipropionici i jensenii. Principalii produ i de fermenta ie a bacteriilor propionice sunt CO2, cantit i mari de acid propionic i acetic i cantit i mici de acid izovalerianic, formic, succinic, lactic. Toate speciile produc acid lactic din glucoz . Se dezvolt foarte bine la 30-37 C i la pH = 7,0.

DROJDIILE, ciuperci unicelulare care se nmul esc prin nmugurire, mai rar prin sciziparitate i care formeaz ascospori (sunt i drojdii care nu formeaz spori, acestea denumindu-se drojdii/false torule i micoderme), sunt agen i tipici ai fermenta iei alcoolice. Se prezint sub form de celule rotunde sau ovoide (Saccharomyces cerevisiae), eliptice (Saccharomyces elipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus), de forma unei l mi (Saccharomyces apiculans), de forma unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub form de cilindru (Pichia). Dintre drojdii intereseaz (n sens util) cele apar innd familiei Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces care cuprinde drojdii alcooligene folosite n industria berii, vinului, pinii, spirtului, genul Kluyveromices care fermenteaz lactoza, genul Debaryomices care se utilizeaz n industria c rnii. Mai intereseaz drojdiile familiei Cryptococcaceae (genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca agen ide fermentare i produc tori de biomas . Utiliz ri ale drojdiilor 1. Utilizarea pentru fermentarea alcoolic Pentru ermenta ia alcoolic se folosesc drojdiile adev rate care apar in genului Saccharomyces (Meyen) Ress i care se produc 1-4 spori, iar puterea de fermentare dep e te puterea de respira ie. Sunt adaptate la condi ii de anaerobioz i prin urmare nu formeaz voaluri la suprafa . Dup modul de comportare n timpul fermenta iei drojdiile pot fi: de fermenta ie superioar care se ridic n cantit i mari la suprafa a lichidului de fermentare sub forma unui strat gros de spum care se p streaz astfel pn la sfr itul ferment rii. Dup sedimentare aceste drojdii rar dau un precipitat dens. Au optim de temperatur la 2830 C i fermenteaz 1/3 din rafinoz . n categoria drojdiilor de fermentare superioar se ncadreaz cele care produc fermentarea alcoolic n cazul ob inerii alcoolului etilic, pinii i unele su e pentru bere (Saccharomyces cerevisiae); de fermenta ie inferioar care se dezvolt n lichidul fermentat, nu se ridic la suprafa n spum , dar formeaz flocoane i se sedimenteaz repede. Au optim la temperatura de 812 C i fermenteaz complet rafinoza. Drojdiile de fermentare inferioar se folosesc la ob inerea berii, vinului, cidrului (Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini, Saccharomyces uvarum) MUCEGAIURILE Pentru industria alimentar intereseaz clasa Phycomycetes cu urm toarele genuri: Genul Mucor i Rhizopus apar innd familiei Mucoraceae. Aceste mucegaiuri care se ntlnesc pentru diferite produse vegetale i alimentare, sub form de colonii pufoase, au o ac iune fermentativ net . Specii de Mucor i Rhizopus se folosesc pentru: - ob inerea unor produse alimentare fermentate n Orientul ndep rtat, pe baz de cereale i leguminoase; - n produc ia de spirt prin zaharificarea amidonului (procedeul Amilo care folose te Amylomyces rouxi Mucor rouxianus); - n produc ia de enzime, n principal amilolitice i proteolitice. Din clasa Ascomycetes intereseaz ordinul Plectascales cu genurile Aspergillus i Penicillium.

Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizeaz n: - produc ia de unc n SUA i Spania (mai pu in); - ob inerea de produse fermentate tradi ionale n Orientul ndep rtat (ceva mai mult); - ob inerea de enzime: amilaze, proteaze, enzime pectolitice. Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizeaz n: - industria brnzeturilor cu mucegai la suprafa i n past (Penicillium camemberti i Penicillium roqueforti); - industria c rnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium nalgiovensis i Penicillium exposus); - ob inerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice. n industria c rnii, culturile de spori de mucegai se utilizeaz pentru maturarea unor unci, care se ns mn eaz cu spori de Penicillium netoxicogen, n special P. nalgiovensis, P. exposum, i P. chrysogenum, respectiv Country curred ham i Jambon Serano, care se ns mn eaz cu spori de Aspergillus glaucus i a unor tipuri de salamuri crude fabricate n Romnia , Italia, Ungaria, Elve ia, Spania, Fran a, Bulgaria; Austria, Belgia, Germania ( i mai pu in n SUA, Israel, Iugoslavia, Polonia).