LOGO

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA COALA POSTDOCTORAL POSDRU/89/1.5/S/52432

STUDIUL PRIVIND INFLUENA VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA COMPOZIIEI CHIMICE A FRUNZELOR I FRUCTELOR LA ASE SOIURI ALE SPECIEI PRUNUS DOMESTICA L.

Prof. dr. PAMFIL DORU Dr. ing. BRICIU ALEXANDRU CIPRIAN

CUPRINS
1. Stadiul actual al cunotiinelor n domeniul strict al temei de cercetare postdoctorale
2. Scopul i obiectivele cercetrii, materialul i metoda
3. Rezultate

i discuii

4. Concluzii

www.themegallery.com

INTRODUCERE
Virusul Plum pox este considerat cel mai devastator patogen viral al speciilor pomicole smburoase. Acest fapt se datoreaz scderii calitii fructelor i pierderilor cauzate de cderile premature ale acestora. n Romnia, acest virus este rspndit n toate arealele de cultur ale prunului i provoac pierderi masive de producie ( Zagrai i colab., 2006).

Cele mai recente cercetri de mare amploare din Romania au fost coordonate de ctre dr. ing. Zagrai Ioan, cercettor la SCDP Bistria. Rezultatele au artat o situaie dramatic i necontrolabil n ceea ce privesc infeciile masive cu Plum pox din ara noastr.
Studierea impactului PPV-ului asupra compoziiei chimice a prunelor are un caracter limitat la nivel global. n Romnia singurele cercetri au vizat aciunea virusului Plum pox asupra cantitii de substan uscat, pH i aciditate titrabil, analize efectuate pe un numr de 26 de soiuri. Rezultatele studiului au artat o scdere a cantitii de substan uscat i a pH-lui i o cretere a aciditii titrabile (Maxim, 2001).

www.themegallery.com

Simptomele provocate de virusul Plum pox

Plum pox este o boal foarte grav producnd simptome severe pe fructe, frunze, smburi, uneori pe trunchi i pe ramurile de schelet. Simptomele de PPV sunt foarte evidente pe frunzele de primvar ce se manifest sub forma unor decolorri de culoare verde deschis, pete clorotice, cercuri concentrice, deformri ale frunzelor. n unele cazuri se constat o cdere prematur a fructelor bolnave.

Prezena sau intensitatea simptomelor variaz n funcie de specie i soi, tulpina viral, starea fitosanitar a gazdei cu privire la ali virui, sezon i locaie. PPV influeneaz ntr-o mic msur vigoarea i longevitatea pomilor infectai.

www.themegallery.com

Simptomele provocate de virusul Plum pox

Simptome de PPV pe frunze de prun

Atac de PPV pe fructe de prun

Atac de PPV pe fructe de piersic

Simptome de plum pox pe fructe de cais

www.themegallery.com

Starea actual a tulpinilor virusului Plum pox

Caracterizrile serologice i moleculare a izolatelor Plum pox virus (PPV) efectuate de ctre cercettorii din Europa Occidental au permis stabilirea apartenenei izolatelor la diferite tulpini virale dar i la identificatea unor forme recombinate. Sua D (dideron) - Frana Sua M (marcus) - Grecia

Cele 8 tulpini virale ale PPV-ului

Sua Ea (el amar) - Egipt

Sua SoC (sour cherry) Republica Moldova Sua SwC (sweet cherry) - Italia Sua PPV-Rec - Slovacia PPV-W(winona) - Canada PPV-T - Turcia
www.themegallery.com

Cercetrile realizate asupra rezistenei prunului la Plum pox pe glob i n Romnia Pe plan mondial exist dou direcii n ceea ce privete dezvoltarea rezistenei prunului la PPV. Prima direcie ar fi ameliorarea clasic, ce exploateaz rezistena natural. Din pcate lipsa acestei rezistene naturale a mpiedicat obinerea de soiuri rezistente la PPV prin ameliorare clasic. A doua direcie reprezint utilizarea ingineriei genetice n obinerea de plante modificate genetic, rezistente la PPV.
Mirobolan BN 4Kr Local de Dragani soiul Jojo

Rezisten natural Linia transgenic C5

Rezisten genetic

www.themegallery.com

Cercetri privind studierea compuilor fenolici i a activitii antioxidante Prunele conin ceea mai mare cantitate de potasiu, fosfor, calciu i magneziu, fiind foarte bogate n compui fenolici, caracterizai ca avnd o mare capacitate antioxidant, mai mare dect portocalele, merele sau strugurii (Sochor i colab., 2010). Compuii fenolici naturali au continuat s atrag interesul unui numr mare de cerecttori n contextul unei scderi a incidenei la cancer i boli cardiovasculare (Long i colab., 2001). Polifenolii s-au dovedit a fi compui antimicrobiali naturali, fapt important pentru un organism sntos (Naidu, 2000).

Cele mai multe cercetri pe prun au vizat analizarea cantitii de polifenoli totali, activitii antioxidante, pH-ul, aciditatea total din fructe (Gil i colab., 2002; Cevallos-Casals i colab., 2006).
www.themegallery.com

SCOPUL CERCETRII Proiectul Studierea influenei virusului Plum pox asupra compoziiei chimice a frunzelor i fructelor la ase soiuri ale speciei Prunus domestica L.abordeaz aspecte de mare actualitate ce asigur acumularea de cunotine avansate i rezultate tiinifice ntr-un domeniu de mare importan tiinific i economic. Avnd n vedere pagubele uriae produse de virusul Plum pox culturii prunului prin diminuarea semnificativ a produciilor de prune din ara noastr, modul de abordare a problematicii propuse se justific pe deplin i se ncadreaz n politica naional n domeniu.
www.themegallery.com

OBIECTIVELE URMRITE

n cadrul prezentului proiect de cercetare postdoctoral am urmrit s determinm dac polifenolii au un rol n rezistena/sensibilitatea la nou soiuri de prun privind infeciile cu PPV. Obiectivele secundare se refer la: diagnosticarea molecular, diferenierea tulpinilor PPV pentru fiecare soi n parte prin tehnicile RT-PCR i PCR-RFLP, determinarea influenei PPV-ului (tulpinilor D i REC) asupra totalitii polifenolilor, capacitii antioxidante, pH-ului i aciditii titrabile.
www.themegallery.com

MATERIAL I METODE
Tehnici de laborator utilizate
RT-PCR
P1/P2 CP NIb P1-PD/PM mD5/Mm3

Totalitatea polifenolilor (TP)

Folin-ciocalteu Capacitatea antioxidant

PCR-RFLP
Rsa I Alu I

DPPH
www.themegallery.com

REZULTATE I DISCUII
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA MOLECULAR PRIN RT-PCR A CELOR 36 DE PROBE RECOLTATE DE LA SCDP BISTRIA Diagnosticarea molecular
L I1 I2 I3 I4 C1 C2 C3 C4 A1 A2 A3 A4

Legend: I1-4=Iulia C1-4=Carpatin

243 pb
Analizarea profilului electroforetic folosind amorsele P1/P2 pentru identificarea prezenei sau absenei virusului la 12 probe; L-100pb DNA Step Ladder.

A1-4=Albatros

www.themegallery.com

REZULTATE I DISCUII
Diferenierea molecular a tulpinilor PPV-D i PPV-M
Legend:

P1PD
L I C A D M L I

P1PM
C A D M

I- Iulia- 6/38 C- Carpatin-13/38 A-Albatros- 16/28

D-Diana-10/4
M-Minerva-12/1

198 bp
Analizarea profilelor electroforetice folosind perechile de amorse P1/PD i P1/PM n vederea diferenierii tulpinilor PPV-D i PPV/M la 5 probe ce aparin soiurilor: Iulia, Carpatin, Albatros, Diana, Minerva
www.themegallery.com

REZULTATE I DISCUII
Detecia tulpinii recombinate PPV-Rec Prima apariie privind recombinarea ARN-ului n PPV a fost raportat n fosta Iugoslavie (izolatul 06) de ctre Cervera i colab., (1993) i n Slovacia (izolatul BOR-3) de ctre Glasa i colab., (2001). La noi n ar studiile efectuate de ctre Zagrai i colab. (2006, 2008) arat o rspndire a tulpinii PPV-Rec n toate zonele de cultur a prunului. Aceste izolate PPV-Rec prezint 19 20 21 22 23 24 25 26 C+ C- cu alte izolate recombinate raportate de Glasa i colab. (2004) L 16 17 18 o mare similaritate mprtind acelai punct de recombinare.
L I C A D M

Legend: I- Iulia- 6/38

605 pb
Analizarea profilului electroforetic folosind perechea de amorse mD5m/M3 n vederea identificrii tulpinii PPV-REC la 5 probe ce aparin soiurilor: Iulia, Carpatin, Albatros, Diana, Minerva.

C- Carpatin-13/38

A-Albatros- 16/28
D-Diana-10/4 M-Minerva-12/1
www.themegallery.com

REZULTATE I DISCUII
Rezultatele analizelor moleculare la cele 36 de probe prelevate de la noua soiuri de prun cultivate la Staiunea de Cercetare i Dezvoltare Pomicol Bistria
Variety Soiul free PPV-D Tulpina Strain
L

Iulia

Carpatin free PPV-D

C

Cacanska Rana free PPV-D

D

Albatros free PPV-D PPVREC PPVD+REC

Romaner free PPVD+REC PPVD+REC PPVD+REC

Oneida free PPVREC PPVREC PPVREC

Diana free PPVREC PPVREC PPVD+RE C

Minerva free PPV-REC PPV-REC PPVD+REC

Ivan free PPV-REC PPV-REC PPV-REC

L 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 C+ C-

PPVREC PPVD+RE C

PPVREC

PPV-REC PPVD+REC

PPVD+REC

www.themegallery.com

REZULTATE I DISCUII
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA MOLECULAR PRIN PCR-RFLP A CELOR 36 DE PROBE RECOLTATE DE LA SCDP BISTRIA

Diferenierea molecular a tulpinilor virale PPV-D i PPV-M prin digestia enzimatic cu enzima Rsa I
L A1 A2 A3 R1 R2 R3 C1 C2 C3

Legend: A1-3=Albatros 243 bp 182 bp 61 bp R1-3=Romaner C1-3=Carpatin

Diferenierea tulpinilor virale cu ajutorul tehnicii PCR-RFLP, utiliznd enzima de restricie RsaI (probele A1-3= Albatros, R1-3= Romaner, C1-3= Carpatin), L- Ladder pUC 18 DNA Msp I Digest

www.themegallery.com

REZULTATE I DISCUII
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA MOLECULAR PRIN PCR-RFLP A CELOR 36 DE PROBE RECOLTATE DE LA SCDP BISTRIA

Identificarea eventualelor mutaii suferite de tulpinile virale la nivelul situsului de restricie al regiunii genei care codific proteina capsidal
L L A1 A2 A3 A3 R1 R3 C1 C2 C3 A1 A2 R1 R2 R2 R3 C1 C2 C3

Legend: A1-3=Albatros 182 bp 61 bp R1-3=Romaner C1-3=Carpatin

Produii PCR digerai cu enzima de restricie AluI pentru probele A1-3= Albatros, R1-3= Romaner, C1-3= Carpatin, L- Ladder pUC 18 DNA Msp I Digest

www.themegallery.com

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN

Analizarea celor doi parametri biochimici (pH i TA) la fruzele de prun

recoltate de la cele nou soiuri

n cazul celor nou soiuri s-a constatat o scdere a valorilor pH-ului i o cretere a aciditii titrabile la probele infectate n comparaie cu cele neinfectate. Cele mai mari diferene fa de proba neinfectat s-au obsevat la probele infectate cu tulpina REC, dar mai ales la infeciile mixte. Virusul Plum pox a influenat semnificativ pH-ul i aciditatea, soiurile sensibile fiind mai afectate dect cele tolerante.
www.themegallery.com

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN

Coninutul de polifenoli totali din frunzele de prun

Determinarea valorilor de polifenoli totali au fost re-calculate pe baza acidului galic (GA), care au variat de la 768,9 la 994,0 mg GA 100 g-1 (FW) i ofer informaii cu privire la coninutul de polifenoli din frunzele de prun (tab. 3).Valorile cele mai mari de polifenoli totali au fost determinate la genotipul Iulia (PPV-D + REC-994,0 mg GA 100 g-1 FW i PPV-REC 976,0 GA 100 g-1 FW), iar cel mai mic nivel la soiul Albatros (PPV-D - 768,9 mg GA 100 g1 FW i PPV-REC - 782,5 mg GA 100 g-1 FW).
Capacitatea antioxidant a frunzelor de prun Valorile capacitii antioxidante au variat de la 131,9 la 285,8 mmolL-1 de produs vegetal proaspt (FW). Cele mai mari valori ale capacitii antioxidante au fost puse n eviden la genotipul Iulia (PPV-D+REC- 285,8 mmolL-1and PPV-REC - 272,8 mmolL-1), iar cele mai mici la genotipul Romaner (PPV-D + REC 131,9 mmolL-1) i Carpatin (PPV-D 135,3 mmolL-1).

www.themegallery.com

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN

Corelaia dintre coninutul polifenolilor totali (TP) i capacitatea antioxidant a frunzelor de prun.
TP exprimat prin coninutul de acid galic (mg GA.100g-1 ) TP expressed as content of gallic acid (mg GA.100g-1 )
1200 1000 800 600 400 200 0 0 50 100 150 200 250 300 350 Activitatea antioxidant exprimat prin concentraia Troloxului (mmolL-1 ) Antioxidant activity expressed as concentration of Trolox (mmolL-1 )

Corelaia dintre coninutul polifenolilor totali (TP) i capacitatea antioxidant a frunzelor de prun.
www.themegallery.com

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN

Continuare

Corelaia dintre coninutul polifenolilor totali (TP) i capacitatea antioxidant a frunzelor de prun. ntre capacitatea antioxidant i cantitatea de polifenolic total (TP) s-a evideniat o corelaie pozitiv (r=0,71). Valorile polifenolilor totali au fost mai mari la probele infectate fa de cele free, mai ales la soiurile tolerante. Acest lucru dovedete faptul c polifenolii pot avea un rol important n rezistena/sensibilitatea soiurilor de prun la PPV. Rezultatele noastre sunt n concordan cu literatura de specialitate (Gunen, 2005; Honty, 2010), indicnd faptul c polifenolii totali pot fi considerai markeri biochimici; putnd fi utilizai n diferenierea soiurilor tolerante i rezistente la PPV. Diferenierea tulpinilor D i REC ne-a indicat faptul c cea mai mare influen a avut-o tulpina REC i infeciile mixte (D+REC), mai ales la varietile sensibile.

www.themegallery.com

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE LA PRUNE Determinarea valorilor pH-lui din prune

n cazul celor dou soiuri s-a constatat o scdere a valorilor pH-ului la probele infectate n comparaie cu cele neinfectate. Cele mai mari diferene fa de proba neinfectat s-au obsevat la probele infectate cu tulpina REC, dar mai ales la infeciile mixte. Virusul Plum pox a influenat semnificativ pH-ul i aciditatea, soiurile sensibile fiind mai afectate dect cele tolerante.

www.themegallery.com

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE LA PRUNE

Valorile pH-lui din prune la soiurile de prun studiate

Nr.crt. No. 1 2 5 6 Soiul Variety Carpatin-Free Carpatin-D+REC Diana-Free Diana-D+REC pH-ul 3,27 3,17 3,67 3,45

www.themegallery.com

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE LA PRUNE

Cantitatea de polifenoli totali i capacitatea antioxidant din prune

n cazul prunelor, infecia cu PPV a determinat o cretere a cantitii de polifenoli totali. Diferenele dintre proba free i cea infectat cu tulpina D+REC sunt mai mari la soiul Carpatin, considerat a fi tolerant la acest virus. Soiul Diana confirm faptul c este sensibil deoarece cantitatea de polifenoli totali este mai mic, neputndu-se proteja mpotriva infeciei. Valorile polifenolilor totali n cazul altor studii au variat de la 42.0 (soiul Wickson) la 109,2 mg/100g material proaspt (soiul Black Beaut) (Gil i colab., 2002); 14109 mg/100 g (Gil i colab., 2002); 125373 mg/100 g (Kim i colab., 2003). Aceste comparaii ne indic faptul c soiurile studiate de noi au un coninut mai mic de polifenoli totali.

www.themegallery.com

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE LA PRUNE

Nr.crt. No. 1 2 3 4

Soiul Variety Carpatin-Free Carpatin-D+REC Diana-Free Diana-D+REC

Totalitatea polifenolilor Total polyphenols . -1 mg GA 100g FW 45,2 74,0 32,7 37,2

DPPH . -1 mg Trolox 100g FW 70,6 82,6 61,3 67,1

www.themegallery.com

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE LA PRUNE
TP exprimat prin coninutul de acid galic (mg GA.100g-1 ) TP expressed as content of gallic acid (mg GA.100g-1 )
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Activitatea antioxidant exprim at prin concentraia Troloxului (m m olL-1 )

Antioxidant activity expressed as concentration of Trolox (mmolL-1 )

Corelaia dintre coninutul polifenolilor totali (TP) i capacitatea antioxidant a frunzelor de prun. ntre cantitatea de polifenoli totali i activitatea antioxidant (fig. 11) s-a stabilit o corelaie foarte pozitiv (r=0.95). Rezultatele noastre sunt confirmate de literatura de specialitate, sugernd faptul c cele dou metode sunt cele mai recomandate a fi folosite n aceste analize. Aceast corelaie pozitiv dintre TP i DPPH indic o posibil asociere a acestora cu rezistena la PPV. Acest fapt este confirmat i n literatura de specialitate (Sochor i colab., 2010; Honty, 2010). www.themegallery.com

CONCLUZII
n cazul studiului realizat pe frunzele i fructe, rezultatele au dovedit faptul c virusul Plum pox a determinat o scdere a valorilor pH-lui i o cretere a aciditii titrabile la probele infectate n comparaie cu cele neinfectate. Valorile polifenolilor totali pentru probele infectate fa de cele free au fost mai mari la soiurile tolerante, n comparaie cu cele sensibile. Aceste rezultate confirm faptul c polifenolii pot avea un rol important n rezistena/sensibilitatea soiurilor de prun la virusul Plum pox. n cazul frunzelor a fost stabilit o corelaie pozitiv ntre activitatea antioxidant i cantitatea total de polifenoli (r=0.71). Rezultatele noastre sunt n concordan cu literatura de specialitate (Gunen, 2005; Honty, 2010), indicnd faptul c polifenolii totali pot fi considerai markeri biochimici, putnd fi utilizai n diferenierea soiurilor tolerante i rezistente la PPV. n cazul prunelor corelaia dintre cantitatea de polifenoli totali i activitatea antioxidant a avut o valoare foarte pozitiv (r=0.95). Corelaii pozitive au fost obinute n literatura de specialitate i de ctre Gil i colab.( 2002), Cevallos-Casals i colab. (2006). www.themegallery.com

CONCLUZII
Att frunzele, ct i fructele sunt potrivite pentru rezistenei/sensibilitii soiurilor de prun la virusul Plum pox. testarea

Tehnicile moleculare RT-PCR i PCR-RFLP s-au dovedit a fi foarte eficiente n diagnosticarea i diferenierea tulpinilor virale, indicnd o foarte bun corelaie. Toate izolatele diagnosticate ca fiind PPV-M n regiunea (Cter)CP sau dovedit a fi PPV-Rec n regiunea (Cter) Nib (Nter)CP. Diferenierea tulpinilor D i REC ne-a indicat faptul c cea mai mare influen a avut-o tulpina REC i infeciile mixte (D+REC), mai ales la varietile sensibile.

www.themegallery.com

LOGO