Reacia PCR

(Polymerase Chain Reaction = Reacie de Polimerizare n Lan) este o metod de amplificare enzimatic in vitro a unei anumite secvene de ADN. n prezent a fost dezvoltat o adevarat tehnologie PCR care este folosit ntr-o varietate foarte mare de domenii: biologie molecular, tiinele mediului, criminalistic, tiine medicale, biotehnologie, microbiologie, industria alimentar, epidemiologie etc. Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele 2 catene ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare). Diferena esenial ntre o asemenea reacie de replicare i un proces de replicare ADN in vivo, l reprezint faptul c n reacia PCR etapa de desfacere a dublului helix matri i, respectiv, cea de ataare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatur, iar singura enzim folosit n reacie este o ADN polimeraz ADN-dependent (cu funcie de replicaz). Principalele 3 etape ale unei reacii PCR pot fi sintetizate astfel : ADN d.c. matri ADN m.c. ataarea primerilor polimerizare ADN polimeraz ADN dependent termostabil 2 molecule ADN d.c. identice cu molecula matri Principalele componente ale reaciei sunt : ADN matri, o ADN polimeraz termostabil, primeri oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfati (dNTP), tamponul de reacie, ioni de Mg ++. O reacie PCR este format din n cicluri (ntre 25 i 40), n fiecare ciclu fiind parcurse 3 etape principale: denaturarea termic a matriei (deci, desfacerea dublului helix ADN), ataarea primerilor i polimerizarea propriu-zis. La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN rezultat este dubl fa de matri. Mai mult, produsele rezultate ntr-un ciclu sunt folosite ca matri n ciclul urmator, astfel nct numrul final de copii ADN este de 2 n x y, unde y = numrul iniial de copii, iar n = numrul de cicluri de replicare. Este de subliniat faptul c moleculele acumulate exponenial reprezint copii ale matriei care la capete au incorporai primerii. In concluzie, reacia PCR este o metod prin care se obin cantiti mari dintr-o anumit secven ADN. Aceste molecule pot fi ulterior manipulate/analizate fr a fi necesar o prealabila clonare molecular a acestora. Prima raportare n literatura de specialitate a unui experiment de amplificare in vitro a unei secvene ADN prin PCR a fost realizat de Kary Mullis n 1985. Ulterior, metoda a fost aplicat de ctre un grup de cercettori de la Departamentul de Genetic Uman de la Cetus Corporation (SUA) pentru amplificarea secvenei de ADN ce codific _-globina uman i pentru diagnosticul prenatal al anemiei falciforme. Initial, reacia PCR folosea ca replicaz fragmentul mare ( Klenow) al ADN polimerazei I de la Escherichia coli. Aceast enzim era nsa inactivat de temperaturile ridicate necesare etapei de denaturare a matritei. Ca urmare, la fiecare ciclu de replicare trebuia adaugat enzim proaspt. Ulterior, a fost descoperit i introdus n reacia PCR o ADN polimeraz termostabil izolata iniial dintr-o tulpin de Thermus aquaticus (bacterie termofil izolat din izvoarele termale Yellow Spring din SUA). Un alt pas important n dezvoltarea tehnologiei PCR a fost procesul de automatizare care a condus la producerea n prezent a unor aparate ce desfaoar singure ntreg procesul de PCR, parcurgnd toate treptele de temperatur n n cicluri. Componentele reaciei a) Matria ADN. De cele mai multe ori, ntr-o reacie PCR se introduc molecule de ADN d.c. linear/circular ce include secvena de amplificat. Puritatea ADN introdus ca matri reprezint un parametru important pentru succesul unei reacii PCR. De exemplu, cantiti mari de ARN dintr-un extract ADN pot chelata ionii de Mg++, determinnd astfel o activitate sczut a ADN polimerazei. Pe de alt parte, o serie de contaminani din extractul ADN pot inhiba aciunea ADN polimerazei.

b) primerii oligonucleotidici. In general, dimensiunea primerilor folosii n reaciile PCR este cuprins ntre 15 i 30 bp i, de obicei, sunt complementari cu capetele 5 i, respectiv, 3 ale regiunii ce urmeaz a fi amplificat. Se recomand ca primerii s aib un procent molar de guanin + citozin (% mol GC) cuprins ntre 40 60% i s aib o distribuie echilibrat a domeniilor bogate n A/T i G/C. Este recomandabil ca cei 2 primeri s aib valori Tm care s permit temperaturi de ataare ntre 55 i 65oC (pentru specificitate maxim se folosesc temperaturi de 62-65 oC).

c) ADN polimeraza termostabil In prezent n toate reaciile de tip PCR se introduc ADN polimeraze termostabile. Variantele naturale ale unor asemnea enzime au fost izolate din microorganisme termofile, care posed echipamente enzimatice cu temperaturi optime ridicate (mai mari de 70oC) i care sunt capabile s desfoare activitile specifice i dup treceri peste temperaturi extreme (n jur de 100oC). In marea majoritate a cazurilor, pornind de la asemenea variante naturale, AND polimeraze termostabile au fost manipulate genetic (cu obinerea unor variante ameliorate) i clonate n tulpini de E.coli (microorganism ce este mult mai uor de crescut i manipulat dect bacteriile termofile). In majoritatea experimentelor, cantitatea optim de ADN polimeraz termostabil (sau de amestec de ADN polimeraze) este cuprin ntre 0.5 i 0.25 U / 50 l volum de reacie. Variante tehnice i aplicatii ale tehnologiei PCR Marele avantaj al tehnicilor PCR l reprezint faptul c permite obinerea unei cantiti mari dintr-o anumit secven ADN, fr a necesita clonarea acesteia n prealabil ntr-o molecul de tip vector. Pe de alt parte, tehnologia PCR a revoluionat i implicarea geneticii moleculare n domenii n care se apeleaz la cantiti foarte mici de ADN. Asemenea situaii se ntlnesc n : - diagnosticul unor boli monogenice, precum i detectarea de noi tipuri de mutaii n gene importante n anumite boli; - diagnosticul unor infecii umane: permite detectarea particulelor infecioase bacteriene i virale chiar aflate ntr-o proporie mic, chiar pentru specii ce se cultiv dificil in vitro, chiar pentru patogeni cu variabilitate antigenic mare, i chiar pentru patogeni ce au perioad mare de laten; astfel, pot fi identificai indivizii umani pozitivi nainte de seroconversie; - studii privind mecanismele genetice ce acompaniaz procesele maligne (detectarea secvenei i esutului n care se exprim anumite oncogene n diverse procese maligne); - studii de taxonomie, sistematic i filogenie molecular: obinerea rapid a unei cantiti mari din secvene ADN cu valoare taxonomic i/sau filogenetic; - biologia populaiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite secvenierea rapid a unor molecule de ADN de la foarte muli indivizi, fr a necesita n prealabil clonarea acestora -studii de antropologie: tehnica PCR permite n prezent recuperarea i analiza unor secvene ADN din fosile; - medicin legal: cu ajutorul reaciilor PCR pot fi n prezent analizate la nivel molecular o serie ntreag de probe biologice.