1.

INTRODUCERE

n domeniul observaiei, hazardul nu favorizeaz de ! minile "re#$!i!e% - L. Pasteur Existena lumii microbiene a rmas necunoscut pn la inventarea microscopului la nceputul secolului al XVII-lea. &n!onie van 'eeu(enhoe) (1632 - 1723 ! savant olan"e#! a $ost primul care a observat cu a%utorul unui &microscop' ru"imentar $abricat "e el nsui! particulele invi#ibile cu oc(iul liber) s$ere! bastonae! spirili. *icroor+anismele au $ost "escoperite n sec. al XIX-lea i clasi$icate n re+nul ve+etal. *ae )el (1,66 propune crearea re+nului +ro!is!a! alturi "e cel animal i ve+etal. -st$el! el re+rupea# or+anismele unicelulare sau pluricelulare care nu $ormea# esuturi "i$ereniate n) al+e! ciuperci! proto#oare i bacterii. n 1.7,! $iinele vii au $ost clasi$icate n / re+nuri! "up 0(itta1er i *ar+ulis) (+ro)ar,o!ae, +ro!o !is!a, -un#i, +lan!ae i &nimalia ! urmn" ca ! o"at cu "e#voltarea biolo+iei moleculare! 2. 0oese s propun! n 1..3! o nou clasi$icare n trei &"omenii') &r haea, .a !eria i Eu ar,a. /i robiolo#ia este tiina care se ocup cu stu"iul microor+anismelor! $iine unicelulare sau multicelulare microscopice. -ceast tiin biolo+ic este scin"at n mai multe specialiti) micolo+ie! bacteriolo+ie! virolo+ie! al+olo+ie! proto#oolo+ie.

0. '&.OR&TORU' DE /ICRO.IO'O1IE 2 1ENER&'ITI

Laboratorul "e microbiolo+ie trebuie s cuprin" "ou compartimente) - o sal "e pre+tire a me"iilor i obiectelor "e lucru i "e "econtaminare! coninn" mese! un autoclav! o etuv! un con+elator i un $ri+i"er (care va $i utili#at i pentru pstrarea tulpinilor microbiene . 4ot aici se poate stoca sticlria! me"iile "e cultur precum i reactivii. - o sal "e lucrri propriu-#ise! "e manipulare a culturilor microbiene! la a"post "e curenii "e aer! "otat cu mese cu supra$a nete"! re#istent! impermeabil! cu con"ucte "e +a# i pri#e electrice! un sistem "e vi" i "e aer comprimat i o (ot sterili#abil, cu ra"iaii ultraviolete (eventual o (ot cu $lux laminar . n msura n care este posibil! n le+tur cu aceast sal! ar trebui s existe anexe prev#ute cu termostate la "i$erite temperaturi ( 2/32! 3332! 3732! 5532! //32 . *anipulrile "e culturi microbiene sau "e pro"use susceptibile s conin microor+anisme se e$ectuea# inn" cont "e unele te(nici particulare prin care s se evite cele "ou tipuri "e contaminare) 1. contaminarea culturii sau a pro"usului ce trebuie anali#at "atorit personalului sau me"iului incon%urtor6 2. contaminarea personalului sau a me"iului ncon%urtor "e ctre microor+anismele stu"iate. In laboratorul "e microbiolo+ie! opera ia "e ba# este trans$erul "e microor+anisme "intr-un recipient n altul! lucrare ce se execut n #ona steril "e protec ie "in %urul $lcrii becului "e +a#. 7ticlria cel mai "es utili#at n laboratorul "e microbiolo+ie const n eprubete "e "i$erite "imensiuni! $lacoane Erlenme8er! plci Petri! pipete Pasteur i pipete +ra"ate. n ultima perioa" sunt "in ce n ce mai mult utili#ate recipientele i pipetele "in plastic! "e unic $olosin. Pentru prelevarea i inocularea culturilor se utili#ea# ansa sau $irul metalic! $abricate "in nicrom. 9stensilele "e etalare permit reparti#area uni$orm a inoculului pe supra$aa me"iilor soli"i$icate i pot $i $abricate prin n"oirea unui tub sau a unei ba+(ete "in sticl. n a$ara acestor ustensile curente "e lucru! mai pot $i ntrebuinate o serie "e alte instrumente! n $uncie "e operaia e$ectuat. Laboratorul "e microbiolo+ie trebuie s aib n "otare urmtoarele aparate i ec(ipamente) robinet cu ap cal" i rece! "e pre$erin acionat cu piciorul6
2

 (ot cu $lux laminar sau ni sterili#abil! in"ispensabil lucrrilor "e microbiolo+ie bec "e +a# tip :unsen pentru lucrul n #ona steril "in %urul $lcrii cu con albastru i pentru sterili#area ansei etuv pentru sterili#area sticlriei termostat bacteriolo+ic pentru incubarea culturilor autoclav pentru sterili#area me"iilor "e cultur i pentru "econtaminarea obiectelor baie "e ap termostatat $ri+i"ere pentru conservarea me"iilor i a culturilor balane p;-metru microscoape

3. TE*NICI DE 4TERI'I5&RE & O.IECTE'OR N '&.OR&TORU' DE /ICRO.IO'O1IE

<istru+erea microor+anismelor sau sterili#area este in"ispensabil pentru pre+tirea materialului "e lucru i a me"iilor "e cultur. 9n pro"us este consi"erat steril cn" nu mai conine $orme "e microor+anisme ce pot $i revitali#ate. Exist mai multe proce"ee "e sterili#are care corespun" "i$eritelor tipuri "e materiale ce trebuie tratate. n laboratorul "e microbiolo+ie "e anali#e "e rutin! cl"ura repre#int mo"alitatea "e sterili#are cea mai ntrebuinat.

4TERI'I5&RE& +RIN C'DUR Cldura umed 7terili#area prin cl"ur &ume" se e$ectuea# n autoclavul cu aburi prin proce"eul "e autoclavare. +rin i"iu6 n atmos$era "e vapori "e ap sub presiune! toate bacteriile (inclusiv $ormele sporulate sunt omorte "up 23 minute la 12132. -ceasta este meto"a cea mai e$icient "e sterili#are. -utoclavul permite) - pre+tirea materialului (me"ii "e cultur! "i$erite obiecte n ve"erea utili#rii n laborator! prin "istru+erea microor+anismelor6 - "econtaminarea materialelor "up $olosirea n laborator (cel puin 33 minute la 12132 . *icroor+anismele "in pro"usele patolo+ice! eantioanele "e ap i pro"use alimentare anali#ate! "in culturile microbiene "e laborator etc! trebuie neaprat "istruse. -ceste "ou operaii ar trebui e$ectuate "e pre$erin n "ou autoclave "i$erite sau! cel puin!n mo" separat. 4impul "e sterili#are <uratele "e sterili#are sunt "ate "oar pentru obiecte! me"ii "e cultur sau alte substane ce trebuie sterili#ate n autoclav pentru anali#ele "e rutin.

/a!erialul s!eriliza! 7ticlrie curat -p ! ser $i#iolo+ic Para$in 7ruri minerale

Tem"era!ura 78C9 121 121 121 121

4

+resiunea 7barr9 1 1 1 1

Tim" 7minu!e9 23 23 23 23

*e"ii curente (bulion nutritiv! +elo# nutritiv Lapte "e+resat *e"ii coninn" substane termolabile (ex. +luci"e =luco# n soluie

121

1/ - 23

11/ 113

3!7 3!/

1/ 23

113

3!/

23

2ontrolul e$icienei sterili#rii prin autoclavare este reali#at a"esea cu a%utorul unor in"icatori "e sterili#are cum sunt (rtiile in"icatoare) sunt comerciali#ate ben#i "e (rtie special imprimate pentru a vira culoarea "ac au $ost n"eplinite con"iiile "e sterili#are. +as!eurizarea 7terili#area trebuie s $ie "eosebit "e pasteuri#are! care repre#int "oar un proce"eu "e conservare utili#at n in"ustria alimentar. Pasteuri#area const n tratarea pro"usului la o temperatur n "omeniul /632 - ,/32! o "urat variabil "e la cteva minute pn la o or ! n me"iu ume"! n $uncie "e pro"us. n aceste con"iii! ma%oritatea celulelor ve+etative bacteriene sunt "istruse! "ar nu i $ormele sporulate. T,ndalizarea 48n"ali#area const n 2 - 3 pasteuri#ari repetate! alternate cu perioa"e n care proba este meninut n con"iii $avorabile pentru +erminarea en"osporilor bacterieni! care "evin vulnerabili trecn" n stare ve+etativ i sunt "istrui prin pasteuri#are. 48n"ali#earea se poate reali#a n baie "e ap, "e exemplu! n urmtoarele con"iii) ncl#ire la /632 (pn la ,332 timp "e 1 or ! 3 - 7 #ile consecutiv! cu un interval "e 25 "e ore. 48n"ali#area se poate $olosi pentru "istru+erea microor+anismelor n me"iile ce conin substane termolabile. Cldura us a! 7terili#area prin cl"ur &uscat se e$ectuea# n sterili#atoarele cu aer cal" (etuve . 2l"ura &uscat nu poate "istru+e bacteriile i n special sporii bacterieni! "ect la o temperatur mai ri"icat ca n ca#ul cl"urii &ume"e'. 4ratamentul pentru sterili#are cu cl"ur &uscat este "e 5 ore la 15332 sau 1 or la 1,332.
5

9n alt proce"eu "e sterili#are prin cl"ur &uscat este flambarea! care se e$ectuea# n $lacra becului "e +a# pentru) extremitatea $irului ansei! exteriorul pipetelor! +tul eprubetelor i al $lacoanelor. &'TE +ROCEDEE DE 4TERI'I5&RE 4!erilizarea "rin fil!rare >iltrarea const n trecerea unui pro"us lic(i" printr-un perete poros sau o membran care reine bacteriile. 7e pot utili#a $iltre "e portelan (2(amberlan" ! "e sticl poroas sau membrane tip &*illipore'! cu pori "e "i$erite "imensiuni. 4!erilizarea "rin #aze !o:i e ?xi"ul "e etilen! "e exemplu! este $oarte utili#at pentru sterili#area materialului me"icoc(irur+ical! a materialelor "in plastic numite &sterile! "e unic $olosin' "in in"ustrie. 4!erilizarea u a;u!orul radiaiilor @a"iaiile ultraviolete - sunt ra"iaii cu utili#are curent n laboratorul "e microbiolo+ie6 ele sunt bacterici"e! "ar nu "istru+ sporii bacterieni. -cest tip "e ra"ia ii acionea# n mo" "irect i au putere "e penetraie sc#ut (civa milimetri . Lmpile &+ermici"e' al cror e$ect se ba#ea# pe aciunea ra"iaiilor 9V cu lun+imea "e un" "e 2/5 nm sunt utili#ate ) - pentru sterili#area apei - pentru sterili#area incintelor i a aerului ambiant

@a"iaiile +amma @a"iaiile +amma $ac parte "in cate+oria ra"iaiilor ioni#ante i au un e$ect puternic microbici". 7unt "i$icil "e pro"us i "e utili#at i $oarte periculoase "atorit e$ectelor pe care le au asupra materiei vii. -cest tip "e ra"iaii poate $i utili#at n sterili#area materialului me"ical i microbiolo+ic "e $olosin unic sau pentru sterili#area unor "eeuri.

3.1. +RE1TIRE& <I 4TERI'I5&RE& 4TIC'RIEI N '&.OR&TORU' DE /ICRO.IO'O1IE Pre+tirea i sterili#area materialului n ve"erea utili#rii n laboratorul "e microbiolo+ie este o operaie "eosebit "e important "eoarece exactitatea re#ultatelor precum i reuita "es$urrii proceselor microbiolo+ice "epin" n mare msur "e ri+uro#itatea cu care se e$ectuea#. Principalele operaii "e pre+tire a sticlriei "e laborator sunt) - splarea - uscarea - executarea "opurilor i ambalarea - recipientele pot $i pre+ tite cu "op "in vat (i"ro$ob pentru a nu pstra ume#eala "up autoclavare. <in ce n ce mai $olosite sunt "opurile "in celulo# comprimat (comerciali#ate ! sterili#abile pan la 23332. Pentru nlocuirea eprubetelor cu "op "e vat! n scopul pstrrii optime a culturilor! se pot utili#a tuburi prev#ute cu capsule care se montea# prin nurubare. Pentru evitarea contaminrii me"iilor "e culturA utili#ate Bn anali#a microbiolo+ic sau Bn obinerea culturilor microbiolo+ice! sticlria "e laborator trebuie ambalat i sterili#at corespun#tor. 7terili#area se e$ectuea# la etuv (sau pupinel ! iar materialele supuse acestei operaii trebuie s $ie curate i Bmpac(etate Bn (Crtie sau ae#ate Bn conteinere metalice Bnc(ise. 7terili#area uscat se poate aplica pentru articole "in sticl (plci Petri! baloane! pipete! eprubete ! obiecte "in porelan! instrumentar metalic fr su"uri Bn cositor! pulberi uscate etc. -erul $iin" slab con"uctor "e cldur! sterili#atorul trebuie s uni$ormi#e#e temperatura i s asi+ure ptrun"erea aerului $ierbinte Bn obiectele "e sterili#at. Dn calcularea timpului "e sterili#are uscatA trebuie avute Bn ve"ere urmtoarele etape) perioa"a "e ncl#ire la temperatura "e sterili#are! socotit n +eneral o or 6 perioa"a "e meninere a temperaturii "e sterili#are6 perioa"a "e rcire n care sc"erea temperaturii trebuie reali#at treptat pentru evitarea spar+erii obiectelor "e sticl prin oc termic! aprox. 2 ore. n practic se proce"ea# la ale+erea unei temperaturi "e sterili#are "e 1,3o 2 i a unei "urate "e o or . <in exces "e pru"en se practic sterili#ri la temperaturi mai ri"icate sau "e "urate mai mari. n unele ca#uri aceast practic este "untoare "eoarece! "e exemplu! vata or"inar - la "urate i temperaturi mari "e sterili#are uscat - eliberea# +u"roane ce pot in(iba creterea microbian.

/a!eriale u!iliza!e6 - pipete6 - plci Petri6 - eprubete6 - $lacoane Erlenma8er6 - vat (i"ro$ob6 - ti$on6 - (rtie ambala%6 - etuv. /od de lu ru6 7e execut "opuri "e vat (i"ro$ob pentru eprubete! ast$el nct s poat $i extrase uor n timpul inoculrii! iar "ensitatea materialului s asi+ure sterilitatea. Eprubetele se intro"uc in coul "e srm i se acoper cu (rtie. Pipetele se astup la partea opus vr$ului! cu un "op subire "e vat care s rein microor+anismele ce ar putea ptrun"e n pipet pe la partea superioar. Pipetele se ambalea# ntr-o $ie "e (rtie care se rsucete n %urul tubului "e sticl! ncepn" "e la vr$. Plcile Petri se ambalea# n (rtie "e ambala%! n $uncie "e numrul necesar. >lacoanele Erlenma8er pentru me"ii "e cultur se astup cu "op "e vat n$urat n ti$on. 4oat sticlria se sterili#ea# 1 or la 1,3 o2 la etuv! timp socotit "in momentul atin+erii temperaturii. <up aceast perioa" etuva se oprete i se ateapt rcirea materialului. =. E>&/ENU' /ICRO4CO+IC &' /ICROOR1&NI4/E'OR 7tu"iul mor$olo+iei microbiene nu poate $i conceput $r utili#area microscopului6 examenul microscopic %oac un rol important n stu"iul i i"enti$icarea +ermenilor! precum i n "eterminarea numrului acestora.

133 m domeniul mi ros o"iei o"!i e 13 m celule epiteliale +lobule ro ii "in sn+e bacterii tipice 1 m micoplasme 133 nm virusuri 13 nm (133 proteine 1 nm (13 aminoaci#i atomi 3!1 nm (1 domeniul mi ros o"iei ele !roni e

/ICRO4CO+U' O+TIC *icroscopul optic se compune "intr-un stativ pe care sunt montate un sistem "e transmisie optic! o platin port-obiect i un sistem "e iluminare. 4is!emul de !ransmisie o"!i O ularele au puterea "e mrire "e /x! 7x! 13x! 1/x! 23x i c(iar 33x. n lucrrile curente cele mai "es $olosite sunt cele 7x i 13x. ?cularele au rolul "e a mri ima+inea preparatului! "ar i "e a aplati#a i lumina cmpul optic. Obie !ivele repre#int un sistem optic bine centrat! constituit "in una sau mai multe
!

lentile "estinate a $orma o ima+ine real a obiectului. Puterea lor "e mrire este invers propor ional cu "istana $ocal! a"ic cu "istana "intre obiect i lentila pe care se $ormea# ima+inea. 2alitatea esential a obiectivelor este puterea lor "e re#oluie. -ceasta la rn"ul ei "epin"e "e mrimea "esc(i"erii un+(iului pe care l $ace conul "e ra#e care intr n lentil precum i "e in"icele "e re$racie al me"iului "intre obiect i lentil. ?biectivele sunt $ixate prin nurubare pe un revolver port-obiectiv care permite selecionarea rapi" a unuia "in ele! prin simpla rotire. =ama "e obiective necesare n microbiolo+ie se compune "in trei obiective cu puterea "e mrire "e 13x! 23x! 53x i un obiectiv cu imersie cu +rosismentul .3x. -cest obiectiv se $olosete n ca#ul n care obiectul ce trebuie examinat este mai mic sau "ac este necesar a se observa amnunte $oarte $ine. La obiectivul cu imersie este necesar a se interpune ntre obiect i lentila $rontal a obiectivului un lic(i" transparent (ulei "e ce"ru! ulei "e para$in! balsam "e 2ana"a etc . 4is!emul de iluminare se compune "in surs luminoas i "intr-un con"ensator. Condensa!orul este o pies care se +sete ime"iat sub platina microscopului i care are rolul nu att "e a strn+e (con"ensa ra#ele luminoase venite "e la sursa "e lumin! ct "e a mri seciunea conului "e lumin pentru o mai bun claritate a ima+inii. 4is!emul de re#lare <eplasarea platinei port-obiect sau a sistemului optic se e$ectuea# cu a%utorul unei cremaliere! prin interme"iul a "ou butoane) unul mare care " o micare ampl i rapi" (vi#a macrometric i altul mic! pentru re+la%ul $in ( vi#a micrometric . /odul de u!ilizare a mi ros o"ului Preparatul este plasat pe platina microscopului! avn" +ri% s $ie bine $ixat n "ispo#itivul "e prin"ere. Este selectat obiectivul6 n +eneral! un examen "ebutea# cu utili#area obiectivului cel mai mic. n practic! se utili#ea# obiectivul 13x! apoi 23x pentru un preparat necunoscut sau pentru "ro%"ii i muce+aiuri i obiectivul 53x pentru bacterii. 7e re+lea# "istana lentilei obiectivului $a "e preparat prin micarea vi#ei macrometrice i a celei micrometrice. (?biectivele au o "istan "e re+lare care "escrete cu puterea lor . 2utarea ima+inii este apoi e$ectuat prin manevrarea butonului care acionea# cremaliera! iar "up $ixarea ima+inii se $ace o nou re+lare a acesteia. 2urarea sistemului optic se e$ectuea# re+ulat cu x8lol i nu cu alcool etilic.
1"

@e+larea intensitii luminii con"ensatorului se $ace inn" seama "e puterea "e mrire a obiectivelor6 cu ct aceasta este mai mare! cu at t po#iia con"ensatorului este mai ri"icat.

E>&/ENU' +RE+&R&TE'OR N 4T&RE +RO&4+T -cest tip "e operatie const n examinarea unui microor+anism ntr-un me"iu lic(i" ntre lam i lamel.

=.1. 4TUDIU' /ICRO4CO+IC &' CU'TURI'OR DE DRO?DII <ro%"iile repre#int un +rup taxonomic complex i (etero+en "e microor+anisme unicelulare eucariote! care se nmulesc prin nmu+urire! ca $orm +eneral "e repro"ucere i n mo" particular prin ascospori. 9na "in propriet ile cele mai importante ale "ro%"iilor este aceea "e a $ermenta o serie "e #a(aruri! n con"iii "e anaerobio#! cu $ormare "e alcool etilic! "ioxi" "e carbon i compui secun"ari! care "au aroma caracteristic pro"uselor $ermentate! proprietate $oarte mult utili#at n in"ustria alimentar. <ro%"iile au o compo#iie c(imic valoroas i! "up cultivare n con"iii "e aerare sunt utili#ate ca surs "e proteine cu "enumirea "e 72P (sin+le cell protein n alimentaia omului i a animalelor. 2elula "e "ro%"ie are n mo" obinuit $orm s$eric! oval! cilin"ric! apiculat! sau $orm "e sticl! cu "imensiuni me"ii "e 5 - 15 m. >orma i "imensiunea celulei sunt caractere "e specie i pot $i in$luenate "e starea $i#iolo+ic i "e con"iiile "e cultivare. +rin i"iul me!odei6 Pentru evi"enierea caracterelor mor$olo+ice i structurale ale "ro%"iilor se $olosesc preparate microscopice n stare proaspt! stu"iate la microscop cu obiectivele 13x! 23x! 53x. /a!eriale u!iliza!e6 - ca materiale biolo+ice se vor utili#a o tulpin "e Saccharomyces cerevisiae i o tulpin "e Candida utilis! cultivate pe me"iu cu extract "e mal-a+ar. - lame "e microscop6 - lamele "e microscop - microscop6
11

- pipete sterile6 - ans6 - eprubete sterile6 - albastru "e metilen6 - alcool etilic ./ E6 - ap "istilat 133 ml6 - sticlu picurtoare.

/od de lu ru
a#

Prepararea colorantului -soluie albastru "e metilen

7e cntresc 3!3 + albastru "e metilen! peste care se a"au+ 33 ml alcool etilic ./ E. <up "i#olvarea colorantului n alcool se a"au+ 133 ml ap "istilat. b Evi"enierea caracterelor mor$olo+ice <e pe supra$aa me"iului "e cultur se recoltea# cu ansa o poriune "in cultura "e "ro%"ie care se amestec ntr-o eprubet cu civa ml ap. <in suspensia "e celule se "epune pe lama microscopic o pictur cu "iametrul "e F 3!7 cm! n #ona central! cu a%utorul unei pipete. 7e acoper preparatul cu o lamel curat! evitn"u-se $ormarea "e bule "e aer. 7e examinea# la microscop cu obiectivele "e 13x! 23x i 53x! reinn"u-se $orma celulei! pre#ena nucleilor! pre#ena celulelor nmu+urite. c Evi"enierea celulelor autoli#ate ? suspensie "e celule "e "ro%"ie se amestec n volume e+ale cu o soluie "e albastru "e metilen "iluat i "up 3-/ minute se execut un preparat ume") celulele autoli#ate vor apare intens colorate in albastru! comparativ cu celulele vii! necolorate. ntr-un cmp microscopic se vor "etermina numrul total "e celule i separat! celulele autoli#ate! $cn"use raportul acestora.

=.0. 4TUDIU' /ICRO4CO+IC &' CU'TURI'OR DE /UCE1&I

*uce+aiurile (sau $un+ii $ilamentoi

inclu" microor+anisme "e tip eucariot!

monocelulare sau pluricelulare! cu nutriie "e tip absorbtiv! "i$ereniate "in punct "e ve"ere mor$olo+ic i care se repro"uc prin spori sexuai sau asexuai. 2orpul muce+aiurilor const
12

"in celule $ilamentoase! rami$icate! numite (i$e! care $ormea# miceliul. *uce+aiurile pot $i monocelulare! cn" se "e#volt sub $orma unei celule uriae cu rami$icaii (miceliu coenocitic sau pluricelulare! ca# n care miceliul este septat prin pere i "espritori (miceliu necoenocitic . -paratul repro"uctor este repre#entat "e (i$ele repro"uc toare purt toare "e spori sexuai sau asexuai. +rin i"iul me!odei6 Pentru evi"enierea caracterelor mor$olo+ice i structurale -(i$e ve+etative i aparat repro"uctor - se e$ectuea# un preparat proaspt ntre lam i lamel sau un preparat n lacto$enol! prin te(nica ben#ii a"e#ive. /a!eriale u!iliza!e6 - culturi "e Aspergillus niger i Penicillium sp.n plci Petri 6 - lame microscopice6 - lamele microscopice6 - microscop6 - pipete sterile6 - ans6 - lacto$enol6 - ban" a"e#iv transparent.

/od de lu ru6 7e e$ectuea# un preparat ume" ntre lam i lamel! n $elul urmtor) "in cultura n plci Petri se recoltea# cu a%utorul $irului metalic! "in partea mar+inal a coloniei i $r a "eran%a structura iniial a miceliului! o mic poriune! care se "esprin"e uor ntr-o pictur "e ap steril sau lacto$enol "e pe lama microscopic. 7e aea# lamela evitn" $ormarea n preparat a bulelor "e +a# i se $ace stu"iul cu obiectivele 13x! 23x i 53x. Pentru meninerea ct mai exact a structurii aparatului repro"uctor! se poate ae#a uor ban"a cu partea a"e#iv peste cultura "e muce+ai "in placa Petri! apoi se pune peste pictura "e lacto$enol "e pe lama microscopic. 7e examinea# cu aceleai obiective. Pentru cele "ou tulpini $un+ice se observ $orma (i$elor! pre#ena septurilor (i$ale! pre#ena coni"i$orilor cu or+anele "e $ructi$icaie speci$ice +enurilor Aspergillus i Penicillum.

13

=.3. E@IDENIERE& /ICRO4CO+IC & .&CTERII'OR

:acteriile sunt microor+anisme monocelulare "e tip procariot! cu un cromo#om unic! cu "imensiuni me"ii ntre 3!/ - , m! care se nmulesc asexuat prin sci#iune binar! i#omor$. :acteriile au un rol ma%or n natur n trans$ormarea compuilor or+anici n compui anor+anici simpli! prin procesul "e minerali#are a materiei or+anice nevii! contribuin" la reali#area circuitelor unor elemente c(imice "e importan vital) carbon! a#ot! sul$! $os$or .a. n procesele in"ustriale! bacteriile sunt utili#ate "rept culturi starter n unele procese $ermentative "in in"ustria alimentar ($abricarea pro"uselor lactate! n pani$icaie! la conservarea materiilor prime ve+etale ! la obinerea "e en#ime! proteine! aminoaci#i! aci#i or+anici! solveni! antibiotice! n+rminte biolo+ice! insectici"e ! vitamine! (ormoni etc. +rin i"iul me!odei6 meto"a se ba#ea# pe e$ectuarea preparatului proaspt ntre lam i lamel "in culturi bacteriene obinute "in Bacillus subtilis i Lactobacillus sp. /a!eriale u!iliza!e: - cultur n slanturi "e Bacillus subtilis6 - cultur "e Lactobacillus in me"iu lic(i" (me"iul *@7 6 - lame microscop6 - lamele6 - ans6 - ap "istilat.

/od de lu ru6 Pe lama microscopic se pune o pictur "e ap steril cu "iametrul "e 3!7 -1 cm. 2u vr$ul $irului metalic se recoltea# steril! la $lacra "e +a#! o por iune "intr-o cultur "e Bacillus subtilis pe a+ar nutritiv! n eprubete. 2ultura se omo+eni#ea# ntr-o pictur "e ap! apoi se ia o lamel curat ! se spri%in pe lam la un un+(i "e 5/o ! se "eplasea# pn cn" lamela "evine tan+ent la pictur i se las s ca" peste aceasta) lic(i"ul n exces se absoarbe cu o (rtie "e $iltru. 9n preparat bun nu trebuie s pre#inte bule "e aer6 acestea pot "etermina a+lomerri "e celule i mpie"ic o bun observare a proprietilor. Pentru executarea preparatului "in culturile lic(i"e "e Lactobacillus! se recoltea# "in proba omo+eni#at cu o pipet "in care se las s ca" pe lam o pictur! care se acoper
14

apoi cu lamela. 7e observ cu obiectivele 23x i 53x. 7e vor urmri) n ambele ca#uri- $orma celulelor! eventual $ormarea "e lanuri "e bacili6 pre#ena sporilor bacterieni n ca#ul preparatului cu Bacillus subtilis.

E>&/ENU' +RE+&R&TE'OR .&CTERIENE N 4T&RE U4C&T

E$ectuarea unui preparat n stare uscat sau $rotiu const n etalarea probei "e stu"iat urmat "e o uscare! "e o $ixare i! eventual! "e o colorare. >rotiurile sunt reali#ate $recvent pentru bacterii sau pentru pro"use care conin bacterii! rareori pentru alte microor+anisme.

=.=. TE*NIC& DE E>ECUT&RE & +RE+&R&TE'OR U4C&TE. 1R&/

CO'OR&TI&

n anul 1,,5 2(ristian =ram a constatat c bacteriile reacionea# "i$erit n urma aceleiai te(nici "e colorare i pune ba#ele meto"ei "i$ereniale "e colorare ce i poart numele, prin care bacteriile sunt mprite in "ou mari +rupe ) =ram - po#itive i =ram ne+ative. -ceast a$initate tinctorial "i$erit $a "e colorani este "atorat structurii "eosebite a peretelui celular la cele "ou cate+orii "e bacterii ) bacteriile =ram - po#itive se colorea# n violet prin aceast te(nic! n timp ce bacteriile =ram - ne+ative primesc culoarea ro# sau ro ie a colorantului secun"ar utili#at. Peretele celular al bacteriilor =ram po#itive const ntr-un strat unitar i omo+en "e pepti"o+lican! cu +rosimea "e 23 - ,3 nm. n contrast! peretele celular al bacteriilor =ram - ne+ative este mai complex! $ormat "intr-un strat "e pepti"o+lican "e 1 -3 nm ncon%urat "e o membran extern "e 7 - , nm.

+rin i"iul me!odei6 2olorarea "i$ereniat a celulelor n $uncie "e structura peretelui celular! prin meto"a =ram! are la ba# o te(nic n mai multe etape. n prima etap! celulele sunt colorate cu colorantul ba#ic cristal-violet! utili#at "rept colorant primar. 2ea "e a "oua etap cuprin"e tratamentul cu o solutie "e I 2 G HI! cu rol "e mor"ant! care mrete interacia "intre
15

colorant i componentele celulei. - treia etap este repre#entat "e splarea cu alcoolaceton! un"e se "i$erenia# cele "ou tipuri "e bacterii 6 cele =ram po#itive rein cristalul violet! n timp ce bacteriile =ram - ne+ative pier" colorantul primar i "evin incolore. n $inal! acestea "in urm sunt colorate cu un alt colorant! secun"ar! cum este sa$ranina sau $uxina. n acest mo"! cele "ou cate+orii "e bacterii rmn colorate "i$erit! put n" $i "i$ereniate n $uncie "e structura peretelui lor celular. /a!eriale u!iliza!e6 - cultur bacterian6 - violet "e +eniana6 - $enol cristali#at6 - io"6 - io"ur "e potasiu6 - alcool6 - aceton6 - $uxin sau sa$ranin - ulei "e imersie6 - lame "e sticl6 - balan6 - pipete6 - baloane cotate6 - sticlue picurtoare. /od de lu ru6 &. +re"ararea soluiilor 1. @iole! de #eniana6 - violet "e +enianaIII 1 + - $enol cristali#atIIII/ + - alcool etilic .6 EIII13 ml - ap "istilatIIII..133 ml 7e triturea# cristalele n mo%ar! se a"au+ cteva picturi "e +licerin i treptat! alcoolul! pn "evine ca o past! i apoi cantitatea "e ap. 7e pstrea# 5, ore! "up care se $iltrea# i se $olosete la colorarea "up =ram.

16

0. 4oluie de 'u#ol6 - io" metalicIIIIII1 + - io"ur "e potasiuIII. 2 + - ap "istilatIIII..333 ml 7e "i#olv io"ura "e potasiu n / ml ap! se a"au+ cristalele "e io" i se "i#olv! apoi se a"au+ restul "e ap pn la 333 ml. 3. -u:ina 5iehl6 - $uxin ba#icIIIII1 + - $enol cristali#atIIII/ + - alcool etilic .6EIII13 ml - ap "istilatIIII.133 ml 7e triturea# cristalele n mo%ar! se amestec cu cteva picturi "e +licerin! se a"au+ alcoolul treptat! pn se $ormea# ca o past i se a"au+ ap "istilat. 7e $iltrea# "up un repaos "e 5, ore. Pentru soluia "iluat se $ace un amestec cu ap "istilat n propor ie "e 1G13. .. E!a"ele de obinere a fro!iurilor olora!e sun! urm!oarele6 Pre+tirea lamei) Lama per$ect curat se sterili#ea# prin treceri consecutive ale ambelor $ee prin $lacra becului "e +a# i se las s se rceasc pe stativ! n po#iie nclinat. Etalarea suspensiei "e celule) Preparatul se reali#ea# n pictur "e ap steril n care se suspen" celulele recoltate cu $irul "e inoculare. 7uspensia "e celule se ntin"e prin "eplasarea $irului ansei tan+ent cu lama! ntr-un strat uni$orm. Preparatul "e pe lama pe care s-a $cut etalarea i uni$ormi#area materialului biolo+ic poart numele "e $rotiu. 9scarea $rotiului) <up uni$ormi#are! $rotiul se aea# pe stativul "e uscare sau se menine n curentul "e aer cal"! la "istan "e $lacra becului "e +a#! pentru a se pro"uce evaporarea lic(i"ului i ataarea celulelor bacteriene "e supra$aa lamei. >ixarea $rotiului const n omorrea i a"erarea la lam a celulelor microbiene. >ixarea prin cl"ur se $ace trecn" $rotiul uscat "e trei ori! cu o micare lent! prin $lacra becului "e +a#! cu $aa opus celei pe care se a$l preparatul.

C. Tehni a de olorare ons! n urm!oarele6 >rotiul uscat i $ixat se acoper cu violet "e +eniana! care se menine 1-2 minute! "up
17

care se scur+e i se cltete cu ap. >rotiul se acoper cu solutie Lu+ol! cu rol "e mor"ant! timp "e 1 minut6 se scur+e i se cltete cu ap6 7plarea $rotiului n 2-3 rn"uri! cu picturi "in amestecul "e alcool-aceton (3G1 6 >rotiul se spal cu ap n %et subire i se colorea# cu o soluie "e $uxin "iluat (1G13 ! care se menine pe preparat 1-2 minute! se scur+e excesul "e colorant! se spal cu ap6 9scarea $rotiului i examinarea preparatului cu obiectiv "e imersie. 2elulele =ram po#itive J=(K L vor apare colorate n violet! celulele =ram ne+ative! n rou. =.A. DETER/IN&RE& DI/EN4IUNII CE'U'E'OR CU &?UTORU' 4C&'EI /ICRO/ETRICE J =(- L!

+rin i"iul me!odei6 *surarea "iametrului celulelor! sporilor sau (i$elor poate $i e$ectuat utili#n" un sistem ocular-obiectiv prev#ut cu un micrometru ocular i un micrometru obiectiv. *icrometrul ocular este o plcu rotun" "in sticl $oarte clar! pe care este +ravat o scar micrometric. -cesta se intro"uce n tubul ocularului microscopic! cu $aa n %os! "up "eurubarea lentilei superioare. 7cara micrometric este "ivi#at n /3 "e "ivi#iuni e+ale notate "e la 3 - /3! "in 13 n 13. Valoarea unei "ivi#iuni a scrii micrometrice varia# "e la microscop la microscop! "ar i n $uncie "e obiectivul $olosit la examinare. <e aceea este necesar ca aceste valori s $ie "eterminate pentru $iecare microscop n parte i! la acelai microscop! pentru $iecare combinaie ocular - obiectiv. Etalonarea se $ace cu a%utorul unei lame speciale numit micrometru obiectiv sau lam micrometric! pe care este "e asemenea +ravat sau $oto+ra$iat o scar lun+ "e 1 mm i "ivi#at n 133 pri. 7pre "eosebire "e scara micrometric a ocularului! valoarea unei "ivi#iuni "e pe lama micrometric este cunoscut! $iin" e+al cu 1 G 133 "intr-un milimetru! a"ic cu 13 micrometri. <eci intervalul "intre "ou "ivi#iuni "e pe lama micrometric este e+al cu 13 micrometri.

/a!eriale u!iliza!e6 - micrometru obiectiv (3!31 mm 6 - micrometru ocular6 - microscop6 - culturi "e "ro%"ii i muce+aiuri6 - lame microscopice6 - lamele microscopice6 - ac "e inoculare.

/od de lu ru6 E!alonarea s rii mi rome!ri e 7e aea# lama cu micrometrul obiectiv pe platina microscopului i se intro"uce ocularul micrometric n ocularul stn+ al microscopului! cu $aa in %os. 7e prin"e n cmpul microscopului scara micrometric a obiectivului (cu linii +roase i se pune la punct pn ce apare $oarte clar vi#ibil. 7e caut s se suprapun cele "ou scri micrometrice a$late acum n cmpul microscopului (aceea cu linii +roase i mai mari $iin" scara obiectivului i aceea cu linii mai mici i subiri! scara ocularului . 7e rote te ocularul cu scara micrometric ast$el nct s se suprapun exact peste scara obiectivului. 7e caut cte "ivi#iuni ale micrometrului obiectiv sunt acoperite exact "e "ivi#iunile micrometrului ocular. Practic se proce"ea# ast$el) se caut prima "ivi#iune a scrii obiectivului! care se suprapune exact peste una "in liniile subiri ale scrii oculare. 7e numr a cta "ivi#iune a micrometrului ocular se suprapune "in nou exact peste o "ivi#iune a micrometrului obiectiv. Pentru stabilirea valorii unui interval "intre "ou "ivi#iuni ale ocularului micrometric (care se mai numete i in"ice sau coe$icient micrometric ! se calculea# ast$el) "ac o "ivi#iune a obiectivului micrometric este e+al cu 3!31 mm! atunci $iecare "ivi#iune a micrometrului ocular va $i e+al cu 3!31G nr "e "ivi#iuni "up care se suprapun. Etalonarea micrometrului ocular se va $ace pentru obiectivele 23x i 53x! ast$el) "ac n +ra"aii "e pe ocular corespun" la una sau p +ra"a ii "e pe obiectiv! o sin+ur +ra"aie "e pe ocular va avea valoarea 3!31GM sau (pGM 13-2 mm. Prin acelai proce"eu se "etermin in"icele micrometric al $iecrui microscop! pentru toate combinatiile ocular-obiectiv! care se scriu apoi pe o list ce se aea# n interior! pe ua cutiei microscopului. Pentru msurarea "imensiunilor celulei se va ae#a preparatul microscopic proaspt
1!

ntre lam i lamel! pe platina microscopului i suport! se va po#iiona ast$el nct s poat $i "eterminat numrul "e +ra"aii "e pe ocular! corespun#tor "iametrului mare i "iametrului mic! rotin"u-se ocularul i "ispo#itivul "e po#iionare al platinei-port obiect. 2unoscn"u-se valoarea unei "ivi#iuni N(pGM 13-2O i numrul "e "ivi#iuni citite pe scal! se va "etermina valoarea "imensiunii celulei) (npGM 13-2 mm.

A. +RE+&R&RE& I 4TERI'I5&RE& /EDII'OR DE CU'TUR

9n me"iu "e cultur repre#int un substrat nutritiv complex! steril! care trebuie s asi+ure microor+anismelor cantitatea necesar "e ap! sursa "e carbon! "e a#ot! sruri minerale! $actori "e cretere! "eci care s le $urni#e#e substanele i ener+ia necesare n procesele "e cretere! repro"ucere i ntreinerea $unciilor vitale. *e"iul "e cultur trebuie s n"eplineasc urmtoarele con"iii) s corespun" "in punct "e ve"ere nutritiv! s aib o concentraie a substantelor "i#olvate care s nu in$luene#e ne+ativ sc(imburile osmotice ale celulei s nu conin substane toxice! s aib un anumit p; s $ie steril (lipsit "e microor+anisme vii ! ast$el nct s se "e#volte numai celulele intro"use prin inocul. *e"iile "e cultur se $olosesc n practica "e laborator sau n practica in"ustrial i sunt $oarte "i$ereniate n $uncie "e scopul urmrit. n te(nica "e laborator me"iile se $olosesc pentru i#olarea "in me"iul natural a "i$eritelor microor+anisme! pentru ob inerea "e culturi pure! pentru ntreinerea culturilor selecionate. n scopuri in"ustriale! me"iile "e cultur sunt utili#ate pentru obinere "e biomas sau a unor compui "e natur microbian. <up scopul utili#rii lor! me"iile "e cultur se mpart n) * * me"ii "e cultur +enerale care asi+ur "e#voltarea unui mare numr "e specii me"ii "e cultur selective care permit "e#voltarea unui numr restrns "e
2"

microor+anisme * me"ii "e cultur "e "i$ereniere care permit separarea speciilor n $uncie "e anumite

caractere bioc(imice * me"ii "e mbo+ire "estinate separrii i cultivrii unor microor+anisme pretenioase

"in punct "e ve"ere nutritiv sau care se a$l n numr re"us * * me"ii "e conservare me"ii "e cultur in"ustriale <in punct "e ve"ere al compo#iiei c(imice! me"iile "e cultur se mpart n 3 cate+orii) * me"ii naturale (empirice "e ori+ine animal sau ve+etal! cu o compo#iie c(imic

ne"e$init n mo" exact6 * me"ii sintetice) acestea sunt soluii "e substane c(imice pure n ap "istilat! cu o

compo#iie per$ect "eterminat6 * me"ii semi-sintetice) sunt constituite "in pro"use c(imice bine "e$inite! "ar i "in

pro"use "e ori+ine natural (cu compo#iie cunoscut .

2onstituenii principali ai me"iilor "e cultur sunt$ 1. Extracte "e carne i macerate -ceste pro"use! comerciali#ate n $orm concentrat sub "enumirea "e &extracte "e carne'! conin n principal proteine puin (i"roli#ate! +luci"e! sruri minerale! vitamine (i"rosolubile. 2ompo#iia lor varia# n $uncie "e carnea utili#at pentru preparare. 2. Extracte "e "ro%"ie -ceste extracte! comerciali#ate sub $orm "es(i"ratat! sunt preparate "in "ro%"ia "e bere! $iin" utili#ate ca surs "e aminoaci#i i "e vitamine (i"rosolubile complexul : . 3. Peptone i (i"roli#ate Peptonele repre#int un amestec "e compui solubili n ap care provin n urma aciunii en#imelor asupra materialului proteic. Pot $i) pepton pepsic "in carne! pepton tripsic "in ca#ein (cu coninut crescut n tripto$an ! pepton pancreatic "e ca#ein! pepton tripsic "e carne! pepton papainic "e soia! peptone compuse. ;i"roli#atele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anor+anici asupra proteinelor (aci" clor(i"ric "e ex. . 2el mai "es ntrebuinat este (i"roli#atul aci" "e ca#ein!
21

(vitamine

"in

coninn" aminoaci#ii constitutivi ai ca#einei "in lapte. 5. -+ar-a+arul sau +elo#a -+ar-a+arul "enumit i +elo# este un extract "e al+e ro ii (@(o"op(8ceae "in +enul =eli"ium i =racilaria! recoltate n mrile Paponiei sau ale Qoii Reelan"e. 7e "i#olv n ap la o temperatur n %ur "e .332 i se soli"i$ic sub 5/32! $iin" utili#at pentru soli"i$icarea me"iilor "e cultur. Qu este "e+ra"at "e microor+anismele obinuite. Este comerciali#at n $orma sa iniial "es(i"ratat ! numit &a+ar $ibre' ($oarte impur ! sub $orm "e paiete (mai puin impur ! sau sub $orm "e pulbere. Qumeroase $irme sunt speciali#ate n pro"ucerea i comerciali#area me"iilor "e cultur "e laborator ($irma <i$co! *erc1! :io1ar! ?xoi" . *e"iile $ermentative sunt me"ii "e cultur in"ustriale "estinate pro"ucerii unor cantiti mari "e celule sau pro"u i "e metabolism. n compo#itia acestor me"ii intr ca surse "e carbon) melasa! pro"us secun"ar re#ultat la $abricarea #a(rului i care conine 5/ - //E #a(aro#! "i$erite tipuri "e $inuri! cereale boabe! #er bo+at n lacto#! tre etc. <intre sursele "e a#ot cel mai "es $olosite sunt) $inurile proteice "e soia! sul$atul "e amoniu! ureea! n+rmntul complex. 2a sruri minerale se a"au+ $os$ai! sul$ai! cloruri etc. Pentru cultivarea microor+anismelor care necesit $actori "e cretere! se a"au+ extract "e porumb (obinut prin concentrarea apelor re#ultate la nmuierea porumbului! bo+at in aminoaci#i! vitamine! aci" lactic! microelemente ! extract "e "ro%"ie! extract "in ra"icele "e mal i +ermeni "e +ru i porumb.

A.1. +RE+&R&RE& /EDII'OR DE CU'TUR +ENTRU NTRETINERE& .&CTERII'OR, DRO?DII'OR <I /UCE1&IURI'OR

/a!eriale u!iliza!e6 - balan cu preci#ie "e 3!1 +6 - pa(are :er#elius6 - sit a#best6 - a+ar nutritiv pulbere6 - me"iu "e cultur extract "e mal - a+ar pulbere6 - me"iu extract "e carto$-"extro# -a+ar pulbere6 - eprubete cu "op! sterile6
22

- pipete "e 13 ml6 - $lacoane Erlenma8er6 - bec "e +a#6 - autoclav cu +a#e.

/od de lu ru6 2on$orm in"icaiilor "e pe $lacoanele coninn" me"iile "e cultur pulverulente! se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru "in $iecare tip "e me"iu "e cultur pentru eprubete i cte 333 ml me"iu pentru baloanele Erlenma8er. n ca#ul n care nu exist me"ii "es(i"ratate! procurate "e la $irme speciali#ate! me"iile se vor prepara prin c ntrirea componentelor pentru volumul $inal "orit. *e"iul "e cultur se a"uce la $ierbere n pa(arele :er#elius "e 1 l! pn la completa "i#olvare a a+arului! apoi se reparti#ea# cte 13 ml n eprubete sterile! prev#ute cu "op "e vat! care se aea# n couri "e sCrm i se acoper cu (rtie. n me"iu se "etermin p;-ul i! "ac este necesar! se a%ustea# la valoarea "orit. *e"iile cu a+ar nu trebuie s $ie a"use la un p; mai mic "e 6! "eoarece a+arul este parial (i"roli#at n timpul sterili#rii la p; aci" i nu se mai soli"i$ic la rcire. 2n" sunt necesare ast$el "e me"ii! p;-ul trebuie a%ustat "up sterili#are. :aloanele Erlenma8er se astup cu "op "e vat nvelit n ti$on! se lea+ la +ur cu (rtie i s$oar. 2ourile i baloanele Erlenma8er se intro"uc n autoclavul cu +a#e! iar sterili#area se $ace con$orm instructiunilor a$iate lan+ aparat. 7e nc(i"e capacul autoclavului! se veri$ic nivelul apei n vasul "e nivel! se aprin"e +a#ul i se ateapt apariia %etului "e abur viu care este eliminat prin pur%. <up 13-1/ minute "e pur%are se nc(i"e robinetul pur%ei! iar presiunea in"icat "e manometru va urca pn la valoarea 1! un"e va $i meninut timp "e 23 min. prin micorarea $lcrii. ntre presiune i temperatura "in autoclav exist o corelaie! aa cum se pre#int n tabelul urmtor)

Tem"era!ura n #rade Celsius 133

+resiunea n )#Bm3 3!33

23

+resiunea n a!mosfere 3!33

13/ 113 112 11/ 123 121 122 12, 133 13/ 153

3!23 3!53 3!// 3!6. 3!.. 1!33 1!33 1!// 1!72 2!16 2!6/

3!23 3!52 3!/3 3!67 3!.6 1!33 1!2. 1!/3 1!6/ 2!3. 2!/6

<up acest interval se oprete +a#ul! se ateapt sc"erea presiunii pe manometru! se "esc(i"e pur%a i "up / minute se poate "esc(i"e capacul autoclavei. n +eneral! me"iile "e cultur trebuie s o$ere o supra$a "e "e#voltare suficient pentru microor+anisme. <e aceea ! "up sterili#are tuburile cu me"iu se nclin pentru ca s rmn cu o supra$a mare "e cretere. nclinarea se $ace prin spri%inirea eprubetelor pe o ba+(et su$icient "e +roas! inn" seama ca me"iul ne+eli$icat s nu u"e "opul "e vat! ci s se opreasc la 2 - 3 cm "e acesta. Prin r cire! vaporii ce ies "in me"iul cal"! se con"ensea# pe pereii mai reci ai eprubetelor i ca" sub $orm "e picturi pe me"iu! a"unn"u-se pe $un"ul eprubetei. <in aceast cau#! eprubetele cu me"iul rcit nu se aea# n po#iie ori#ontal! ci vertical! in couri "e srm. -cestea se acoper apoi cu o (rtie i se lea+ cu s$oar. Pentru a nu prepara n $iecare #i me"ii! sau! "ac este nevoie "e mai multe $eluri "e me"ii n acelai timp! acestea se pre+tesc o "at i apoi se "epo#itea# pentru pstrare. 7ticlele cu me"ii se etic(etea#! notn"u-se tipul me"iului i "ata preparrii. Pentru evitarea uscrii se recoman" pstrarea me"iilor nutritive n $ri+i"er.

24

6. N4/NC&RE& CU'TURI'OR DE .&CTERII, DRO?DII <I /UCE1&IURI

+rin i"iul me!odei: *icroor+anismele pot $i cultivate pe me"ii "e cultur n plci Petri sau n tuburi! att pentru stu"iul lor! pentru conservarea lor prin re$ri+erare! c t i pentru obinerea culturilor stoc i "e lucru! n "iversele procese biote(nolo+ice. ?peraia "e trecere a unei culturi "intr-un vas "e cultur n altul se numete re"i are sau !re ere! iar $ra+mentul "e cultur ce se trece pe alt me"iu se numete ino ulum. n ;urul fl rii be ului de #az e:is! o zon s!eril u diame!rul de a"ro:ima!iv 08 m, n li"sa urenilor de aer. Toa!e mani"ulrile oninnd are ne esi! des hiderea re i"ien!elor s!erile sau "ro!e ie. ul!uri !rebuie efe !ua!e n a eas! zon de

6.1. NSMNAREA N TUBURI /a!eriale u!iliza!e6 - culturi "e Bacillus subtilis pe a+ar nutritiv6 - culturi "e Saccahromyces cerevisiae pe me"iul extract "e mal - a+ar6 - culturi "e Monascus purpureus , Aspergillus niger i Penicillium pe me"iul extract "e carto$ - "extro# - a+ar6 - $ir "e inoculare6 - bec "e +a#6 - eprubete cu me"iu sterili#at i nclinat (nutrient-a+ar! extract "e mal-a+ar! extract "e carto$-"extro#-a+ar 6 - termostat la 33 o26 - lamp bacterici". /od de lu ru6 nsmnarea u ansa 7e ter+e supra$aa "in interiorul niei "e lucru cu un tampon mbibat cu alcool ./E. 7e aprin"e lampa bacterici" i se las 1/ minute pentru sterili#area incintei "e lucru. 7e spal minile cu spun! apoi se cltesc cu alcool. 7e aprin"e becul "e +a# i se re+lea# $lacra! care trebuie s aib conul "e culoare albastr.
25

7e ine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna stn+! n po#iie oblic sau c(iar ori#ontal. n mna "reapt se ine acul "e repicat. -cesta se ar"e n $lacra becului "e +a#! inCn"u-l n po#iie vertical pentru ca $lacra s cuprin" o por iune cCt mai mare "in el. 7e ine n $lacr pn ce mai mult "e %umtate "in ac se Bnroete! apoi se plimb "e 2 -3 ori i restul acului pn la mCner! n $lacr. <up aceea se apropie +ura eprubetei "e $lacr i! cu "e+etul mic "e la mna "reapt n"oit! se tra+e a$ar "opul "e vat "in +ura eprubetei! apucn"u-l "e captul rmas a$ar. Qu i se " "rumul "opului pe mas sub nici un motiv! ci se ine tot timpul n mn. 7e trece +ura eprubetei "e 2 -3 ori prin $lacr. 7e intro"uce acul $ierbinte n eprubet i se rcete! nu n cultur! ci alturi! pe o por iune "e a+ar $r cultur. 7e ia apoi o $oarte mic poriune ("e 1 - 2 mm "in cultur pe vCr$ul acului (se ale+e por iunea cea mai tipic i mai curat a culturii respective . 7e scoate acul "in eprubet! se ar"e "in nou +ura eprubetei i se astup cu "opul "e vat "in mna "reapt. 7e las %os eprubeta i se ia! tot cu mna stn+! o alt eprubet cu me"iu steril. -cul "e repicat cu $ra+mentul "e cultur! se ine mai "eparte n mna "reapt $erin"ul acum "e $lacr. 7e proce"ea# cu eprubeta a "oua la $el cum s-a proce"at cu prima! a"ic) se ine n po#iie ori#ontal sau putin oblic n mna stn+! se scoate "opul cu "e+etul cel mic "e la mna "reapt n"oit! inn"u-se tot timpul operaiei "e repicare n mn. 7e trece +ura eprubetei prin $lacr! se intro"uce acul "e repicare cu $ra+mentul "e cultur ! atin+n" uor me"iul (n centrul eprubetei ! pn ce bucica "e cultur rmne pe me"iu. 9neori este bine ca $ra+mentul "e cultur s $ie puin a$un"at Bn me"iu! pentru a $ace un contact mai strns cu el. 7e scoate acul "e repicat "in eprubet ! se ar"e "in nou +ura eprubetei i se astup cu "opul "in mna "reapt. 7e trece i captul "opului care a $ost inut cu mna prin $lacr! "ar $oarte rapi". 7e ar"e "in nou acul n $lacr pan la rou. -ceast operaie este absolut necesar i trebuie $cut cu rb"are! pentru a se evita in$ectarea me"iilor urmtoare. <up ar"erea acului se ia "in nou eprubeta cu cultura ce trebuie repicat i se repet operaia "e repicare cu o alt eprubet steril. 4oate micrile "escrise mai sus! "in care const operaia "e repicare! trebuie executate "estul "e repe"e pentru a nu permite in$ectarea me"iilor sterile "in eprubete. Ele trebuie $cute cu o oarecare ritmicitate i nu prelun+ite prea mult. <e asemenea trebuie respectate o serie "e in"icaii! care la prima ve"ere par minore! "ar "e care "epin"e $oarte mult
26

reuita unei repicri. -st$el! trebuie avute Bn ve"ere) -inerea eprubetei n po#iie ori#ontal n timpul repicrii pentru a evita c"erea sporilor "e ciuperci i bacterii "in atmos$er pe me"iu6 -inerea acului "e repicat n po#iie vertical n $lacr i nu ori#ontal! pentru ca ar"erea s se $ac pe o poriune ct mai mare6 -scoaterea "opului "e vat cu "e+etul mic al minii "repte i inerea lui tot timpul n mn! pentru a-l $eri "e contaminri secun"are6 -ar"erea +urii eprubetei la scoaterea i intro"ucerea "opului "e vat ! "eoarece pe mar+inile exterioare ale e%rubetei pot exista +ermeni "e in$ecie secun"ar. <up "e#voltarea culturii se observ aspectul ! culoarea! tipul coloniilor! precum i eventuala pre#en a contaminrii cu alte microor+anisme. nsmnarea u "i"e!a +as!eur sau u "i"e!a #rada! Pentru pre+tirea pipetei Pasteur! se ia un tub "e sticl obinuit! cu "iametrul exterior "e 6 mm i cel interior "e 5 mm! care se taie la o lun+ime "e 2/ cm! se rotun%esc mar+inile la $lacr! se astup cu "opuri "e vat ! se ambalea# i se sterili#ea#. n momentul utili#rii! partea me"ian a tubului se menine n vr$ul conului albastru al $lcrii! se rotete uor i! cn" sticla s-a nmuiat! se n"eprtea# "in $lacr i se e$ilea# "up lun+imea "orit. <up soli"i$icare! se separ n cele "ou %umti cu care se poate lucra. nsmnarea cu pipeta se practic atunci cn" se "orete recoltarea unui inocul lic(i". Pipeta se trece rapi" prin $lacr! iar pipeta Pasteur se spar+e n "reptul mi%locului e$ilat. <in tubul ce conine cultura se prelevea# cteva picturi sau un volum "eterminat "e inocul! care se pipetea# n me"iul proaspt! steril. 2ulturile se termostatea# timpul necesar "e#voltrii $iecrui tip "e microor+anism.

D.0. EN4F/GNC&RE& EN +'FCI +ETRI

/a!eriale u!iliza!e6

27

- plci Petri sterile - me"ii "e cultur pentru bacterii! "ro%"ii! muce+aiuri! aceleai ca n ca#ul nsmnrii n tuburi - culturi "e bacterii! "ro%"ii! muce+aiuri - pipete sterile - ap steril - $ir "e inoculare - bec "e +a# - termostat

/od de lu ru *e"iul "e cultur steril se topete pe baie "e ap! "up care se rcete la 5732 i se reparti#ea# n mo" aseptic n plcile Petri! pentru evitarea unui con"ens prea mare pe capacul plcii. 7e las me"iul s se soli"i$ice la temperatura camerei. Pentru economie "e spa iu i pentru evitarea $ormrii unui con"ens prea abun"ent! plcile se pot ae#a una peste alta! "ac este posibil. 7e a+it tubul coninn" suspensia "e celule n ap steril i se recoltea# cu pipeta aproximativ 2 ml "in cultur! care se intro"uc n placa Petri! pe supra$aa me"iului nutritiv. 7e reparti#ea# omo+en! pe toat supra$aa! se scur+e excesul "e lic(i" i se termostatea# la temperatura convenabil. nsmnarea me"iului "e cultur "in plcile Petri se poate $ace "e asemenea! prin ncorporarea suspensiei "e celule! ast$el) se pipetea# n placa steril! +oal! 1 ml "in suspensia "e celule! "up care se toarn me"iul topit i rcit la 5/ - 5732 i se omo+eni#ea# pentru reparti#area uni$orm a celulelor "in cultur. 7e las s se soli"i$ice i se incubea#.

H. 4TUDIU' C&R&CTERE'OR CO'ONII'OR DE .&CTERII, DRO?DII <I /UCE1&IURI

1. Cara !ere morfo oloniale ale ba !eriilor a. Cul!uri "e medii #eloza!e n "l i +e!ri
2

7e vor examina coloniile bacteriene care s-au "e#voltat pe supra$aa me"iului soli"i$icat n perioa"a care a trecut "e la lucrarea anterioar! avn"u-se n ve"ere urmtoarele caractere) *rimea coloniilor) - colonii mici S 1 mm - colonii me"ii 1!/ p n la 3 mm - colonii mari 3 mm 2. >orma coloniei) - puncti$orm (a ! circular (b ! $ilamentoas (c ! nere+ulat &d#! r(i#oi" &e ! $usi$orm ($ .

"

3. Pro$ilul coloniei) - plat (a ! crescut (b ! convex (c ! pulvinat (" ! umbonat(e .

2!

"

5. *ar+inea) - uni$orm (a ! on"ulat &b#! lobat &c ! ero"at &d#! $ilamentoas &e#! buclat &f .

"

/. 4ransparena) - colonii transparente - colonii transluci"e - colonii opace. 6. 7upra$aa) - colonii lise (uneori strlucitoare - colonii ru+oase - colonii mucoi"e 7. 2onsistena - nu poate $i apreciat cel mai a"esea "ect n urma prelevrii "e probe) - colonii +rase! cremoase! care "au uor suspensii omo+ene - colonii uscate - colonii mucoi"e ($ilante ! care "au +reu suspensii omo+ene. ,. Pi+mentaia) - coloniile sunt cel mai a"esea "e culoare crem. ? culoare "i$erit este "atorat unor pi+meni! care sunt uneori solubili n me"iul "e cultur i care nu apar "ect la o temperatur "eterminat. n $inal! coloniile bacteriene pot aparine unuia "in urmtoarele tipuri)
3"

Ti"ul 1. Colonii 4 7en+l.% 4moo!h% T nete"! lucios - mar+ini re+ulate! uneori semi-bombate - supra$a nete" - consisten cremoas suspensie omo+en Ti"ul 0. Colonii R (en+l. Rou#h% T ru+os! aspru! #brcit - mar+ini a"esea nere+ulate - supra$a ru+oas - consisten uscat suspensie (etero+en Ti"ul 3. Colonii / (cu consisten mucoi" - mar+ine uni$orm! re+ulat - colonii bombate - supra$a nete"! strlucitoare - consisten $ilant suspensie (etero+en corespun" a"esea bacteriilor capsulate =ram negative (Klebsiella, nterobacter etc b. Cul!uri n medii li hide n !uburi <ac s-a reali#at o cultur ntr-un bulion nutritiv n tuburi! "up o incubare "e 5, ore se pot evi"enia urmatoarele caractere) 1. 4urbi"itatea) - tulburare mai mult sau mai puin intens a me"iului 2. >ormarea unei pelicule) - n ca#ul bacteriilor aerobe apare la supra$aa me"iului o mas "e celule care $ormea# un voal 3. >ormare "e "epo#it) n ca#ul bacteriilor anaerobe se $ormea# un se"iment pe $un"ul tubului! mai mult sau mai puin abun"ent! colorat sau nu. 0. Cara !ere morfo oloniale ale dro;diilor - se va observa $orma i pro$ilul coloniei! "iametrul acesteia! aspectul ("e obicei
31

cremos ! supra$aa (lucioas sau mat ! culoarea (n +eneral alb-crem . 3. Cara !ere morfo oloniale ale mu e#aiurilor Vor $i "eterminate urmtoarele caractere coloniale) - "iametrul coloniei "up un timp cunoscut - culoarea coloniei i mo"i$icarea acesteia n timp - culoarea reversului coloniei - textura supra$eei coloniei) pu$oas! psloas - eventual pre#ena picturilor "e &transpiraie'pe miceliul aerian - mirosul

I. DETER/IN&RE& @ITE5EI DE CRE<TERE & CO'ONII'OR DE /UCE1&I <e#voltarea muce+aiurilor are loc "estul "e rapi" n con"iii $avorabile! ast$el c n interval "e 2 - 3 #ile pe me"iu nutritiv se $ormea# colonii vi#ibile! care cresc n "iametru. n ca#ul muce+aiurilor in$erioare caracteri#ate prin miceliu coenocitic! neseptat! coloniile se "e#volt rapi"! sunt extinse! cu ten"ina "e a ocupa tot spaiul "isponibil! avn" aspect pslos i culori alb! be%! cenuiu! brun. *uce+aiurile superioare caracteri#ate prin miceliu septat $ormea# colonii cu cretere ra"iar limitat i culori ce "i$er "e la alb la +alben! brun! ver"e! portocaliu! albastru. +rin i"iul me!odei6 Vite#a "e cretere a muce+aiurilor se poate "etermina prin cultivarea acestora n plci Petri! prin nepare central i msurarea #ilnic a "iametrului coloniei! pCn la inva"area complet a supra$eei plcii. Pentru microor+anismele cercetate ! apariia sporilor coinci"e cu colorarea #onei respective! ncepn" cu centrul coloniei. /a!eriale u!iliza!e! - plci Petri sterile6 - ans microbiolo+ic6 - me"iu "e cultur) extract "e mal - a+ar n $lacoane Erlenma8er6 - soluie aci" lactic / E! steril6 - (rtie in"icatoare "e p;6
32

- material biolo+ic -cultura n slanturi "e Pencillum, Aspergillus sau alt muce+ai - baie "e ap termostat 6 - bec "e +a#. /od de lu ru6 *e"iul "e cultur se topete pe baia "e ap! apoi se termostatea# la 5/ o2. 7e a"au+ soluia steril "e aci" lactic pn cn" p;-ul "evine 3!/! valoare la care este in(ibat "e#voltarea bacteriilor! "ar nu i a muce+aiurilor. 7e toarn 1/-23 ml me"iu "e cultur n $iecare plac Petri i se las la temperatura camerei pentru soli"i$icare. 2u vr$ul acului "e inoculare! se recoltea# o mic poriune "in cultur sporulat "in eprubeta cu cultura "e muce+ai i se nsmnea# prin nepare n partea centrala a plcii! cu mare atenie pentru a nu se r spn"i sporii pe supra$aa me"iului "e cultur. 2utia se va nc(i"e cu ban" a"e#iv i se termostatea# la temperatura camerei! msurn"u-se #ilnic "iametrul coloniei. 7e "etermin vite#a "e cretere! Vcretere! "up $ormula) Vcretere T "iametrul maxim al coloniei G nr.#ile (ore

J. E4TI/&RE& DEN4ITII +O+U'&TII'OR /ICRO.IENE

Qumrarea

microor+anismelor se execut n mo" $recvent n laboratorul "e

microbiolo+ie! n ve"erea aprecierii sta"iului "e multiplicare a celulelor "in "i$erite culturi $olosite n in"ustrie sau pentru "eterminarea +ra"ului "e contaminare a unor pro"use! n special alimentare. Pentru a asi+ura o numrare rapi" i n acelai timp precis! inn" cont c ncrctura microbian a "i$eritelor pro"use i culturi poate s $ie $oarte ri"icat! se recoman" n prima etap s se e$ectue#e "iluri ale pro"usului supus anali#ei microbiolo+ice.

TE*NIC& O.CINERII DI'UCII'OR DECI/&'E

33

<up recoltare! la omo+eni#area probelor "estinate anali#ei microbiolo+ice! se recoman" ca raportul ntre pro"us i "iluant s $ie "e 1)13! obinn"u-se ast$el prima "iluie ("iluie 13-1 . Pentru e$ectuarea urmtoarelor "iluii "ecimale! cu o pipet steril! se barbotea# lic(i"ul pentru omo+eni#are ! se recoltea# 1 ml "in "iluia I i se scur+e lic(i"ul n alt eprubet cu . ml ser $i#iolo+ic steril! obinn"u-se "iluia a II-a ("iluie 13-2 i se continu proce"eul pn la obinerea "iluiei necesare. =ra"ul "e "iluare este con"iionat "e numrul presupus "e microor+anisme "in proba "e anali#at6 cu c t numrul este mai mare! cu att se $ac mai multe "iluii. Pentru ma%oritatea pro"uselor sunt su$iciente 5 - , "iluii succesive. 2n" se $ace numrarea celulelor "intr-o anumit "iluie consi"erat corespun#toare! numrul obinut se multiplic cu coe$icientul "e "iluie &1'! pentru a obine numrul "e celule existent n pro"usul iniial (pentru " I! 1 T 13! pentru " II! 1 T 133 etc . Pentru evitarea erorilor se recoman" omo+eni#area coninutului eprubetelor n care s-a $cut "iluarea $ie prin rotirea eprubetei ntre palme! $ie! cu a%utorul pipetei sterile! prin barbotare! nainte "e recoltarea volumului "e 1 ml "estinat urmtoarei "iluii. 7e iau toate msurile "e precauie pentru a evita contaminarea cu microor+anisme "in me"iul ambiant! lucrn" n #ona "e protecie "in %urul $lcrii becului "e +a# i respectn" re+ulile "e manipulare.

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

4us"ensie iniial

16 18

1 6 188

1 6 1888

1 6 18888

<up e$ectuarea "iluiilor "ecimale! numrarea microor+anismelor se poate reali#a prin meto"e "irecte! cu a%utorul camerelor "e numrare sau prin meto"e in"irecte.

34

J.1. E4TI/&RE& DEN4ITII +O+U'&CII'OR /ICRO.IENE CU &?UTORU' C&/EREI T*O/&

Estimarea "ensitii populaiilor microbiene cu a%utorul camerei 4(oma este o meto" "irect "e numrare a celulelor! rapi" i uor "e e$ectuat! cu utili#ri n stabilirea "inamicii "e acumulare a celulelor microbiene ntr-un me"iu "e cultur! n scopul urmririi $ormrii "e biomas! "e obinere a unui inocul sau n "i$eritele procese $ermentative. *eto"a pre#int "e#avanta%ul c nu "eosebete celulele vii "e cele moarte! este +reu "e aplicat pentru bacterii "e "imensiuni mici! necesit suspensii celulare "estul "e "ese i nu este $oarte exact. +rin i"iul me!odei6 2amerele "e numrat repre#int lame "e sticl prev#ute cu trei plat$orme! "in care plat$orma central este "enivelat $a "e celelalte "ou cu 3!13 mm. 2amera 4(oma pre#int o reea cu supra$aa "e 1 mm2! "ivi#at n 533 microcelule elementare! numrtoarea $cn"u-se n +rupuri "e 16 microcelule.

lamela 1G13 mm lama Thoma

1G23 mm

1G23 mm

35

/a!eriale u!iliza!e6 - suspensii "e celule "e "ro%"ie i spori "e mucea+i n ap6 - lamele6 - camera 4(oma6 - pipete sterile. - microscop.

/od de lu ru6 7e execut un preparat ume"! plasn" suspensia "e celule pe supra$aa reelei. 7e aea# lamela! care! spri%inin"u-se pe cele "ou plat$orme laterale! va "elimita nlimea stratului "e lic(i"! e+al cu a"ncimea camerei (3!1 mm . Preparatul ast$el ob inut se $ixea# cu cleme "e platina microscopului i se caut ima+inea reelei. In cmpul microscopic ! prin "eplasarea platinei se pot a"uce +rupe "e cte 16 microcelule elementare i se $ace numrarea celulelor "e "ro%"ii. 7e exclu" "e la numrare celulele care se a$l cu mai mult "e %umtate "in supra$aa celulei n exteriorul careului "e 5 x 5. 7e $ac numrri "in mai multe cmpuri microscopice (minimum / i se calculea# numrul me"iu "e celule "intr-o microcelul. 2unoscn" supra$aa unei microcelule i volumul su ( " =
1 1 mm3 ! n $uncie "e 533 13

"iluia $olosit la numrare! se poate calcula numrul "e celule pre#ente ntr-un cm3 lic(i" "e anali#at! cu $ormula)

36

Q T n x 5333 x 1333 x 1 Bn care) n T numrul me"iu "e celule pe microcelul6 5333 T volumul microcelulei! n cm36 1333 T $actor "e trans$ormare n cm36 1 T coe$icientul "e "iluie.

J.0. E4TI/&RE& NU/RU'UI DE CE'U'E /ICRO.IENE +RIN /ETOD& CU'TUR&' +rin i"iul me!odei6 *eto"a cultural Hoc( const n nsmnarea unui volum cunoscut "in suspensia "e celule n G sau pe me"ii "e cultur soli"i$icate n plci Petri i! "up o perioa" "e incubare! se $ace numratoarea coloniilor consi"ern" c $iecare colonie este re#ultat prin multiplicarea unei sin+ure celule. *eto"a cultivrii n plci este $oarte a"esea $olosit pentru "eterminarea numrului "e microor+anisme vii "intr-un pro"us i permite! n acelai timp! o anali# calitativ prin stu"iul caracterelor mor$olo+ice ale coloniilor "e#voltate. <e obicei se utili#ea# "iluiile "ecimale ale pro"usului "e anali#at. @e#ultatul se exprima in 9>2 (uniti $ormatoare "e colonii ! "eoarece pot exista mai multe celule a+lomerate care $ormea# o colonie! iar n ca#ul muce+aiurilor exist $ra+mente multicelulare "e (i$e6 n plus! exist "estule celule i#olate care nu $ormea# colonii. 7e vor ale+e plcile care conin ntre 33 i 333 colonii.

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

37

1 /a!eriale u!iliza!e6

13 -1

13-2

13-3

- me"iu "e cultur) a+ar nutritiv sterili#at n $lacoane Erlenma8er "e /33 ml6 - plci Petri sterile6 - pipete sterile6 - eprubete cu cte . ml ap steril6 - probe "e ap "in "i$erite surse6 - baie "e ap la 5/ o26 - termostat la 37 o26 - "ispo#itiv "e numrat colonii. /od de lu ru6 *e"iul "e cultur coninut n balonul Erlenma8er se pune la topit pe baie "e ap. <up $lui"i$icarea complet! se termostatea#a! tot pe baie "e ap la 5/ o2. >olosin" pipeta steril! se pre+tesc cte 3 "iluii "in probele "e ap i apoi se recoltea# cte 1 cm3 "in aceste "iluii I! prin "es$acerea plcii Petri sterile! se las s treac numai pipeta i se scur+e coninutul. Peste volumul "e suspensie se toarn me"iul "e cultur steril la 52-5/ o2 i! ime"iat! prin rotirea n plan ori#ontal a plcii! se $ace omo+eni#area cu me"iul i se las n repaos pentru soli"i$icarea me"iului i $ixarea celulelor. 7e recoman" ca "in aceeai "iluie s se $ac nsmnari n cte "ou plci paralele. Plcile cu me"iile nsmnate se intro"uc n termostat! re+lat la temperatura "e 37
o

2! pentru "e#voltarea microor+anismelor. Qumrarea coloniilor se va $ace "up 72 ore.

Pentru numrare se ale+ plcile n care numrul "e colonii este cuprins ntre 33 - 333! acolo un"e este posibil. n ca#ul n care coloniile sunt "ese! pentru a nlesni numrtoarea! placa Petri se inversea# i se aea# pe numrtorul "e colonii 4I4@IPL-U9E. La meto"a culturii! toate operaiunile se execut cu mult atenie evitn"u-se orice surs "e in$ectare cu microor+anisme str ine! care! a%un+n" n plac ar in$luena re#ultatul
3

anali#ei. Qumrul "e uniti $ormatoare "e colonii este "at "e $ormula) U-CBml K Nr. olonii : oefi ien!ul de diluie

J.3. DETER/IN&RE& NU/RU'UI DE /ICROOR1&NI4/E N /EDII 'IC*IDE

-ceast meto" se ba#ea# pe e$ectuarea "e "iluii cu care este nsmnat me"iul "e cultur lic(i". <iluiile se e$ectuea# "in 13 n 13! pornin" "e la suspensia iniial pentru care se "etermin numrul "e +ermeni. *e"iul "e cultur ales convenabil este reparti#at steril cte . ml n $iecare tub. 7erii "e 3 sau / tuburi vor $i nsmnate cu cte 1 mililitru "in suspensia iniial! apoi "in "iluiile "ecimale n or"ine "escresctoare a "ensitii celulelor ($iecare nou serie antrenea# un nou $actor 13 "e "iluie . <up incubare se proce"ea# la citirea re#ultatelor! consi"ern"u-se po#itive tuburile n care este vi#ibil creterea (sau este vi#ibil o activitate biolo+ic) vira%ul unui in"icator "e p;! "e+a%are "e +a# sau altele i ne+ative celelalte. Pentru $iecare serie "e culturi provenite "in aceea i "iluie! se numr tuburile po#itive! care pot $i) 1. - 3! 1 sau 2 pentru 2 tuburi6 2. - 3! 1! 2 sau 3 pentru 3 tuburi6 3. - 3! 1! 2! 3! 5 sau / pentru / tuburi.

7e compune ast$el un numr caracteristic! $ormat "in ci$rele corespun#toare pentru trei "iluii succesive (pentru ca#ul 2 ! prima "iluie utili#at $iin" cea mai concentrat . Qumrul este alctuit "in trei ci$re i anume) prima ci$r repre#int numrul "e eprubete "in ultima "iluie n care s-a observat creterea n toate eprubetele nsmntate! urmtoarele "ou ci$re repre#int numrul "e eprubete po#itive "in urmtoarele "ou "iluii succesive. Interpretarea acestui test se ba#ea# pe "ate statistice. 4abelele elaborate "au pentru $iecare numr caracteristic! numrul "e celule cel mai probabil "intr-un mililitru "in
3!

tubul corespun#tor primei ci$re "in numrul caracteristic. Qumrul "e microor+anisme "intr-un +ram sau mililitru "in pro"usul iniial se calculea# nmulin" numrul "in tabel (corespun#tor ci$rei caracteristice cu coe$icientul "e "iluie corespun#tor primei ci$re "in caracteristic. 2oncentraia iniial se calculea# inn" cont "e "iluiile e$ectuate. <e exemplu! pentru numrul caracteristic 213 (care nseamn 2 tuburi po#itive pentru cea mai mare "ensitate "e celule! un tub po#itiv pentru cea me"ie i toate tuburile ne+ative pentru "ensitatea cea mai mic ! n tabel corespun"e numrul cel mai probabil "e celule 1!/ G ml! care se va nmuli cu coe$icientul "e "iluie. <ac! "e exemplu! "iluia a $ost 13-2! au $ost iniial 1/3 celule G ml. n tabelul urmtor (numit tabelul lui *ac =ra"8 se pre#int relaia ntre numrul caracteristic corespun#tor pentru trei tuburi nsmnate i numrul cel mai probabil "e celule)

4"

Numr ara !er is!i 888 881 818 811 808 188 181 180 118 111 108 101 138 088

Numr de elule

Numr ara !er is!i

Numr de elule

Numr ara !er is!i

Numr de elule

8,8 8,3 8,3 8,D 8,D 8,= 8,H 1,1 8,H 1,1 1,1 1,A 1,D 8,J

081 080 018 011 010 008 001 000 003 038 031 030 388 381

1,= 0,8 1,A 0,8 3,8 0,8 3,8 3,A =,8 3,8 3,A =,8 0,A =,8

380 318 311 310 313 308 301 300 303 338 331 330 333

D,A =,A H,A 11,A 1D,8 J,A 1A,8 08,8 38,8 0A,8 =A,8 118,8 1=8,8

DETER/IN&RE& .&CTERII'OR CO'I-OR/E DINTR2UN +RODU4 &'I/ENT&R Pentru a re$lecta calitatea microbiolo+ic a pro"uselor alimentare n timpul $abricaiei! n timpul conservrii! ct i pentru a asi+ura protec ia $a "e microor+anismele pato+ene
41

transmisibile prin alimente! se e$ectuea# anali#e microbiolo+ice n scopul "e a +aranta si+urana i+ienei pentru consum. :acteriile coli$orme $ac parte "in cate+oria microor+anismelor indi a!ori i#ieni o2 sani!ari! $iin" bacterii =ram ne+ative nesporulate! aerobe sau $acultativ anaerobe! ce pot s se nmuleasc n pre#ena srurilor biliare! capabile "e a $ermenta lacto#a cu pro"ucere "e +a#e. +rin i"iul me!odei6 *eto"a pentru "eterminarea bacteriilor coli$orme inclu"e teste

pre#umptive i "e con$irmare! ba#ate pe capacitatea bacteriilor coli$orme "e a $ermenta lacto#a cu pro"ucere "e aci" lactic! 2?2 i ;2! n timp "e 5, ore la 3732. 4estul pre#umptiv const n inocularea probei n me"iul nutritiv "e mbo+ire cu lacto#! $avorabil att coli$ormilor ct i altor bacterii capabile s $oloseasc lacto#a "rept surs "e carbon. -precierea probelor po#itive se $ace $ie n $uncie "e acumularea "e +a#e n tubul <ur(am (plutitor ! $ie ca urmare a mo"i$icrii p;-ului "atorit acumulrii "e aci#i. 4estul "e con$irmare const "in inocularea culturilor "in eprubetele po#itive ale testului pre#umptiv! pe me"ii selective care in(ib "e#voltarea bacteriilor nsoitoare i evi"enia# bacteriile coli$orme. /a!eriale u!iliza!e6 - proba "e anali#at (ap! carne tocat ! pro"use lactate etc - eprubete n care a $ost intro"us tubul <ur(am - bec "e +a# - termostat - stativ pentru eprubete - me"iul pentru testul pre#umptiv) bulion lacto#at - pepton III..13+ - Qa2lIIIII../+ - extract "e carneI.3+ - lacto# IIII../+ - ap "ist. III.1333ml sau me"iu *ac 2on1e8 (con$orm cataloa+elor "e me"ii "e cultur - me"iu pentru testul "e con$irmare - bulion bil lacto# ver"e briliant (:L:V sau
42

- bulion E.2. (con$orm cataloa+elor

/od de lu ru6 *e"iile lic(i"e "e cultur se intro"uc n eprubetele ce conin tuburile <ur(am rsturnate! ast$el nct s nu rmn aer n acestea! n volum "e aproximativ 13 ml! n $uncie "e +rosimea eprubetei. 7e sterili#ea# prin autoclavare! "up in"icaiile "e pe $laconul cu me"iu "es(i"ratat. <in proba "e anali#at i "in "iluii "ecimale succesive se inoculea# cte 1 ml n cte 3 eprubete cu me"iu pentru testul pre#umptiv (ce con in tuburile <ur(am inversate i se incubea# 25 - 5, ore la 3732! "up care se citesc re#ultatele! con$orm tabelului "e mai sus. 7e consi"er po#itive eprubetele n care se nre+istrea# tulburarea me"iului "e cultur ! acumulare "e +a# n plutitor in"icatorului "e p;. Pentru testul "e con$irmare! "in eprubetele po#itive se recoltea# cte o ans ($ir cu bucl i se $ace inocularea n me"iul pentru con$irmare. 7e termostatea# 5, ore la 3732! se citesc re#ultatele. <up nmulirea numrului citit n tabel cu $actorul "e "iluie! se obine numrul cel mai probabil "e coli$ormi G+ sau ml prob "e anali#at (/+N T most probable number . (mai mult "e 1G3 "in volum i! un"e este ca#ul! virarea

18. /ETODE DE I5O'&RE <I O.TINERE & CU'TURI'OR +URE

2ultura pur repre#int o mas "e celule re#ultate prin repro"ucere "intr-o sin+ur celul a$lat ntr-un me"iu nutritiv steril. 2ultura pur este consi"erat i colonia care se $ormea# ca re#ultat al i#olrii unei celule sau a unei uniti $ormatoare "e colonie! atunci cn" aceasta este locali#at pe un me"iu nutritiv soli".
43

n practica "e laborator se cunosc numeroase meto"e prin care se poate reali#a separarea unei sin+ure celule "in microbiota (etero+en a me"iilor naturale. -ceste te(nici permit i#olarea unui +ermen "at plecn" "e la me"ii complexe! separarea unor +ermeni "i$erii "intr-un amestec! puri$icarea unei sue contaminate! precum i e$ectuarea stu"iului calitativ i cantitativ al $lorei unui pro"us! ("e exemplu un pro"us alimentar . 7copul $inal este obinerea "e tulpini pure care pot $i ast$el i"enti$icate! stu"iate i eventual numrate. &./e!ode "rin rs"ndire - se $olosesc pe scar lar+! $iin" uor "e executat! avn" ca principiu rspan"irea celulelor "in me"iile naturale un"e acestea se a$l n numr mare. /e!ode s arifi a!e sau n s!rii n placa Petri se reparti#ea# un me"iu "e cultur soli"i$icat i! cu $irul metalic se recoltea# celule "in me"iul natural i se execut trasri pe supra$ata me"iului! ast$el nct "iversele celule s rmn "istanate ntre ele. Prin termostatare 5, - 72 ore! "in colonia care corespun"e microor+anismului ce trebuie i#olat! se execut o repicare n eprubete cu me"iu soli" Bnclinat (eprubete cu slant - a+ar i ast$el se obine o cultur pur. ? te(nic similar $olosete "rept supra$a "e rspn"ire me"iul nclinat "in 2 -3 eprubete! prin trans$erul "e celule "in me"iul natural! prin reali#area "e striuri! n mo" succesiv. -ceste "ou meto"e se $olosesc i n ca#ul n care o cultur pur este contaminat cu microor+anisme strine n perioa"a "e pstrare i trebuie salvat. .. /e!ode "rin diluare n ca#ul acestor meto"e! n prima etap! "in me"iul natural se execut "iluii "ecimale n ser $i#iolo+ic steril! ast$el nct numrul "e celule s $ie relativ re"us! permin" obinerea "e colonii i#olate pe supra$aa me"iului "e cultur. ? meto" simpli$icat pentru separarea sporilor $un+ici const n inun"area supra$eei plcii Petri "in "iluia convenabil. 7porii care au rmas ataai "e me"iu vor "a colonii i#olate. n +eneral! muce+aiurile nu ri"ic probleme la i#olare! "eoarece cresc sub $orm "e colonii mari pe "i$erite substraturi! iar pentru obinerea n cultur pur se $ace repicarea "e spori situai n centrul coloniei. /e!oda de izolare u a;u!orul mi romani"ula!orului - este o meto" precis i se reali#ea# cu a%utorul unui aparat prev#ut cu tuburi capilare cu care se poate $ace selecia celulelor "orite "in preparate stu"iate la microscop. 2u a%utorul micromanipulatorului se poate
44

$ace recoltarea "e ascospori "in celule asco+ene i este $olosit n cercetarea +enetic! n "iri%area proceselor "e $u#iune a protoplatilor! pentru con%u+are .a. /e!ode biolo#i e de ob inere a ul!urilor "ure - sunt $oarte "iverse i se ba#ea# pe proprietile $i#iolo+ice ale microor+anismelor "e i#olat care permit "i$erenierea clar a acestora "e restul microor+anismelor nsoitoare "in acelai biotop. Prin meto"e biolo+ice pot $i selectate bacteriile sporo+ene "in me"ii naturale! pe ba#a termore#istenei "eosebite a en"osporilor. Qumeroase meto"e "e i#olare se ba#ea# pe intro"ucerea n me"iile "e cultur a unor substane c(imice cu rol "e in(ibitor asupra microor+anismelor "e care trebuie separat cultura "orit. 18.1. I5O'&RE& /ICROOR1&NI4/E'OR DIN 4O' DE 1RDIN +rin i"iul me!odei6 cn" o celula microbian a%un+e pe un me"iu $avorabil "e cultur! aceasta se multiplic $ormCn" o colonie) "in coloniile su$icient "e separate i "istanate se pot i#ola culturi pure. /a!eriale u!iliza!e) - plci Petri - pipete sterile - probe "e sol "e +r"in ' tuburi cu ser fi(iolo)ic steril sau a% steril - penicilin - $ir "e inoculare - termostat - bec "e +a# - baie "e ap - me"iu "e cultur - a+ar nutritiv /od de lu ru6 @eparti#area me"iului "e cultur n plcile Petri) - se lic(e$ia# coninutul unui $lacon cu me"iu +elo#at ntr-o baie "e ap la $ierbere! se rcete la 5732 232! apoi se toarn coninutul n plcile Petri .sterile inn" seama "e
45

urmtoarele precauii) se ter+e cu +ri% $laconul la scoaterea "in baia "e ap se n"epartea# "opul n #ona steril a $lcrii i se $lambea# +tul vasului pentru "istru+erea microor+anismelor n timpul ct se toarn me"iul! se "esc(i" plcile Petri n ime"iata apropiere a $lcrii6 nu se atin+e placa cu $laconul "up intro"ucerea me"iului! placa Petri se nc(i"e rapi" se reparti#ea# +elo#a prin a+itare uoar! "ac este ca#ul se las plcile pe o supra$a plan pentru soli"i$icarea me"iului "ac se lucrea# cu mai multe plci! este avanta%os s se ae#e acestea unele peste altele! evitn"u-se rcirea brusc i "eci $ormarea n cantitate prea mare a con"ensului. &. Tehni a s!riurilor I#olrile se e$ectuea# n plci Petri! prin trasarea "e striuri n una "in urmtoarele $orme)

46

"

Pentru nsmnarea plcilor se va utili#a o "iluie "in sol "e +r"in. .. Tehni a diluiilor <in proba "e cercetat se e$ectuea# "iluii n ap steril sau ser $i#iolo+ic! n tuburi ce conin cte . ml. Prima "iluie se e$ectuea# prin pipetarea unui mililitru "e prob (sau prin cntrirea unui +ram n primul tub - aceasta repre#int "iluia 1 G 13 6 "iluia a "oua repre#entn" 1 G 133 se e$ectuea# prin pipetarea i amestecarea a 1 ml "in "iluia 1 G13 n alt tub cu . ml ser $i#iolo+ic i aa mai "eparte. <in $iecare "iluie e$ectuat se pipetea# cte 2 ml pe supra$aa me"iului reparti#at n plcile Petri! ncepn" cu cea mai mare "iluie. 7e incubea# plcile la 3732 timp "e 5, "e ore! "up care se examinea# i se i#olea# colonia care interesea#! cu vr$ul $irului metalic.

18.0. I5O'&RE& 1ER/ENI'OR DIN &ER 7e "esc(i" total plcile coninn" me"iul "e cultur soli"i$icat! timp "e cteva minute! a+itn"u-se lent i expunn"u-le n curent "e aer. 4impul "e expunere a plcilor poate varia pentru cteva plci. 7e termostatea# timp "e 5, ore sau mai mult i se examinea# coloniile aprute. 18.3. I5O'&RE& 1ER/ENI'OR RE5I4TENCI '& &NTI.IOTICE *e"iul "e cultur se va suplimenta cu cte o pictur pentru $iecare plac, "intr-o soluie obinut "intr-un antibiotic cumprat "in comer ("e ex. penicilin ! "up care se nsmnea# $ie prin inun"are! $ie prin ncorporarea probei n +elo#. 18.=. I5O'&RE& .&CTERII'OR 4+ORU'&TE &ERO.E <iluia "in proba "e sol va $i ncl#it timp "e 2 minute pe baie "e ap la $ierbere ($ierberea "istru+e $ormele nesporulate ! "up care se inoculea# me"iul "e cultur.
47

Pentru toate ca#urile se vor recunoa te coloniile "e bacterii! "ro%"ii sau muce+aiuri. 7e va nota aspectul coloniilor (rotun"e sau nere+ulate! bombate sau plate! nete"e sau nu! strlucitoare sau mate! colorate sau nu! transparente sau nu . 2ele mai repre#entative colonii se vor examina la microscop! "eterminn"u-se tipul microor+anismului! $orma! aparatul repro"uctor n ca#ul muce+aiurilor.

11. /ETODE DE CONSERVARE & /ICROOR1&NI4/E'OR

*icroor+anismele a$late n stu"iu ct i cele care pre#int unele proprieti remarcabile trebuie pstrate n colecii "e culturi! "enumite micoteci. <intre te(nicile aplicate pentru conservarea culturilor pure! te(nici ba#ate pe prelun+irea $a#ei staionare i evitarea etapei "e "eclin!cele mai importante sunt urmtoarele) Re"i area "eriodi "rin !ransfer de elule "in eprubeta coninn" cultura pur! n care me"iul este epui#at! n eprubeta cu me"iu nutritiv steril! proaspt! cu compo#iie similar. Intervalul "e repicare este "epen"ent "e natura culturii! compo#iia me"iului i temperatura "e pstrare. -cest proce"eu necesit un mare volum "e munc! pre#int risc "e contaminare i este +reu "e reali#at atunci cn" numrul "e culturi "e ntreinut este mare.
4

Prelun+irea intervalului ntre "ou repicri prin sc"erea vite#ei "e metabolism a celulelor i "eci evitarea strii "e "eclin ce poate "uce la autosterili#are! se poate reali#a prin mai multe proce"ee) /eninerea ul!urilor la !em"era!uri s zu!e! n con"iii "e re$ri+erare sau

con+elare. n acest ca#! "e exemplu! culturile "e $un+i p strate la /32 se trans$er anual! n timp ce "ac pstrarea se $ace la 1632! repicarea va avea loc la un interval "e 6 luni. Desi area poate $i reali#at n laborator la o %om% "e vi"! culturile $iin" plasate n $iole speciale! care sunt apoi nc(ise la $lacr. *eto"a "esicrii are la ba# re"ucerea umi"itii me"iului! care con"uce la trecerea celulelor n starea "e anabio#! ce poate $i meninut timp n"elun+at $r a se pro"uce mo"i$icri intracelulare! ireversibile. 'iofilizarea const ntr-o con+elare urmat "e o sublimare. Prin acest proce"eu se prelun+ete consi"erabil intervalul "e conservare a culturilor! $r s se pro"uc mo"i$icri ale proprietilor lor $i#iolo+ice. Lio$ili#area se reali#ea# n aparate speciale numite lio$ili#atoare! culturile $iin" suspensionate n lic(i"e protectoare ("e obicei un coloi" (i"ro$il cum este laptele! +licerol 13E! )elatin! ser etc i intro"use n $iole speciale.

11.1. RE@IT&'I5&RE& +RE+&R&TE'OR DE4IC&TE 4&U 'IO-I'I5&TE /a!eriale u!iliza!e6 - culturi "esicate sau lio$ili#ate - ansa cu bucl - pipete sterile - bec "e +a# - "opuri sterile pentru $iolele cu culturile "esicate sau lio$ili#ate - lic(i" "e revi$iere) - extract "e "ro%"ieII./+ - +luco# IIIII../+ - ap "istilat III.1333ml - me"iu "e cultur n eprubete /od de lu ru6 7e ncl#ete +Ctul $iolei ce conine cultura "esicat sau lio$ili#at, la vr$ul
4!

$lcrii "e +a#. 2u o pipet steril se las s ca" cteva picturi "e ap steril rece pe +tul ncins al $iolei! care se va cr pa6 vr$ul se "esprin"e uor cu o bucat "e vat steril! se mai ar"e o "at mar+inea $iolei n $lacr! "up care se intro"uce "opul inut n mna "reapt. 2u o alt pipet steril se ia un mic volum "in lic(i"ul "e revi$iere sau ap steril i se pipetea# uor peste coninutul $iolei. 7e a+it cu +ri% i se las n repaos %umtate "e or la temperatura camerei sau n termostat. <up acest interval! n #ona steril a $lcrii se "esc(i"e "opul $iolei! se ar"e +tul acesteia n $lacr i se recoltea# "in cultura lio$ili#at un mic volum! cu a%utorul ansei. 7e nsmnea# me"iul "e cultur "in eprubet i se incubea# la temperatura optim "e cretere. <up "e#voltarea microor+anismului! se observ aspectul culturii i eventualele mo"i$icri mor$olo+ice.

10. IN-'UENC& -&CTORI'OR DE /EDIU &4U+R& CRE<TERII /ICROOR1&NI4/E'OR

-vn" o mas re"us! celula microbian este puternic in$luenat "e con"iiile me"iului ambiant i reacionea# $oarte rapi" la "i$erii $actori! cum sunt) temperatura! umi"itatea relativ! concentraia "e oxi+en! com%o(iia c*imic, concentraia substratului i %+'ul mediului de cultur, radia iile etc! $ie prin a"aptare! $ie prin "ispariie. Influena !em"era!urii asu"ra re!erii mi roor#anismelor 4emperatura are o mare in$luen asupra proceselor $i#iolo+ice ale celulei "eoarece stimulea# sau in(ib activitatea ec(ipamentului lor en#imatic. <i$eritele specii microbiene se caracteri#ea# prin anumite temperaturi numite ardinale) - temperatura minim (temperatura la care mai poate avea loc cre terea! iar sub aceasta valoare creterea este oprit 6 temperatura o"!im (temperatura la care vite#a speci$ic "e cretere este maxim
5"

i temperatura ma:im (la care creterea este nc posibil! "ar prin "epirea acesteia e$ectul "evine letal .

10.1. IN-'UENC& TE/+ER&TURII DE CU'TI@&RE &4U+R& @ITE5EI DE CRE<TERE & /UCE1&IURI'OR +rin i"iul me!odei6 n $uncie "e temperatura "e cultivare! pe acelai me"iu "e cultur! muce+aiurile pre#int vite#e "i$erite "e cretere! "eci "iametrele coloniilor vor avea mrimi "i$erite. /a!eriale u!iliza!e6 - cultura "e muce+ai (Monascus purpureus - plci Petri - ac "e inoculare - bec "e +a# - termostate la "i$erite temperaturi - autoclav - me"iul "e cultur - extract "e carto$ - "extro# - a+ar /od de lu ru6 *e"iul "e cultur reparti#at n $lacoane Erlenme8er se sterili#ea# prin autoclavare la 121o2! timp "e 23 minute! apoi se toarn cte 1/ - 23 ml n plci Petri sterile i se las la temperatura camerei s se soli"i$ice. 7eturi "e cte trei plci se nsmnea# prin nepare central "in cultura "e Monascus! avn" +ri% s nu se mprtie sporii "e pe $irul acului "e inoculare pe supra$aa me"iului. <in cele nou plci ast$el nsmnate! trei vor $i incubate la temperatura "e 53o2! trei la 33o2 i trei la $ri+i"er! la 5-/o2. <up o sptmn "e "e#voltare a tulpinii $un+ice! se vor msura "iametrele coloniilor pentru cele trei temperaturi! $cn"u-se me"ia aritmetic a celor trei valori i se va "etermina vite#a orar "e cretere.

10.0. DETER/IN&RE& .&CTERII'OR +4I*RO-I'E +rin i"iul me!odei6 *eto"a se ba#ea# pe cultivarea bacteriilor pe me"iu nutritiv i incubarea plcilor la temperatura "e 1332! timp "e 7 #ile! con"iii care $avori#ea# "e#voltarea bacteriilor psi(ro$ile.
51

/a!eriale u!iliza!e6 - proba "e anali#at - plci Petri - pipete +ra"ate sterile - bec "e +a# - termostat - me"iu "e cultur) a+ar nutritiv /od de lu ru6 7e $ace omo+eni#area probei "e anali#at i se e$ectuea# "iluiile "ecimale. <in "iluii se recoltea# aseptic cte 1 ml care se intro"uce n "ou plci Petri (probe "uble i "easupra se reparti#ea# me"iul nutritiv sterili#at i rcit la 5/32! $cn"u-se o uni$ormi#are rapi". <up soli"i$icarea me"iului "e cultur n plcile Petri! acestea se menin inversate n $ri+i"er i "up 7 #ile se $ace anali#a calitativ i cantitativ a culturilor. 7e calculea# numrul "e celule "in plcile ce conin ntre 33 i 333 colonii i! n $uncie "e "iluia $olosit! se calculea# numrul "e bacterii psi(ro$ile "intr-un +ram sau "intr-un mililitru "e prob. 13. E4TI/&RE& CRE<TERII /ICRO.IENE N CU'TUR DISCONTINU

n condiii fa,orabile de ,ia, n %re(ena mediului nutriti,, microor)anismele reacionea( ra%id - are loc creterea, %roces %rin care are loc mrirea coordonat a tuturor com%onentelor celulei, re(ultat %rin adu)area de substan nou format %rin biosinte(. /ac microor)amismul este coenocitic, creterea nseamn de(,oltarea celulei unice, dar nu - s%orirea numrului de celule. n ca(ul microor)anismelor care se re%roduc %rin nmu)urire sau %rin sci(iune binar, de(,oltarea conduce la mrirea numrului de celule. 2reterea microbian este stu"iat prin anali#area curbei "e cretere a culturii (n me"ii lic(i"e ! n sistem "iscontinuu! Bn ar%e - &batc(' (Bn timpul incubrii nu se intro"uce me"iu proaspt i nu se extra+ %rodui i din aceast cau# concentraia substratului sca"e! iar cea a pro"uilor "e metabolism crete . 2reterea microor+anismelor care se repro"uc prin sci#iune binar poate $i repre#entat +ra$ic prin lo+aritmul numrului "e celule n $uncie "e timp.
52

Tim"ul de #eneraie 79 T "urata unui ciclu "e cretere sau timpul necesar pentru ca populaia s se "uble#e. @i!eza s"e ifi de re!ere 79 T numrul "e +eneraii n unitatea "e timp.

K!Bn

KnB!

un"e n T numrul "e +eneraii

2urba "e cretere va avea ase $a#e) 1. $a#a "e la+ sau $a#a "e laten n care T 3 2. $a#a "e accelerare a creterii n care vite#a speci$ic "e cretere este cresctoare 3. $a#a exponenial "e cretere ( este constant i maxim 4. $a#a "e ncetinire a creterii ( este "escresctor 5. $a#a staionar ( T 3 6. $a#a "e "eclin

l+ Q

D timp

53

/a!eriale u!iliza!e6 - cultura "e Saccharomyces cerevisiae # camera 4(oma - lamele - bec "e +a# - termostat - me"iu "e cultur - must "e mal sau melas - eprubete cu ap - ap "istilat - pipete +ra"ate sterile - eprubete /od de lu ru6 *e"iul "e cultur (233 ml G $lacon Erlenme8er i eprubetele coninn" aproximativ 13 ml ap se sterili#ea# n autoclav! timp "e 23 minute la 121 32. 2ultura "e "ro%"ie "in eprubet! pe me"iu soli"i$icat (extract "e mal - a+ar este suspensionat n ap steril ! "in care se inoculea# 1 ml n me"iul "in $laconul Erlenme8er! cu a%utorul pipetei +ra"ate! n #ona "e protec ie a becului "e +a#. 2ultura se incubea# la 3332! recoltn"u-se probe! n mo" aseptic! cu a%utorul pipetelor sterile (cate 2 ml ! la intervale "e c te 3 ore (sau la intervalul posibil . @ecoltarea probelor se va $ace numai "up omo+eni#area culturii prin a+itare n scopul obinerii unei suspensii ct mai uni$orme "e celule. Probele se examinea# la microscop! "eterminn"u-se numrul "e celule "irect "in prob sau "in "iluia "ecimal! "ac este ca#ul. -nali#a probelor va $i e$ectuat ! pe ct posibil! ime"iat "up recoltare! evitn"u-se pstrarea probelor pentru numrarea ulterioar. 2oncomitent cu "eterminarea numrului "e celule! se va nota i valoarea p;. 7e va trasa curba "e cretere corespun#atoare numrului "e celule "e "ro%"ie "intr-un mililitru "e cultur (inn"u-se seama "e "iluia e$ectuat ! n $uncie "e timp! completn"use urmtorul tabel)

Dura!a de dezvol!are 7ore9 Diluia

54

"robei Numr de eluleB ml "*

Pe parcursul experimentului se vor nota eventualele observaii ("ebutul $ermentatiei! aspectul culturii! apariia unei eventuale in$ecii etc .

1=. /ET&.O'I4/U' /ICRO.I&N

1=.1. E@IDENCIERE& /ET&.O'I4/U'UI 1'UCIDIC &' /ICROO1&NI4/E'OR =luci"ele (mono#a(ari"e! "i#a(ari"e! poli#a(ari"e pot $i "e+ra"ate "e bacterii urmn" una "in cele "ou ci principale) oxi"area (n aerobio# sau $ermentaia (n anaerobio# . +rin i"iul me!odei6 *eto"a se ba#ea# pe virarea culorii unui in"icator "e p; "atorit metaboli#rii #a(rului "e ctre tulpina bacterian. /a!eriale u!iliza!e6 - cultura bacterian - eprubete cu "op "e vat - ac "e inoculare - bec "e +a# - baie "e ap la $ierbere - para$in steril
55

- me"iul "e cultur) (se va utili#a me"iul ;u+( - Lei$son - peptonIIIIIII..2+ - extract "e "ro%"ieIIII1+ - Qa2lIIIIIIIII/+ - H2;P?5IIIIIII..3!2+ - albastru "e bromtimolII.3!3,+ - a+ar-a+arIIIIIII.2!/+ - #a(rul a"u+atIIII..13 - ap "istilatIIIII.1333ml - termostat - autoclav /od de lu ru6 *e"iul "e cultur reparti#at cte 13 ml n eprubete! se sterili#ea# separat "e #a(rul ce trebuie testat! la 121o2 timp "e 23 minute. <ac me"iul a $ost preparat mai nainte! se re+enerea# prin topire ntr-o baie "e ap la $ierbere! se a"au+ #a(rul ce trebuie testat! "up care se soli"i$ic. 7e inoculea# tuburile prin nepare n pro$un#ime! pCn la ba#a me"iului "in cultura "e stu"iat. Pentru $iecare #a(r se vor reali#a cte "ou tuburi! "in care unul se va acoperi cu un strat "e ulei "e para$in steril (/ mm nlime . 4uburile se vor incuba la 33 sau 37o2 timp "e 5, ore sau mai mult! "up care se va observa mo"i$icarea culorii me"iului "e cultur (care a avut iniial culoarea ver"e ! existn" urmtoarele posibiliti6 &. 2uloare +alben n ambele tuburi (cu sau $r ulei ) $ermentarea #a(rului .. 2uloare +alben (n supra$a n tubul $r ulei) oxi"area #a(rului >ermentarea unui #a(r poate $i nsoit "e o "e+a%are "e +a#. C. 2uloare ver"e n ambele tuburi (cu sau $r ulei ) #a(rul nu a $ost metaboli#at D. 2uloare albastr n tubul $r ulei i ver"e n tubul cu ulei) alcalini#are "atorat utili#rii peptonei

56

/ICROOR1&NI4/E +RODUCTO&RE DE EN5I/E *IDRO'ITICE

1=.0. E@IDENCIERE& /ICROOR1&NI4/E'OR +RODUCTO&RE DE EN5I/E &/I'O'ITICE

Principalele en#ime microbiene care (i"roli#ea# ami"onul sunt -amila#a! -amila#a i +lucoamila#a! en#ime extracelulare pro"use "e bacterii! muce+aiuri i "e "ro%"ii. :acteriile "in +enul Bacillus ( B. subtillis, B. licheni$ormis, B. macerans, B. stearothermophillus sunt pro"uctoare "e amila#e active la /3-63o2! termostabile i $olosite pentru obinerea amila#elor in"ustriale. -lte specii "e Bacillus cum sunt) B. cereus, B. megaterium, B. polymi%a sunt pro"uctoare "e -amila#! en#im #a(aro+en! care prin (i"roli#a le+turilor +luco#i"ice eliberea# molecule "e malto#. *uce+aiurile pro"uc mai ales -amila#a i +lucoamila#a (Aspergillus, Mucor i &hi'opus ! "eosebin"u-se prin raportul ntre aceste "ou en#ime sinteti#ate. <intre "ro%"ii! cei mai importani "in acest punct "e ve"ere sunt repre#entanii +enurilor Saccharomycopsis! (ricosporon, Candida. +rin i"iul me!odei6 evi"enierea en#imelor amilolitice pro"use "e ctre coloniile microbiene poate $i e$ectuat utili#n" un me"iu "e cultur soli"i$icat! coninn" ami"on. 7ub aciunea amila#elor ce "i$u#ea# n +elul "e a+ar! ami"onul este scin"at (i"rolitic i! n urma a"aosului "e solutie Lu+ol (I2 G HI ! #ona "in %urul coloniilor pro"uctoare nu se mai colorea# n brun. Valoarea raportului ntre "iametrul #onei "e (i"roli# i "iametrul coloniei sau in"icele amilolitic! este o msur a cantitii "e en#im pro"us "e microor+anismul testat. /a!eriale u!iliza!e! - cultura microbian - plci Petri - me"iul "e cultur) - extract "e "ro%"ie IIII.. 5+ - ami"on solubil IIIII 13 + - H2;P?5 IIIIIII.. 1+! - *+ 7? 5.7;2? IIII.. 3!/ + - a+ar-a+ar IIIIII. 23 +
57

- ap "istilat IIII..1333 ml - I2 - HI - ac "e inoculare - termostat - lamp bacterici" - bec "e +a# - autoclav /od de lu ru6 *e"iul se sterili#ea# n autoclav timp "e 33 minute! la 123o2! "up care se toarn n cutii Petri i se las s se soli"i$ice. Plcile sunt apoi nsmnate prin nepare central sau "in "iluii "ecimale ale microor+anismului "e testat.4ermostatarea se $ace timp "e 72 ore pentru bacterii i / #ile pentru muce+aiuri. Pentru "eterminarea "iametrului #onei "e li# a ami"onului! peste me"iul "in plci se toarn solutie Lu+ol i se msoar "iametrul coloniei i cel al #onei rmase necolorate. 7e calculea# in"icele amilolitic ast$el)

#ona "e (i"roli# a ami"onului

colonie

"iametrul #onei "e li# a ami"onului I-T "iametrul coloniei

1=.3. E@IDENCIERE& /ICROOR1&NI4/E'OR +RODUCTO&RE DE EN5I/E CE'U'O5O'ITICE 2elulo#a este poli#a(ari"ul "e structur cu cea mai mare rspn"ire n lumea ve+etal! putn" $i (i"roli#at "e en#imele celulo#olitice pro"use "e bacterii i muce+aiuri. ;i"roli#a +eneral a celulo#ei are loc "up sc(ema)

celulo#

en"o+lucana#e (21-celula#

lanuri 1-5 +lucanice (insolubile

en"o 1-5 +lucana#e

celo"extrine6 cel-oli+o+luci"e

exo 1-5 +lucana#e

celobio# celobia#a +luco# <intre bacteriile care pro"uc en#ime celulo#olitice $ac parte bacterii cu $orme spiralate aparinn" +enurilor) Cyto$aga, Cellvibrio, Cellulomonas. *uce+aiurile cu activitate celulo#olitic superioar sunt ) )usarium, Mucor, (richoderma, Aspergillus, &hi'opus. +rin i"iul me!odei6 n ca#ul n care microor+anismul testat pro"uce en#ime celulo#olitice extracelulare! acestea "i$u#ea# n me"iul "e cultur i pro"uc o clari$icare a a+arului n %urul coloniilor active. /a!eriale u!iliza!e6
5!

- cultura microbian ((richoderma viridae - plci Petri - ac "e inoculare - me"iul "e cultur) - celulo# pu"r IIII2!/+ - pepton IIIIIII3!/+ - H2;P?5IIIIIII3!2+ - *+7?5 .7;2?IIIII.3!2+ - H22?3IIIIIIII3!5+ - 2a2l2IIIIIIII..3!32+ - >e7? 5.7;2?IIIII3!32+ - Qa2lIIIIIIII.3!32+ - a+ar-a+arIIIIII..1/+ - ap "istilatIIIII.1333ml -utoclavare 23 minute! 121 o2 - termostat - lamp bacterici" - bec "e +a# - autoclav /od de lu ru6 *e"iul "e cultur se sterili#ea# n $lacoane Erlenme8er "e /33 ml! la 121o2 timp "e 23 minute! apoi se reparti#ea# cCte 1/ - 23ml n cutii Petri i se las s se soli"i$ice. nsmnarea se $ace $ie prin neparea central a supra$eei me"iului ! $ie "in "iluii "ecimale ale culturii "e anali#at. 4ermostatarea va avea loc la 33 o2! timp "e 2 - 3 #ile pentru tulpina "e (richoderma viridae sau o "urat corespun#atoare n ca#ul utili#rii altor tulpini. <ac microor+anismul testat pro"uce en#ime cu aciune celulo#olitic! acestea "etermin clari$icarea me"iului "e cultur n %urul coloniei "atorit procesului "e (i"roli# a celulo#ei incorporate. 7e va calcula in"icele celulo#olitic al tulpinii stu"iate! ca $iin" raportul "intre "iametrul #onei "e li# i "iametrul coloniei) "iametrul #onei "e (i"roli# a celulo#ei I2T "iametrul coloniei

6"

1=.=. E@IDENCIERE& /ICROOR1&NI4/E'OR +RODUCTO&RE DE EN5I/E +ROTEO'ITICE Proteinele constituie unul "in substratele nutritive pentru microor+anisme. Ele nu sunt "irect asimilabile! "atorit mrimii moleculei lor i! "e aceea! trebuie "e+ra"ate n pepti"e cu mas mai mic i apoi n aminoaci#i! cu a%utorul en#imelor extracelulare. Proteinele coninute n materia or+anic nevie! care se acumulea# n sol i ape! prin moartea plantelor! animalelor! microor+anismelor! pot $i (i"roli#ate sub aciunea protea#elor extracelulare pro"use "e ctre bacterii i muce+aiuri -a+eni ai putre$aciilor ("e+ra"area proteinelor "e ori+ine animal i ai putre#irii ("e+ra"area proteinelor "e ori+ine ve+etal . 7pre "eosebire "e bacterii i muce+aiuri! "ro%"iile nu pot $olosi proteinele "in me"iu n procesul "e nutriie "eoarece ele conin protea#e intracelulare! care nu se pot elibera n me"iul extern "ect prin "e#inte+rarea nveliurilor celulare sau moarte prin autoli#. Protea#ele sunt pro"use "e un numr "e bacterii ale +enului Bacillus, Streptomyces, Proteus! Clostridium, Pseudomonas i "e muce+aiuri "in +enul Aspergillus, &hi'opus, Penicillium! Mucor. &. *idroliza azeinei +rin i"iul me!odei6 2oloniile pro"uctoare "e en#ime proteolitice determin n %urul lor o #on clar "e li# a ca#einei "in me"iul "e cultur. /a!eriale u!iliza!e6 - cutii Petri - cultura microbian (Bacillus subtilis - ac "e inoculare - bec "e +a# - termostat - autoclav - me"iu "e cultur - ca#ein IIIIII2!/+ - 2a(?; 2IIIII 3!1/+ - 2a2L2IIIIII.3!3/+ - a+ar-a+arIIIII1/+ - ap "istilat III1333ml

61

/od de lu ru6 *e"iul "e cultur se reparti#ea# cte 233 ml n $lacoane Erlenme8er "e /33 ml I se sterili#ea# prin autoclavare la 121o2 timp "e 23 minute! apoi se toarn cte 1/ - 23 ml n plcile Petri i se las s se soli"i$ice. nsmnarea plcilor se e$ectuea# "in cultura "e lucru prin nepare central sau "in "iluii "ecimale i se incubea# la 33o2! timp "e 5, -72 ore. 7e msoar "iametrul #onei n care se observ "ispariia turbi"itii me"iului "e cultur ca urmare a (i"roli#ei ca#einei! precum i "iametrul coloniei i se $ace raportul acestora pentru a se "etermina in"icele proteolitic) "iametrul #onei "e (i"roli# a ca#einei IP T "iametrul coloniei

..

*idroliza #ela!inei

+rin i"iul me!odei6 *icroor+anismele pro"uctoare "e protea#e extracelulare pot (i"roli#a +elatina "in me"iul "e cultur! care Bi pier"e ast$el proprietatea "e a se soli"i$ica la temperaturi sc#ute. /a!eriale u!iliza!e6 - cultura microbian (Bacillus subtilis - eprubete cu me"iul "e cultur coninn" +elatin - ac "e inoculare - bec "e +a# - termostat - $ri+i"er - autoclav - me"iul "e cultur) - pepton "e carneIIII./+ - extract "e carneIIIII3+ - +elatinIIIIIIII123+ - ap "istilat IIIIII1333ml /od de lu ru6 *e"iul "e cultur se reparti#ea# cCte 13 mililitri n tuburi prev#ute cu "op "e vat i se sterili#ea# n autoclav! timp "e 23 minute la 121 o2. <up soli"i$icarea me"iului nutritiv (pstrat peste noapte n ap rece ! tuburile se inoculea# prin nepare central cu
62

tulpina bacterian cercetat ! apoi se incubea# la 37o2 timp "e 5, ore. <up acest interval! culturile se plasea# aproximativ o or la K5o2! pentru soli"i$icarea +elatinei n ca#ul n care nu a $ost (i"roli#at. <ac tulpina a pre#entat activitate proteolitic! me"iul "e cultur rmne lic(i" "up pstrarea n $ri+i"er.

1=.A. E@IDENCIERE& /ICROOR1&NI4/E'OR +RODUCTO&RE DE EN5I/E 'I+O'ITICE Lipi"ele pre#ente n materia nevie! "e ori+ine ve+etal i animal! care a%un+ n (abitaturi naturale! precum i cele coninute n materii prime sau pro"use alimentare pot su$eri trans$ormri sub aciunea microor+anismelor pro"uctoare "e lipa#e extracelulare. Lipi"ele nu pot $i asimilate "ect "up (i"roli#a lor n pre#ena en#imelor speci$ice! numite n +eneral lipa#e! "ar! +rupate totu i n $uncie "e tipul substratului pe care l "e+ra"ea# n trei cate+orii) estera#e! lipa#e i lecitina#e. Lipa#ele sunt sinteti#ate "e numeroase microor+anisme) muce+aiuri (+enul &hi'opus! Mucor, Aspergillus, )usarium, Penicillium, *eotrichum .a. i "ro%"ii ale +enului Candida. 2u microor+anisme selecionate se pot obine preparate en#imatice cu activitate lipa#ic ce pot $i utili#ate la $abricarea brCn#eturilor pentru "e#voltarea aromei! n terapeutic mpreun cu lipa#a pancreatic pentru mbuntirea "i+estiei! precum i n in"ustria "eter+enilor. +rin i"iul me!odei6 Lipa#ele "in +rupa estera#elor (i"roli#ea# compuii denumii &40EEQ'! care sunt esteri ai sorbitolului cu aci#ii +rai cu lan lun+. n te(nicile calitative cele mai utili#ate! aceti esteri solubili n ap sunt ncorporati ntr-o +elo# nutritiv coninn" 2a2l2. -ci#ii +rai eliberai sub aciunea lipa#elor reacionea# cu 2a2l2 i $ormea# sruri insolubile "e calciu care provoac opaci$ierea me"iului n %urul coloniilor %roductoare "e estera#e. /a!eriale u!iliza!e6 - cultura microbian cu activitate lipolitic - cutii Petri - ac "e inoculare - bec "e +a#
63

- termostat - me"iul "e cultur) - a+ar nutritiv /od de lu ru6 se sterili#ea# me"iul "e cultur n $lacoane Erlenme8er "e /33 ml i! separat! o soluie 1E "e 4Veen 23! 53! 63 sau ,3 i o soluie 1E 2a2l2! n re+im "e 121o2 G 23 minute. n plcile Petri sterile se intro"uc cte 2 ml "in soluia "e 4Veen i 3!/ ml "in soluia "e 2a2l2. Peste acestea se toarn rapi" 1/ - 23 ml "in a+arul nutritiv! se omo+eni#ea# prin rotirea n ambele sensuri a plcilor i se las s se soli"i$ice. *e"iul se nsmnea# prin nepare central "in cultura "e cercetat i se termostatea# la temperatura optim "e "e#voltare a microor+anismului! timpul necesar. *icroor+anismele cu activitate tVeenestera#ic "etermin apariia n %urul coloniilor a #onelor opace. 7e calculea# in"icele lipolitic "up $ormula) "iametrul #onei "e (i"roli# a esterului IP T "iametrul coloniei

64

1=.D. 4TUDIU' E-ECTU'UI &NTI.IOTICE'OR &4U+R& /ICROOR1&NI4/E'OR

E-ECTU&RE& &NTI.IO1R&/EI +RIN /ETOD& DI4CURI'OR

-ntibioticele sunt substane a cror aciune antibacterian se exprim ast$el) prin in(ibarea multiplicrii bacteriilor - e$ect bacteriostatic prin "istru+erea bacteriilor - e$ect bacterici"

Evidenierea a iunii ba !erios!a!i e a unor an!ibio!i e "rin me!oda dis urilor +rin i"iul me!odei6 2n" un antibiotic este plasat pe supra$aa unui me"iu "e cultur +elo#at! n cutii Petri! acesta "i$u#ea# "up un +ra"ient "e concentraie. :acteria nsmnat nu se va "e#volta la concentra ii ale antibioticului superioare unei mrimi numit C.M.I. (concentraie minim "e in(ibiie . n %urul "iscurilor "e (rtie impre+nate cu antibioticul respectiv se vor observa #one concentrice "e in(ibiie! al cror "iametru este "epen"ent "e sensibilitatea mai mare sau mai mic a tulpinii testate $a "e acest antibiotic. /a!eriale u!iliza!e6 - cultura bacterian - cutii Petri - "iscuri "e (rtie impre+nate cu "i$erite antibiotice ("iscurile au un "iametru "e aproximativ 3!6 cm i sunt inscripionate cu "enumirea prescurtat a antibioticului respectiv6 concentraia "e antibiotic este menionat "e obicei "e $irma pro"uctoare pe ambala% . - eprubete cu ap steril - pipete sterile "e / ml - bec "e +a# - termostat - me"iul "e cultur) a+ar nutritiv /od de lu ru6 7e sterili#ea# me"iul "e cultur I eprubetele cu ap prin autoclavare 23 minute la 121o2! apoi se toarn n plcile Petri i se las s se soli"i$ice. 7e pre+tete inoculul prin obinerea unei suspensii "e celule bacteriene n ap steril! ast$el nct
65

concentraia acestuia s $ie "e 2 -3 x 136 9>2Gml. -ceast concentraie bacterian trebuie s permit obinerea "e colonii con$luente pe supra$aa me"iului "e cultur. <e asemenea! este in"icat ca inoculul s provin "intr-o cultur bacterian vec(e "e 25 ore! a$lat n $a#a staionar. nsmnarea me"iului "e cultur "in plcile Petri se reali#ea# prin &inun"area' ntre+ii supra$ee cu 2 -5 ml "in "iluia obinut "in cultura bacterian! iar excesul "e lic(i" se scur+e prin aspirare cu o pipet Pasteur. 7e aplic apoi "iscurile "e testat $ie cu a%utorul "istribuitorului automatic! $ie cu o pens (sterili#at prin $lambare ! n mo" aseptic! apsn" uor pe "iscuri pentru a asi+ura a"erena la me"iu. -cest "in urm proce"eu este tot mai rar ntrebuinat. Incubarea are loc 16 - 1, ore la 37o2. 7e msoar "iametrul #onei "e in(ibiie i se compar in$luena "i$eritelor antibiotice asupra tulpinii bacteriene testate! menionn"u-se cel mai e$icient antibiotic precum i cel cu aciunea cea mai slab.

-ntibiotic 2 -ntibiotic 3

-ntibiotic 5

-ntibiotic / -ntibiotic 1

1A. .IO4INTE5& +E C&'E /ICRO.I&N & UNOR CO/+U<I DE INTERE4 INDU4TRI&'

66

*icrobiolo+ia in"ustrial a "evenit o parte important a microbiolo+iei! avn" ca "omeniu "e stu"iu utili#area microor+anismelor n scopul pro"ucerii "e metabolii "e interes in"ustrial! $armaceutic! a+ricol! pentru conservarea me"iului etc. Pro"uii "e ori+ine microbian sunt clasi$icai n me!abolii "rimari i se undari. *etaboliii primari sunt re%re(entai "e compuii a$lai n le+tur cu sinte#a componentelor celulei microbiene! pro"ui cel mai a"esea n $a#a "e cretere exponenial sau tro$o$a#a. -cetia inclu" aminoaci#i! nucleoti"e! en#ime! pro"u i $inali "e $ermentaie cum sunt etanolul sau aci#ii or+anici. *etaboliii secun"ari se acumulea# n me"iul "e cultur n i"io$a#! a"ic n perioa"a urmtoare $a#ei "e cretere exponentiale6 acetia sunt compui care nu au le+tur "irect cu creterea i sinte#a "e material celular. <in aceast cate+orie $ac parte cele mai multe antibiotice! micotoxine i colorani microbieni.

2urba "e cre tere

me!aboli i "rimari

me!aboli i se undari

!im"

Principalii metabolii microbieni "e interes in"ustrial i biote(nolo+ic sunt pre#entai Bn tabelul urmtor ) 4U.4T&NCE +roduse indus!riale Etanol ("in +luco# Etanol ("in lacto# -ceton i butanol
67

/ICROOR1&NI4/E Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces $ragilis Clostridium acetobutylicum

2!3 - butan"iol En#ime +roduse a#ri ole =ibereline Insectici"e microbiene &di!ivi alimen!ari -minoaci#i -ci#i or+anici Qucleoti"e Vitamine Poli#a(ari"e +roduse medi ale -ntibiotice -lcaloi#i Insulin! (ormon uman "e cretere! somatostatin! inter$eron Combus!ibili ;i"ro+en *etan Etanol

nterobacter, Serratia Aspergillus, Bacillus, Mucor, (richoderma *ibberella $u+i,uroi Bacillus thuringiensis Corynebacterium glutamicum Aspergillus niger Corynebacterium glutamicum Ashbya, remothecium, Bla,eslea -anthomonas Penicillium, Streptomyces, Bacillus Claviceps purpurea scherichia coli, Saccharomyces cerevisiae i altele prin in+inerie +enetic *icroor+anisme $otosintetice Methanobacterium .ymomonas, (hermoanaerobacter

*icroor+anismele utili#ate n aplicaiile in"ustriale sunt cultivate $ie n tuburi! n $lacoane a+itate! n $ermentatoare! cu a+itare sau static! n me"ii lic(i"e n submers sau pe me"ii soli"e ($ermentaie pe suport soli" . *e"iile "e cultur utili#ate trebuie s aib un pre "e cost ct mai mic! "e aceea sunt repre#entate "e materii prime! pro"use! subpro"use i "eseuri ale in"ustriei a+roalimentare! constituin" sursa "e carbon! "e a#ot ! $actorii "e cre tere! care pot $i suplimentate cu sruri minerale.

1A.1. O.CINERE& DE .IO/&4F DIN -UN1I

/a!eriale u!iliza!e6 - cultur "e Pleurotus ostreatus sau alt microor+anism ce poate $i utili#at n acest scop - $lacoane Erlenme8er "e 1/33 ml
6

- ac "e inoculare - tuburi cu ap steril - bec "e +a# - termostat - me"iu "e cultur) boabe "e +ru /od de lu ru6 n $lacoanele Erlenme8er se cntresc cte 133 + "e boabe "e +r u curate i se a"au+ 133 ml ap "e robinet. *e"iul se sterili#ea# 33 minute la 12132! iar "up rcire se nsmnea# cu cultura "e Pleurotus ostreatus obinut prin suspensionarea celulelor "intr-un tub n ser $i#iolo+ic sau ap steril. 7e omo+eni#ea# cultura i se termostatea# la temperatura camerei! timp "e 2 - 3 sptmni! notn"u-se "ata la care cultura a inva"at supra$ata me"iului i e$ectun"u-se cntriri ale $laconului "in 3 in 3 #ile! pentru "eterminarea pier"erii masice "atorate e,a%orrii! respiraiei i metaboli#arii substratului. 2iuperca cultivat este comestibil! (ea $ace parte "in cate+oria ciupercilor superioare! cu plrie iar pro"usul brut obinut ar putea $i prelucrat i utili#at ca a"itiv n in"ustria alimentar pentru valoarea sa nutritiv ri"icat! +ust i aroma caracteristic.

1A.0. O.CINERE& DE EN5I/E +ECTO'ITICE DIN ASPERGILLUS NIGER 7ubstanele pectice sunt constitueni $i#iolo+ici universali ai ve+etalelor! alctuin" lamela mi+locie care $ormea# le+tura "intre celule. 4esuturile parenc(imatoase sunt "eosebit "e bo+ate n substane pectice) aci#i pectinici! aci#i pectici i protopectine. -ci#ii pectinici sunt (eteropoli#a(ari"e constituite n principal "in aci#i <-+alacturonici! n ma%oritate sub $orm "e ester metilic! unii prin le+turi -1!5. -ci#ii pectici sunt aci#i poli+alacturonici neesteri$icai insolubili in ap. Protopectinele! insolubile n ap! stau la ori+inea substanelor pectice! pe care le eliberea# prin (i"roli#. En#imele care acionea# asupra substanelor pectice se pot nca"ra n "ou +rupe) en#ime "epolimeri#ante i en#ime saponi$iante. En#imele pectolitice saponi$iante sunt estera#e nalt speci$ice catali#n" "emetoxilarea pectinelor prin scin"area le+turilor esterice "intre +rupele -2??; i alcoolul metilic "in lanturile poli+alacturonice. Ele se numesc pectin#metil# estera'e sau pectin#estera'e $iin" notate P*E sau PE. En#imele pectolitice "epolimeri#ante catali#ea# "epolimeri#area pectinei. Preparatele en#imatice comerciale se obin prin cultivarea tulpinilor selecionate "e
6!

microor+anisme ("e obicei Aspergillus niger pe me"ii "e cultur $ormate "in tre "e +ru! tiei "e s$ecl "e #a(r! morcovi! melas! tescovin "e mere etc. <up "e#voltarea microor+anismului i biosinte#a en#imelor! me"iile "e cultur sunt prelucrate "up te(nicile cunoscute obinn"u-se preparate en#imatice pectolitice puri$icate sub $orm "e lic(i" concentrat sau sub $orm soli". Preparatele en#imatice pectolitice "e ori+ine microbian sunt utili#ate n in"ustria sucurilor "e $ructe! conservelor "e le+ume! vinurilor! pro"uselor #a(aroase. /a!eriale u!iliza!e6 - tulpina "e Aspergillus niger pro"uctoare "e en#ime pectolitice - $lacoane Erlenme8er "e 1/33 ml - ac "e inoculare - ap steril - me"iu "e cultur) trae "e +rau cu umi"itate "e 53 - /3E - bec "e +a# - termostat /od de lu ru6 7e prepar me"iul "e cultur coninan" tre "e +ru i ap "e robinet (/3E umi"itate i se reparti#ea# cte 133 + n $iecare $lacon! "up care se sterili#ea# la 12132! timp "e 63 minute. 7e inoculea# cu 13 ml suspensie "e spori "e Aspergillus niger obinut prin raclarea culturii "intr-un tub "e cultur n 13 ml ap steril. *e"iul nutritiv se omo+eni#ea# $oarte bine i se incubea# la 3332! timp "e / #ile! cu a+itare "in 25 n 25 "e ore. <up "e#voltarea complet i sporularea culturii! se e$ectuea# o extracie 1) 3 n ap "e robinet! n care se a"au+ i cteva picturi "e 4Veen pentru umectarea sporilor i optimi#area extraciei i se las la temperatura camerei 2 ore. 7e $iltrea# mai nti +rosier! apoi pe $iltru EH i se poate supune operaiei "e concentrare. Preparatul en#imatic brut se pre#int ca un lic(i" transparent! "e culoare brun! avCn"! o Bncrctura relativ ri"icat "e coni"iospori "e -sper+illus ni+er! care poate $i Bnlturat prin trecerea pe $iltru EH! "in a#best.

1A.3. O.CINERE& +I1/ENTI'OR /ICRO.IENI .IO4INTE5& ORE5U'UI RO<U -ER/ENT&T CU MONASCUS PURPUREUS

7"

*uce+aiul Monascus purpureus! utili#at "e secole n rile "in ?rient pentru prepararea unor mncruri tra"iionale! repre#int n pre#ent o nou surs "e obinere a unui a"itiv "e culoare pentru in"ustria alimentar! $armaceutic i cosmetic, i n rile Europei i -mericii. -cest microor+anism pro"uce prin cultivare n me"ii lic(i"e sau prin $ermentare pe suport soli" cel putin 6 pi+meni! "intre care 2 +albeni (an1a$lavina i monascina ! 2 oran% (rubropunctatina i monascorubrina i 2 ro ii (rubropunctamina i monascorubramina ! n $uncie "e natura sursei "e carbon i a#ot i "e con"iiile "e cultivare. 4oto"at ! acest microor+anism sinteti#ea# o serie "e en#ime (i"rolitice (n special amila#e ! care "e+ra"ea# componenii me"iului "e cultur i poate $ermenta o serie "e +luci"e! $apt pentru care este $olosit n ?rient la obinerea vinului "e ore#. /a!eriale u!iliza!e6 - tulpina "e Monascus purpureus - $lacoane Erlenme8er "e 1/33 ml - ac "e inoculare - eprubete cu ap steril - bec "e +a# - termostat - me"iu "e cultur) ore# boabe sau mcinat /od de lu ru6 *e"iul "e cultur se reparti#ea# cte 133 + n $iecare $lacon Erlenme8er i se sterili#ea# prin autoclavare la 12132! timp "e 33 minute. <up rcire! me"iul este nsmnat cu o suspensie "e coni"iospori "e Monascus purpureus obinui prin raclarea culturii "in tub n ap steril. 7e a+it ener+ic coninutul $lacoanelor! aceast operaie repetn"u-se #ilnic pn la nc(eierea biosinte#ei. 4ermostatarea va avea loc la ntuneric! la 3332! timp "e 3 sptmani. 7e va nota intervalul "up care are loc apariia (i$elor! colorarea me"iului "e cultur n oran% sau ro u i se vor cntri $lacoanele la $iecare 3 #ile pentru evi"enierea sc"erii n +reutate ca urmare a evapor rii! consumului "e substrat i a respiraiei celulare. <up nc(eierea procesului "e sinte# a pi+menilor! acetia vor $i extrai "in me"iul "e cultur n etanol! putn"u-se trasa spectrul n vi#ibil.

71

1D. IN-'UENC& R&DI&CII'OR U@ &4U+R& /ICROOR1&NI4/E'OR 1D.1. +O4I.I'IT&TE& INDUCERII /UT&1ENE5EI EN CE'U'& /ICRO.I&N @a"iaiile ultraviolete cu lun+imea "e un" "e 2/5 nm pot avea e$ecte letale asupra celulei microbiene! n $uncie "e "o# i "e starea microor+anismelor. Ele sunt puternic absorbite "e ba#ele a#otate! "eterminn" asupra acestora e$ecte c(imice const n" n $ormarea "e pirimi"ine le+ate covalent ("imeri "e pirimi"in ! n principal "e timin a"iacent n lanul polinucleoti"ic. -ceti "imeri cau#ea# o "istorsiune n (elixul "e -<Q! "ar cele mai multe mo"i$icri pot $i reparate prin procese "e $otoreactivare! prin exci#ie! recombinare sau reparare 7?7. <ac "o#a "e ra"iaii este subletal! in$ormaia +enetic se transmite eronat i se pot obine tulpini mutante! cu caractere "i$erite "e cele ale tulpinei parentale. La nivel molecular! mutaiile repre#int alterri ale secvenei "e ba#e "in structura -<Q. n practica biote(nolo+ic! acest aspect este utili#at pentru obinerea "e mutante cu potential pro"uctiv ri"icat! cultivate pentru biosinte#a unor compui "e interes in"ustrial. +rin i"iul me!odei6 @a"iaiile ultraviolete $ac parte "in cate+oria a+enilor muta+eni $i#ici! care "etermin! pe ln+ moartea unor celule! mrirea ratei "e apariie a mutaiilor! care! oricum s-ar $i pro"us i spontan! "ar n intervale "e timp mult mai mari. -ciunea ra"iaiilor 9V poate $i evi"eniat prin "eterminarea numrului "e celule viabile "up expunerea la acest tip "e $actori $i#ici! $a "e un martor neira"iat. /a!eriale u!iliza!e6
72

- lamp +ermici" (cu T 2/5 nm - cultura microbian - stativ - cronometru - pipete sterile - plci Petri - termostat - me"iu "e cultur - se va utili#a me"iul a"ecvat tulpinii cu care se lucrea#. Pentru "eterminarea numrului "e bacterii viabile se va utili#a a+ar nutritiv! pentru "ro%"ii sau muce+aiuri - extract "e mal - a+ar. Pentru evi"enierea tulpinilor mutante se va ale+e un me"iu special! n $uncie "e caracterul care se "ore te a $i selecionat! "e exemplu) in"ice amilolitic! proteolitic etc! crescut (ve#i lucrrile anterioare ! pro"ucie "e pi+meni! proprietatea "e re#isten la un anumit antibiotic .a.

/od de lu ru6 *e"iul "e cultur sterili#at n prealabil se $lui"i$ic pe baie "e ap! "up care se reparti#ea# n plci i se las s se soli"i$ice. nsmnarea plcilor se $ace "intr-o "iluie corespun#toare! n ser $i#iolo+ic sau ap steril! ast$el nct s poat $i "eterminat numrul "e colonii aprute "up termostatare! n ca#ul probei neira"iate. n ca#ul probelor ce vor $i expuse aciunii ra"iaiilor 9V! trebuie s se in seama c "iluia va $i "in ce n ce mai mic! mer+n"! un"e se poate! pCn la pipetarea "irect "in inocul. Pentru ira"ierea probelor! se $ixea# stativul sub lampa +ermici"! la o "istan "e aproximativ 23 cm! i se sterili#ea# nia timp "e 1/ minute prin aprin"erea lmpii. Pentru e$ectuarea ira"ierilor! plcile Petri nsmnate i "esc(ise vor $i plasate pe stativ! pornin"u-se cronometrul concomitent cu aprin"erea lmpii. &!enieL nainte "e pornirea lmpii bacterici"e! se va nc(i"e nia cu a%utorul ecranului protector mobil. Qu se intro"uce mna n ni n timp ce lampa "e ultraviolete este n $unciuneW 4impii "e expunere a culturilor "in plci la aciunea ra"iaiilor 9V sunt cuprini ntre 33 secun"e i cteva minute! n $uncie "e tulpina cu care se lucrea#. Ime"iat "up ira"iere! plcile se nc(i" cu capacul! se notea# timpul "e expunere! se ambalea# n (rtie nea+r (pentru evitarea reparaiilor prin $otoreactivare i se intro"uc n termostat! lsn"u-se "urata necesar "e#voltrii coloniilor. <up acest interval se numr coloniile aprute n $iecare
73

plac! inn"u-se seama "e coe$icientul "e "iluie. Pentru $iecare timp "e ira"iere trebuie e$ectuate cte trei plci! n scopul exprimrii re#ultatelor ca me"ie a trei "eterminri. Viabilitatea celulelor expuse ira"ierii se va calcula "up $ormula) nr. olonii din "la : oefi ien!ul de diluie @iabili!a!ea K : 188 nr. olonii din "la a mar!or 7neiradia! 9 : oefi ien!ul de diluie

7e va completa urmtorul tabel) Nr. "rob Tim" de iradiere 7se 9 Nr. eluleBml @iabi2 li!a!e 7M9 3 13 33 63 .3 123 1/3 1,3 213 253 1 0 3 = A D H I J 18

n ca#ul n care se "orete i#olarea "e tulpini mutante cu caractere $enotipice mo"i$icate $a "e tulpina parental! se va utili#a un me"iu "e cultur convenabil! care s permit selecionarea uoar i rapi" a coloniilor mutante. -cestea vor $i nsmnate n tuburi! pe me"iu nclinat! urmn" ca tulpinile selecionate s $ie testate prin cultivare n submers sau supra$a "in punct "e ve"ere al biosinte#ei metaboliilor utili. <e exemplu! pot $i i#olate tulpini bacteriene sau $un+ice pro"uc toare "e amila#e! protea#e! celula#e! lipa#e! colorani microbieni! re#istente la aciunea unor $actori "e me"iu etc.

74

DE4-UR&RE& &CTI@ITII I +ROTECCI& /UNCII N '&.OR&TORU' DE /ICRO.IO'O1IE

/i robiolo#ia es!e o dis i"lin urenie im"e abil n !im"ul lu rului.

are ne esi! ordine, me!od, ri#oare i o

n laboratorul "e microbiolo+ie trebuie respectate o serie "e re+uli "e i+ien! $r "e care nu pot $i aplicate meto"ele "e lucru speci$ice acestei "iscipline! exist n" toto"at pericolul contaminrii propriei persoane! a celor "in %ur! precum i a materialelor care se manipulea#. Qumrul microor+anismelor "in ncperi varia# "e la cteva sute G m3! n ncperi $oarte curate! $r micri "e aer! pn la #eci "e mii n ncperi nentreinute i+ienic. Este cunoscut $aptul c ma%oritatea microor+anismelor "in aer provin "e pe sol! "in "epo#itele "e materie or+anic i a%un+ n aer o"at cu particulele "e pra$. ? alt cate+orie sunt microor+anismele expul#ate "e pe mucoasele aparatului respirator prin tuse! str nut! vorbire i c(iar n timpul respiraiei. Pentu "es$urarea unei activitti normale "e lucru n laboratoarele "e microbiolo+ie se vor respecta urmtoarele re+uli) * ntreinerea n per$ect stare "e curenie a ncperilor (par"oseal! perei! pla$on i

+eamuri ! combaterea insectelor i a muce+aiului6 * * lucru6 * * ter+erea meselor "e lucru cu un "e#in$ectant nainte "e nceperea lucrului6 evitarea $ormrii curenilor "e aer n ncperile "e lucru6
75

n"eprtarea "e pe mesele "e lucru i "in ncpere a tuturor obiectelor inutile6 ntreinerea n per$ect stare "e curenie a aparaturii! mobilierului i meselor "e

ira"ierea cu ra#e ultraviolete a atmos$erei i supra$eelor "e lucru nainte "e nceperea

activitii * ntreinerea n per$ect stare "e curenie a minilor! mbrcmintei i nclmintei

persoanelor care lucrea# n laborator.

<e aceea! n laboratorul "e microbiolo+ie ) purtai un (alat "e laborator "intr-un material nein$lamabil! n stare bun! curat i "intr-o sin+ur culoare6 lsai-v (ainele n vestiar sau n spaiul special amena%at6 "up terminarea lucrrilor! (alatul va $i pstrat n locuri speciale6 prote%ai-v uviele lun+i "e pr! purtai un+(iile curate i tiate scurt6 splai-v mainile cu ap cal" i spun ("e pre$erin lic(i" sau pu"r! cu aciune bacterici" i ter+ei-le pe un prosop "e (rtie "e $olosin unic nainte i "up manipularea microbiolo+ic6 "up utili#area sticlriei cu care ai manipulat microor+anismele! aceasta trebuie "epo#itat separat n ve"erea autoclavrii6 E4TE INTER5I4 &RUNC&RE& O.IECTE'OR C&RE &U -O4T N CONT&CT CU /ICRO.II '& CO<U' DE 1UNOI L nu mncai! nu bei i nu $umai n incinta laboratorului6 nu "epo#itai alimentele personale n $ri+i"erul laboratorului6 nu vorbii! nu strnutai i nu tuii n timpul nsmnrilor 6 n practica "e laborator! principalele acci"ente pot apare la) - mini - t ieturi sau inepturi cu pipete Pasteur sau cu cioburi "e sticl6 arsuri ale "e+etelor n timpul lucrului n #ona steril "in %urul $lcrii "e la becul "e +a#6 arsuri cu amestec sul$ocromic6 - oc(i - prin proiectarea cioburilor "e sticl sau a unor stropi "e ap $ierbinte sau substane c(imice n timpul lucrului6 - +ur - in+erarea "e pro"u i toxici (reactivi sau "e culturi microbiene6 acest tip "e acci"ente este $oarte rar! "eoarece pipetele sunt prev #ute cu un "op "e vat la capt6 - nas - in(alarea unei "ispersii "e +ermeni (aerosoli in$ecioi ! "in cau#a practicilor +reite "e nsmnare sau cn" un tub "e cultur microbian se spar+e) acest tip
76

"e acci"ente poate $i evitat prin purtarea unei mti sterile "in (rtie.

77