ELECTROFOREZA Definiie Electroforeza reprezint o tehnic de separare a proteinelor bazat pe migrarea acestora n cmp electric.

Aceste metode nu sunt utilizate pentru a purifica mari cantiti de proteine deoarece exist metode alternative mai simple iar metodele electroforetice afecteaz structura i funcia proteinelor. Electroforeza este util ca metod analitic. Avantajul major este acela c proteinele pot fi vizualizate i separate n acelai timp, permind estimarea rapid a numrului de prot eine dintr-un amestec sau gradul de puritate al unui preparat proteic specific. Electroforeza permite, de asemenea, determinarea proprietilor fundamentale ale proteinelor cum ar fi punctul izoelectric sau greutatea molecular. Generaliti Migrarea electroforetic a unei molecule n orice tip de mediu are loc n direcia electrodului cu ncrcare electric de sens opus ncrcrii nete a moleculei. Astfel, moleculele ncrcate negativ vor migra spre electrodul pozitiv; cationii vor migra spre catod (-) iar anionii spre anod (+). Mediul de migrare trebuie s fie tamponat la un pH care determin o direcie i o rat de migrare specifice. Mobilitatea proteinelor crete cu ct pH-ul este mai ndeprtat de punctul izoelectric (pI), crescnd astfel ncrcarea net. Cu toate acestea, rezoluia de separare bazat pe diferenele de ncrcare net este mai bun dac diferena de ncrcare este redus sau se apropie de zero la pI. Electroforeza se desfoar fie pe hrtie sau pe geluri. Gelurile pot fi de agaroz sau poliacrilamid. Electroforeza pe gel de poliacrilamid Gelul de poliacrilamid acioneaz ca o sit molecular, ncetinind micarea proteinelor proporional cu raportul mas molecular / ncrcare electric. Migrarea poate fi afectat i de forma moleculelor. n concluzie, migrarea unei proteine n gel este o funcie de dimensiune i form.

Electroforez vertical pe gel de poliacrilamid (schem). Proteinele migreaz n gel la aplicarea unui cmp electric. Gelul inhib dezvoltarea curenilor de convecie datorai gradienilor mici de temperatur sau migrrile induse de alte cauze dect cmpul electric.

Identificarea proteinelor dup colorarea proteinelor din gel cu albastru Coomassie. Fiecare band din gel reprezint o protein diferit. Proteinele mai mici se deplaseaz n gel mai rapid dect cele mari. Acest exemplu ilustreaz separarea unei enzime. Prima coloan prezint migrarea proteinelor din extractul celular nepurificat. Celelalte coloane, de la stnga la dreapta reprezint proteinele migrate dup fiecare pas. Pe ultima coloan se observ migrarea celor 4 subuniti ale enzimei.

Pentru a migra proteinele n gel este nevoie de extragerea lor din context. Cele mai comune metode electroforetice de determinare a puritii i masei moleculare utilizeaz pentru extracie un detergent, numit SDS (sodium-dodecil-sulfat). Acesta se cupleaz la proteine n cantiti relativ proporionale cu greutatea molecular a proteinei, adic 1 molecul SDS la fiecare 2 reziduuri de aminoacizi. SDS determin o ncrcare negativ net, fcnd nesemnificativ ncrcarea intrinsec a proteinei i oferind tuturor proteinelor din amestec un raport mas/ncrcare similar. Astfel, electroforeza n prezena SDS ine cont aproape n exclusivitate de masa molecular, polipeptidele mici migrnd mai repede. Dup electroforez, vizualizarea proteinelor se face prin adugarea unui colorant (cel mai folosit albastru Coomassie) care se leag la proteine, fr a colora gelul. Prin aceast metod, cercettorul poate monitoriza pro gresiunea unui proces de purificare proteic cum ar fi fracionarea celular. Compararea poziiilor benzilor de migrare cu geluri standard face facil identificarea unor proteine cu greutate molecular necunoscut.

DE MEMORAT pI punctul izoelectric punctul izoelectric este pHul la care ncrcarea net total a unei molecule amfotere devine zero. Punctul izoelectric depinde de tria ionic a solventului, de speciile contraionice i de concentraia de solvii n timp ce punctul izoionic este punctul izoelectric n absena contraionilor i la concentraii sczute de solvit. Punctul izoelectric este uor de determinat ca pHul la care molecula este imobil ntr-un experiment de electroforez (focusare izoelectric). Punctul izoelectric se apropie de punctul izoionic la o trie ionic sczut, cnd legturile ionice sunt inactivate. La punctul izoelectric, moleculele amfotere se agreg i devin insolubile deoarece nu exist repulsie electrostatic ntre molecule cu aceeai ncrcare net. Electroforeza reprezint o metod de analiz i separare bazat pe migrarea particulelor solide dispersate ntr-un lichid sub aciunea unui cmp electric. Denumirea de electroforez provine din greaca veche i latin, unde cuvntul electron (electric) combinat cu cel latin phore (purttor), evideniaz astfel rolul esenial al cmpului electric n procedeul descris. Dei este cunoscut nc de la sfritul secolului XIX, electroforeza se afirm ca o metod analitic de separare abia n urma lucrrilor referitoare la stadiul uno r proteine (1937) elaborate de Arne Tiselius, laureat al premiului Nobel, numit i printele electroforezei. Electroforeza este o metod standard utilizat n studiile de biologie molecular. Principiul metodei se bazeaz pe migrarea n cmp electric a moleculelor ncrcate negative n funcie de dimensiunea i forma lor. Astfel moleculele de dimensiuni mici vor migra mai rapid spre polul pozitiv (anod) comparativ cu moleculele de dimensiuni mai mari. Electroforeza este o metod fizico-chimic de analiza ce permite separarea macromeculelor (proteine sau acizi nucleici) sau a monomerilor specifici (aminoacizi, nucleotide), pe baza diferenelor ntre vitezele de deplasare ntr-un cmp electric aplicat mediului respectiv. Ca urmare a caracterului lor amfo ter, proteinele posed o sarcin electric ce depinde de natura moleculei, pH i de compoziia mediului. Moleculele ncrcate electric, aflate n soluie i supuse aciunii unui cmp electric, vor migra ctre electrodul de polaritate opus. Electroforeza este o metoda analitic ce permite: - vizualizarea i separarea n acelai timp, permind estimarea rapid a numrului de proteine dintr-un amestec sau gradul de puritate al unui preparat proteic specific; - determinarea proprietilor fundament ale ale proteinelor cum ar fi punctul izoelectric (pI) sau greutatea molecular. pI punctul izoelectric este pH-ul la care ncrcarea net total a unei molecule amfotere devine zero i mobilitatea este nul.) Viteza cu care se deplaseaz o particul ntr-un cmp electric depinde de mai muli factori: densitatea de sarcin electric la suprafaa particulei (funcie de mrimea sarcinii i de volumul particulei), densitatea particulei, gradientul de potenial (reprezentat de

raportul dintre diferena de potenial dintre electrozi i distana dintre acestea), fora ionic a mediului, vscozitatea lui, temperatura. De aceeai factori depinde i gradul de rezoluie al unei metode electroforetice, natura suportului folosit i pH-ul mediului fiind decisive. TIPURI DE ELECTROFOREZ De-a lungul timpului s-au folosit mai multe suporturi electroforetice, gelul de agaroz fiind cel care asigur cea mai bun rezoluie. Se cunosc mai multe tipuri de electroforeza n gel de agaroz: tehnica standard, electroforeza n gel de SDS-agaroza (la care adugarea SDS - sodium dodecil sulfat n compoziia suportului electroforetic permite separarea fraciunilor pe baza masei moleculare) i focalizarea izoelectric n studiile de biologie molecular migrarea poate fi efectuat prin utilizarea a dou tipuri de gel: de agaroz i de poliacrilamid. Pe lng componentul de baz utilizat, cele dou geluri se difereniaz i prin rezoluia de separare. ELECTROFOREZA PE GEL DE AGAROZ Agaroza este preferat n cazul moleculelor de acid nucleic mai mari, cu dimensiuni cuprinse n intervalul 0,5-25 kpb, iar gelul de poliacrilamid pentru fragmentele de pn la 1000 perechi de baze (bp). Agaroza este un polizaharid extras din anumite specii de alge care prin polimerizare formeaz o reea neutr. Structura neutr a gelului de agaroz constituie un avantaj deoarece acesta nu va interaciona cu moleculele hidrofobe supuse migrrii electroforetice. Dimensiunea porilor difer n funcie de concentraia de agaroz utilizat, ntre cele dou exist nd o relaie de inversproporionalitate. (Clarck, 2010) - Prepararea gelului de agaroz 2%: o gelul de agaroz se obine prin dizolvarea agarozei ntr-o soluie tampon prin nclzire o dup rcire, cteva minute, soluia de agaroz se toarn ntr-o tvi special o se fixeaz pieptenele pentru formarea godeurilor i se las la rcit. o n urma rcirii, gelul de agaroz se va prezenta sub forma unei reele cu pori de dimensiuni cuprinse ntre 100 i 300 nm. o ncrcarea probelor: n fiecare godeu se depune o cantitate de 5l AND amestecat cu 1l de tampon de ncrcare. Tamponul de ncrcare utilizat conine un amestec de doi colorani, albastru de brom fenol i xilen cianol. Cei doi compui au mas molecular determinat ceea ce permite observarea evoluiei electroforetice a probelor ncrcate. o condiii de migrare: s-a utilizat ca tampon de migrare TBE 1x (Tris-BoratEDTA) i s-a aplicat o tensiune de 5 V/cm. o vizualizare: pentru vizualizarea fragmentelor de ADN se folosete coloraia cu bromur de etidiu. Bromura de etidiu este un agent intercalant fluorescent care se fixeaz ntre bazele azotate ale moleculelor de ADN. Prin expunerea la lampa UV moleculele de ADN apar sub forma unor benzi de culoare portocalie. Utilizarea bromurii de etidiu presupune

o serie de msuri de protecie deoarece este considerat a fi un puternic agent mutagen.

Fig. 1 Etapele electroforezei n gel de agaroz. Agaroza se dizolv ntr-o soluie tampon prin nclzire i se toarn ntr-o tvi special (a, b) Pentru formarea godeurilor se fixeaz un pieptene astfel nct probele s migreze de la acelai nivel (c). Dup rcire, gelul se depune n cuva de migrare, n care se afl tamponul de migrare n cantitate suficient ct s acopere gelul. Probele sunt ncrcate n godeuri separate dup ce au fost amestecate n prealabil cu un colorant - loading dye (d.). Dup ncrcarea probelor se pune capacul la cuva de migrare, se fixeaz anodul la captul opus godeurilor cu probele de analizat i se seteaz la un voltaj de 5 V/cm (e.)

ELECTROFOREZA N GEL DE POLIACRILAMID (PAGE) Migrarea electroforetic n gel de poliacrilamid este preferat pentru separarea fragmentelor de ADN de mici dimensiuni datorit puterii de rezoluie mare, care permite diferenierea fragmentele ce se deosebesc chiar i printr-o singur pereche de baze. Gelul de poliacrilamid se obine n urma reaciei de polimerizare dintre acrilamid,unitatea de baz i N,N-metilen-bis-acrilamid, agentul de reticulare. Reacia de polimerizare este catalizat de: TEMED (N,N,N,N-tetra-metilen-diamin) i APS (persulfat de amoniu). n urma reaciei se formeaz o reea de pori. Dimensiunea porilor este invers proporional cu concentraia de acrilamid: bis-acrilamid din soluie. Electroforeza n gel de agaroza prezint cteva avantaje, cele mai importante fiind: gradul mare de rezoluie, specificitate i sensibilitate rapiditatea, conferit de posibilitatea analizei simultane a mai multor parametri, ca urmare a independenei totale a celor dou module (de migrare i colorare) gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minim a factorului uman la metodele manuale) diversificarea parametrilor investigai (proteine, lipoproteine, izoenzime, hemoglobine normale i patologice) Aplicabilitatea n cazul mai multor lichide biologice (ser dar i urin, LCR i altele), precum i faptul c pentru aceste lichide nu mai este nevoie de concentrarea lor, fiind astfel nlturat un neajuns important care fcea, de multe ori, impracticabila metod pentru electroforeza proteinelor urinare, din LCR i din alte fluide hipoproteice