Marele avantaj al tehnicilor PCR l reprezint faptul c permite obinerea unei

cantiti mari dintr-o anumit secven ADN, fr a necesita clonarea acesteia n

prealabil ntr-o molecul de tip vector. Pe de alt parte, tehnologia PCR a revoluionat i
implicarea geneticii moleculare n domenii n care se apeleaz la cantiti foarte mici de
ADN.
PCR-ul este una dintre tehnicile care au revolu ionat biologia molecular, fiind
utilizat ntr-o palet foarte variat de aplica ii. n continuare vom prezenta cteva din
aplicaiile PCR.

Identificarea unui fragment clonat de ADN. Primerii utilizai n tehnologia PCR pot fi
construii avnd secvene complementare cu secven ele (vectorul) care ncadreaz
fragmentul clonat. Analiza produilor PCR ntr-un gel de agaroz permite
identificarea direct a fragmentului de inser ie.

PCR-ul permite trierea i identificarea (screening-ul) unei biblioteci de gene, pentru

o anumit secven. Metoda cunoscut ca STS-PCR (Sequence Taqqed SitePCR)
constituie o alternativ la tehnica de identificare bazat pe hibridarea ADN-ului (dotblot). Aceasta const n amplificarea unui fragment de AND a crui secven este
cunoscut (fragmentul STS) , folosind ca AND pentru amplificare colec ia de clone
(fiecare separate) n care se sper s se identifice fragmentul. Din clona pozitiv

(care se amplific), se prepar noi clone individuale, care sunt supuse unui nou
screening, n urma cruia fragmentul STS este identificat cu precizie.

Amplificarea de secvene specifice din genomul uman. Un exemplu n acest sens l

constituie secvenele Alu. Genomul uman conine numeroase secvene repetitive,
inserate n diferite locuri. Una din aceste secven e repetate, este secven a Alu, care
este prezent ntr-un numr foarte mare de copii n genom: pn la 900.000 de
copii. (Aceast secven este prezent de asemenea i n genomul altor mamifere).
Secvena Alu care are circa 300bp, este foarte variabil, ns con ine i o secven
care este spicific genomului uman. Alu-PCR este o tehnic pus la punct de ctre
D.L. Nelson i colab.(1989), n scopul identificrii ADN-ului uman aflat n combina ie
cu ADN-ul altor specii. Pentru aceasta se folosesc doi primeri care sunt

complementari, unul fa de cellalt, motiv pentru care nu pot fi folosi i mpreun.

Folosii separat, acetia se ataeaz la secvenele lor de legare din secven a Alu,
ale crei copii, mprtiate prin genom, se pot afla n ambele orientri. Dac dou
secvene Alu consecutive sunt n sensuri opuse pe cele dou catene, primerii se pot
lega i ei n sensuri opuse pe acestea i pot ini ia amplificarea segmentului pe care l
flancheaz.

Producerea de probe marcate de ADN pentru Southern blotting sau FISH. n mod
tradiional probele marcate pentru Southern blotting i FISH se ob in prin marcarea
unui fragment clonat, translaia tieturii (nick translation), ata area ntmpltoare a
primerilor (random priming) sau marcare prin completare cu a doua caten (fil-end
labeling). Tehnica PCR ofer ns, o alternativ mai simpl. Folosind primeri care
flancheaz fragmentul ce va constitui proba i un nucleotid marcat (n raport molar
de 1:10 cu cel nemarcat) n amestecul de nucleotide, PCR-ul va amplifica
fragmentul prob, care n timpul sintezei, va ncorpora nucleotidele marcate.

Producerea de ADN monocatenar n vederea determinrii secven ei . Aa numita

reacie PCR asimetric. ADN-ul dublu catenar este produs pn cnd primerul, care
este

n cantitate mai mic, este folosit n totalitate. Cellalt primer continu s

iniieze sinteza n ciclurile urmtoare, dar numai a uneia din cele dou catene.
Amplificarea monocatenei nu mai decurge geometric, ci liniar. Cantitatea final va fi
suficient de mare pentru metoda de secveniere Sanger.

RT-PCR (reverse transcription PCR) este folosit pentru studierea exprimrii genelor.
Cantitatea de ARNm dintr-o celul este considerat, n general, ca o reflectare a
activitii acelei celule, iar cuantificarea ARN-ului mesager permite aprecieri asupra
modificrilor survenite n exprimarea genelor. Aceast cuantificare poate fi fcut
prin analiza NORthern blotting, dar aceasta este valabil n general, numai pentru
acele molecule de ARN care sunt relativ abundente n celul. Moleculele de ARN
rare nu sunt detectabile prin metode de hibridizare. Tehnica PCR fiind mult mai
sensibil, permite ca studiile de expresie genic s fie extinse i la gene mai pu in
active, care adesea sunt foarte importante. Deoarece PCR folose te o ADN
polimeraz nu poate amplifica direct moleculele de ARN. Din acest motiv, ARN-ul
este convertit mai nti la

ADN c

(complementar) monocatenar

, cu ajutorul enzimei revers-

transcriptaza. ARN-ul este degradat iar ADN-ul complementar este amplificat printr-o
tehnic de PCR standard. Cuantificarea expresiei genice se bazeaz pe
presupunerea c se pstreaz o proporionalitate ntre cantitatea de ADN de la
nceputul reaciei i cantitatea produsului de amplificare. O apreciere a cantit ii de
ARNm, prezent nainte de transcrierea invers, poate fi fcut prin compararea
intensitilor benzilor ntr-un gel de agaroz, la o serie de controale produse prin
amplificarea unor cantiti cunoscute de ADN. Aceast metod poate fi foarte

valoroas

pentru

studierea

expresiei

genice

la

organismele

transgenice

Mutageneza prin PCR. Toate metodele de mutagenez bazate pe PCR au la baz

fenomenul de mprechere greit dar inten ionat a primerilor. Dac primerii sunt
excesiv de lungi, depind lungimea secvenei de legare cu cteva baze nepotrivite,
se va genera o mic regiune de mprechere gre it. ADN polimeraza va elonga
primerul mprecheat greit, incluzndu-l n catena nou, ce va sevi drept matri n
ciclul urmtor. Viitoarea matri va conine astfel secven a de legare gre it. Ca
urmare, aceast mutaie va fi amplificat n urmtoarele cicluri ale PCR.

Tehnica PCR folosit n diagnoticul clinic. Exist foarte multe aplicaii ale tehnicii
PCR n medicin. Amplificarea ADN-ului viral sau bacterian n probe umane, permite
adesea ca diagnosticul unei infecii s fie fcut nainte de nceperea simptomelor (de
exemplu SIDA). PCR poate detecta , de asemenea, anumite muta ii asociate unor
boli. De exemplu PCR a fost folosit cu succes pentru diagnosticul prenatal al talasemei, cauzate de o deleie de 23kb. Folosind ca i control gene normale, PCR
poate detecta absena unei gene, dele ia unui fragment dintr-o gen sau transloca ii

(mrimea diferit a produsului de amplificare, eviden iat n gel, n raport cu proba

utilizat drept control). Aceeai prob poate fi verificat, pentru mai multe muta ii
poteniale, prin folosirea n aceeai reac ie a mai multor perechi de primeri.
Rezultatul poate fi amplificarea de fragmente multiple. O asemenea ncercare a
reuit n cazul detectrii de mutaii multiple n gena distrofinei, care determin
distrofia muscular Duchenne. Cel pu in nou fragmente au fost amplificate n
aceeai reacie, evideniind mutaii provocatre de dele ii. PCR este folosit i pentru
monitorizarea tratamentului cancerului. Limfoamele foliculare sunt asociate cu o
translocaie ntre cromozomii 14 i 18. Tehnica PCR este capabil s detecteze
celulele canceroase ntr-o concentraie de una ntr-un million. Primerii utiliza i pentru
indentificarea translocaiei sunt concepui astfel nct s se poat ata a la
secvenele adiacente punctelor de ruptur de pe fiecare cromozom. Numai n
celulele canceroase ce conin translocaia, primerii sunt adu i mpreun i
fragmentul dintre ei este amplificat. PCR poate fi aplicat i la determinarea sexului
din celulele prenatale.

PCR este folositor i n practica tiinelor juridice. Amplifcarea de secvene

individuale specifice, cum sunt VNTR ( variable number of tandem repeats) ori STR
( short tandem repeats) sau analiza RFLP. Acestea, combinate cu PCR-ul, pot fi
folosite n analiza paterniii sau investigarea unor crime.

PCR este un instrument util pentru analiza organismelor manipulate genetic.

Prezena transgenelor poate fi pus n eviden nc din stadii timpurii ale dezvoltrii
organismelor n urma transformrii genetice. Analiza prin PCR permite trierea
organismelor , n funcie de evidenierea prezen ei sau absen ei transgenelor n
primele stadii.

Analiza genomurilor prin markeri moleculari PCR (RAPD). Random Amplified

Polymorphic DNA (DPAD sau, n traducere, ADN polimorfic amplificat la ntmplare)
este o tehnic bazat pe PCR. Ea a fost prezentat pentru prima oar n 1990. n
principiu, RAPD folosete un singur primer oligonucleotidic de secven arbitrar,
spre deosebire de un PCR standar, care folose te o pereche de primeri, de
secven specific. Dei folosirea unui singur primer este caracteristic tehnicii

RAPD, exist situaii n care folosirea simultan a doi sau mai mul i primeri, tot de
secven arbitrar, poate aduce informaii suplimentare despre genomul studiat.
Rezultatul amplificrii cu un primer (sau mai mul i) de secven arbitrar, permite ca
unul sau mai multe fragmente ADN, cu secven anonim, s poat fi amplificate.
Prin contrast, PCR strandard are ca rezultat amplificarea unui fragment intit.
Principiul RAPD este relativ simplu. Copii ale unui singur primer, de secven
arbitrar, se leag de secvenele sale complemntare. Acestea se pot gsi dispersate
prin ntreg genomul care este studiat. ADN polimeraza alunge te primerii care i-au
gsit secvena complementar i s-au ataat la matri. Modificarea unei singure
baze n genom este suficient pentru a mpiedica ata area primerului n acel loc i a
preveni amplificarea fragmentului. Aadar, analiza RAPD, poate n anumite condi ii
s detecteze modificarea unei singure baze n ADN-ul genomic. n practic,
modificrile de mrime se observ rar. n schimb, cel mai adesea, polimorfismul se
manifest prin aceea c un fragment amplificat poate fi absent sau prezent.
Polimorfismul detectat prin RAPD este folosit cu succes ca marker molecular.

Aplicaii RAPD datorit capacitii sale de a creea markeri moleculari,

RAPD este utilizat n numeroase analize genetice, ca alternativ sau ca o
completare la o alt tehnic deosebit de important ce folose te markeri
moleculari: RFLP. Spre deosebire de RFLP, RAPD ofer o imagine de
ansamblu a ntregului genom, avnd posibilitatea de a sesiza polimorfisme
mprtiate n ntreg genomul. Exemple de aplica ii:

Construirea hrilor genetice (legarea unui marker fenotipic de un

marker RAPD)

Caracterizarea identitii genetice i a rela iilor dintre indivizi, specii,

soiuri, etc.

Studii taxonomice i evolutive.

Caracterizarea molecular i identificarea de noi hibrizi la plante