Diagnostic HIV

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
Diagnosticul infeciei HIV se bazeaz pe metode serologice. Tehnicile se mpart n investigaii de
triaj (imuno-enzimatice ELISA), de confirmare (imunoamprente, radioimunoprecipitare i
imunofluorescen), de difereniere (HIV 1 / 2) i tehnici rapide de diagnostic.

1 Testul ELISA
Testul ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) este testul cel mai accesibil i mai frecvent
folosit. Tehnica folosete antigene ale nveliului i miezului HIV 1 i HIV 2. Rezultatul se
exprim n pozitiv sau negativ. Acest test folosete antigene HIV produse prin culturi
celulare sau prin metode moleculare recombinante. Antigenele solubile sunt introduse n godeuri.
Anticorpii pacientului se leag cu ele specific i sunt detectate printr-un conjugat format din
anticorpi antiumani de animal, marcai enzimatic. Prin adugarea substratului enzimatic specific
mpreun cu o substan cromogen, reacia poate fi vizualizat prin dezvoltarea unei culori
msurabile spectrofotometric. Intensitatea culorii este proporional cu cantitatea de anticorpi din
eantionul testat (figura ). Rezultatele pot fi interpretate ca pozitive, negative sau la limit
(cutoff).
Testul poate da pn la 5% rezultate false, prin erori tehnice. De aceea serologia ELISA pozitiv
trebuie confirmat prin folosirea altor teste ELISA bazate pe alte principii, (reactivitate repetat),
urmate fiind de un test de confirmare tip Western Blot (WB). Testele fals pozitive apar la indivizi
cu boli de colagen, hepatite cronice, malarie i la persoane cu anumite fenotipuri HLA.

Interpretarea testului Elisa la 3 pacieni

Testul ELISA este un test de triaj, care are foarte puine rezultate fals negative. Este primul test
care se efectueaz pentru depistarea unei infecii HIV. Rezultatul poate fi pozitiv (caz n care se
face confirmarea repetnd testul tot prin tehnica ELISA cu alt trus, folosind alte principii, din
alt prob de snge, iar apoi Western Blot), negativ (fr infecie HIV) i la limit (caz n care se
repet ELISA cu alt trus, folosind alte principii, din alt prob de snge).
Testul WB este un test de confirmare, cu foarte puine rezultate fals pozitive. Nu se folosete
niciodat naintea testului ELISA. Rezultatul poate fi pozitiv (caz de infecie HIV), negativ (fr
infecie HIV) i nedeterminat (caz n care se repet WB la 3 luni).
Testele rapide au o simplitate ce le fac uor de folosit, chiar de ctre orice categorie de personal
i n lipsa unor laboratoare scump echipate.

2 Testul Western Blot (WB)

Testul Western Blot (WB) permite identificarea individual a anticorpilor anti-HIV specifici
antigenelor virale. Antigenele sunt separate prin electroforez i transferate pe membrane de
nitroceluloz care se incubeaz cu serul pacientului. Anticorpii din ser leag specific proteinele
virale i sunt identificai prin comparare cu controale standard. n general, o prob este pozitiv
dac prezint benzi pozitive pentru cel puin dou din cele trei antigene majore gag, pol, env.
Criteriile CDC recomand cel puin 2 din urmtoarele benzi: p24, gp41 sau gp160/120 pentru un
test pozitiv sau nici una pentru un test negativ i prezena oricrei alteia pentru un rezultat
indeterminat (figura ).

Interpretarea testului Western Blot la 3 pacieni

3 Testele rapide
Testele rapide conin suspensii microscopice de particule (latex, gelatin, hematii tanate) cuplate
cu antigen viral. Anticorpii din serul testat aglutineaz aceste particule care formeaz un depozit
care poate fi citit cu ochiul liber sau la microscop dup numai 5 minute. Aceste teste sunt utile
n zone endemice, dac este necesar rapiditatea n orientarea diagnosticului serologic (nu
necesit echipamente speciale), mai ales dac sunt efectuate de persoane cu experien.

4 Teste directe (virusologice)

Replicarea viral poate fi demonstrat prin: evidenierea i dozarea antigenului p24, detectarea
unor secvene genomice prin amplificare genic i prin izolarea virusului. Aceste tehnici
evidentiaz infecia n timpul ferestrei imunologice (seroconversiei).

5 Determinarea antigenului p24

Aceast metod determin i/sau msoar cantitatea de antigen p24 liber din plasm sau
supernatantul din culturi celulare. Antigenemia p24 are valori mai mari iniial i apoi mai mici,
tardiv n timpul infeciei cu HIV. Este folosit o tehnic ELISA de tip sandwich, n care
anticorpii anti-p24 se gsesc n godeuri i se incubeaz cu serul sau plasma pacientului.
Antigenul liber se leag specific i este msurat intensitatea culorii. O caracteristic a infeciei
cu HIV este coexistena antigenului p24 cu anticorpii anti-p24 pe tot parcursul bolii, n
concentraii diferite. Creterea antigenului p24 la valori detectabile n faza de seroconversie sau
n faze terminale limiteaz utilizarea acestui test numai n aceste perioade.
Determinarea antigenului p24 se efectueaz prin metode de tip ELISA - deci este o metod
ieftin i nu necesit echipament sau laborator special. Permite diagnosticul precoce al infeciei
HIV, n special n supravegherea transmiterii verticale a HIV. Este un factor de prognostic
nefavorabil ce reflect replicarea viral intens.

6 Reacia de polimerizare n lan (PCR)

Reacia de polimerizare n lan (PCR) este deosebit de util n diagnosticul multor infecii,
inclusiv HIV. Tehnica const n amplificarea ADN existent n cantiti foarte mici printr-o serie
de cicluri replicative. Reacia PCR se bazeaz pe dou proprieti fundamentale ale ADN:
denaturarea/refacerea ADN dublu catenar prin creterea/scderea temperaturii i
complementaritatea bazelor purinice i pirimidinice ce alctuiesc catenele ADN, permind astfel
refacerea prin complementaritate cu orice alt caten ADN de aceeai lungime sau mai scurt.

Oligonucleotidele introduse n reacie (primeri de replicare) sunt atent selectate, astfel nct s fie
complementare cu secvene bine determinate din ADN int.
Tehnica PCR se poate aplica i pentru ARN. Acesta este reverstranscris n ADN, care se
amplific ulterior. Pentru HIV se folosesc ADN viral, ARN genomic i ARNm. Creterea ADN i
ARNm viral reprezint un marker important de progresie a bolii.
Problema PCR este contaminarea ADN-ului int care poate duce la rezultate fals-pozitive chiar
i n laboratoarele cele mai bune, deoarece procesul de amplificare este exponenial. Metoda este
folosit i pentru diagnosticul precoce al infeciei cu HIV.
Determinarea ARN-ului sau ADN-ului viral plasmatic ofer informaii despre ncrctura viral.
Cuantificarea acesteia este util n:
- diagnosticul infeciei, ndeosebi la nou-nscuii din mame seropozitive;
- urmrirea evoluiei bolii;
-evaluarea eficacitii diverselor tratamente antiretrovirale

7 Monitorizarea imunologic
Numrul CD4 este unul dintre markerii stadiului de infecie. CD4 i CD8 se determin cu
ajutorul anticorpilor monoclonali specifici marcai fluorescent sau cu alte metode. Folosirea
flow-cytometriei (figura 16) permite calcularea procentului de celule care exprim markeri CD4
sau CD8. Numrul absolut de CD4 poate fi determinat din formula:

CD4 absolut = numr total leucocite x procent limfocite x procent CD4

Numrul de CD4 se folosete n stadializare, dei procentul de CD4 este mai puin supus
fluctuaiilor. Valorile normale pentru procentul de CD4 sunt de 40% pn la 70%, iar valoarea
absolut variaz ntre 500 i 1600/mm3 la adult.
Variabilitatea CD4 n timp poate reprezenta o problem. Variaia diurn prezint diferene de
chiar 150 300/mm3 de dimineaa pn seara la persoane sntoase. Timpul lung de la recoltare
pn la msurare sau congelarea probei ridic artificial valoarea CD4.
Alt metod de urmrire a pacienilor este raportul CD4/CD8. La persoane neinfectate
acest raport are valori ntre 1 i 2.

Exempl
u de rezultat prin tehnica flowcitometric

8 Interpretarea testelor
Singurul marker biologic, care are valoare n supravegherea imunologic a pacienilor
seropozitivi, este subpopulaia limfocitar CD4, ce se poate determina cantitativ i procentual.
Istoria natural a infeciei cu HIV are semnificaie deosebit n interpretarea testelor. Timpul
mediu de la momentul infectant la seroconversie este de 2,1 luni, 95% din pacieni avnd
anticorpi la 6 luni de la infectare.
n infecia acut se produce o replicare viral accentuat, evideniat prin nivele mari de ARN
viral plasmatic sau de antigen p24. Dup infecia acut, anticorpii devin detectabili i titrul lor
crete rapid. Odat rspunsul imun instalat, el rmne de obicei detectabil toat viaa.
Creterea anticorpilor se asociaz cu o scdere a nivelului de antigen p24 i a viremiei
plasmatice. Acestea din urm vor crete din nou n fazele tardive ale bolii. Totui ncrctura
viral msurat prin PCR cantitativ poate fi urmrit pe tot parcursul bolii. Replicarea viral are
loc n toate stadiile infeciei cu HIV.
Numrul de CD4 scade n timpul infeciei acute i seroconversiei (ca n toate infeciile virale),dar
revine apoi la normal. n civa ani acest numr scade.
Orice discuie despre testele folosite trebuie s in cont de sensibilitate, specificitate, valoare
predictiv pozitiv i negativ. Sensibilitatea se refer la capacitatea de a depista o modificare
particular printre persoanele care au cu adevrat acea modificare. n contrast, specificitatea este
capacitatea de a depista persoanele care nu au acea modificare n populaia neafectat. Aceti
parametri depind de testul folosit, nu de populaia pe care au fost folosite testele. Valorile
predictive pozitive sau negative se refer la puterea testului de a prezice corect cine are sau nu
acea modificare i sunt legate de prevalena modificrii n populaia testat.
Rezultatele fals negative pot apare n perioada de fereastr imunologic pn la
seroconversie. Din fericire aceast perioad este scurt. Alte cauze de reacii fals negative includ
transplant de mduv osoas sau truse de anticorpi numai anti-p24.
Rezultate fals-pozitive pot apare prin reacii ncruciate cu ali anticorpi, cum ar fi cei
contra antigenelor leucocitare de clasa II. Aceti anticorpi se gsesc mai ales la femei multipare
sau la cei care au primit transfuzii multiple. Exist i ali autoanticorpi care pot da rezultate falspozitive.
Rezultatele fals-pozitive ale testelor ELISA pot fi corectate prin Western Blot. Exist i teste
Western Blot fals-pozitive, dar frecvena acestora este mult mai mic. Anticorpii anti antigen
HLA clasa I pot da benzi false gp41, iar cei clasa II pot da benzi false p31.
O alt situaie dificil este interpretarea unui profil Western Blot indeterminat. Dac datele
clinice i epidemiologice contrazic rezultatul, se recomand retestarea n alt laborator. n situaia

aceluiai rezultat, persoana va fi retestat la 3 i 6 luni pentru a se stabili dac nu se afla n

perioada de seroconversie n timpul testrii.
Genomconversia precede seroconversia i evit falsele negativiti nregistrate timpuriu, n
cursul ferestrei imunologice. nainte i dup seroconversie, individul este infectant.
Un rezultat pozitiv nu se comunic dect dup confirmarea prin metoda Western Blot.
Testul ELISA (numai pentru confirmare i WB) este singurul test care poate fi recomandat i de
ali specialiti dect infecioniti.

9 Diagnosticul infeciei HIV

Cazul raportat ca infecie HIV trebuie s ntruneasc oricare din urmtoarele criterii: de laborator
sau clinic. Criterii de laborator:
dou testri pozitive efectuate cu truse de tip ELISA, la dou probe de snge prelevate
separat, urmate de confirmare cu Western Blot, sau
rezultat pozitiv la oricare din urmtoarele teste virologice pentru HIV: detectarea acidului
nucleic prin PCR (ADN sau ARN), antigen p24, izolarea HIV (cultur viral).
Criterii clinice (dac nu sunt ntrunite criteriile de mai sus): boli definitorii SIDA la care
diagnosticul a fost stabilit prin criterii de certitudine.
Pentru copiii cu vrsta mai mic de 18 luni, nscui din mame HIV pozitive, diagnosticul este
mai complex i nu ntotdeauna definitiv:

diagnostic definitiv de infecie HIV dac copilul are un rezultat pozitiv, din alt
snge dect cel din cordonul ombilical, la oricare din urmtoarele teste virologice pentru
HIV: detectarea acidului nucleic prin PCR (ADN sau ARN), antigen p24, izolarea HIV
(cultur viral) sau are o boal definitorie SIDA.

diagnostic prezumptiv de infecie HIV dac copilul nu ntrunete criteriile

definitive pentru infecia HIV, dar are rezultate pozitive la un singur test virusologic pentru
HIV (din cele enumerate mai sus) cu excepia sngelui din cordonul ombilical i nu are
ulterior teste negative virologice pentru HIV sau de detectare a anticorpilor anti-HIV.

diagnostic definitiv de neinfectat HIV dac copilul nu ntrunete criteriile

pentru infecia HIV, dar are cel puin 2 teste negative pentru anticorpi antiHIV din probe
separate sau obinute la vrst > 6 luni, sau cel puin 2 teste virusologice negative din probe
separate, amndou fiind obinute la o vrst > 1 lun, iar cel puin una dintre ele la vrsta de
> 4 luni i nici un alt semn de infecie HIV, clinic sau de laborator (adic nu a avut nici un
test virusologic pozitiv, dac a fost efectuat, i nu a avut o boal definitorie SIDA).

 diagnostic prezumptiv de neinfectat HIV dac copilul nu ntrunete criteriile

pentru status-ul definitiv de neinfectat, dar care are un test ELISA negativ obinut la vrsta
> 6 luni i nici un test virologic pozitiv (dac a fost efectuat), SAU un test virusologic negativ
efectuat la vrsta > 4 luni i nici un test virusologic HIV pozitiv (dac a fost efectuat), sau un
test virusologic pozitiv cu cel puin 2 teste virusologice ulterioare negative, din care cel puin
unul este efectuat la vrsta de > 4 luni; sau rezultate negative la testul anticorpi antiHIV, din
care cel puin unul este efectuat la vrsta de > 6 luni.

diagnostic de infecie HIV indeterminat dac nu ntrunete criteriile pentru

infecie HIV sau criteriile pentru neinfectat HIV (se aplic i copiilor cu un test de anticorpi
anti-HIV pozitiv i fr manifestri de boal definitorie SIDA sau cu mame netestate).

Problem: "Fereastra de diagnostic"

Dup ce infecia cu HIV a avut loc, este nevoie de cteva sptmni nainte ca anticorpi sa
devina detectabili. Acest fenomen se numete "fereastra de diagnostic" i este determinta
de perioada de timp in care organismul necesit pentru a produce niveluri detectabile de
anticorpi. (Busch 1997).
Trecerea de la anticorpi-negativ la anticorpi pozitivi-se numete
"seroconversie". Testele de screening utilizate n prezent sunt n msur s recunosca
o infectie HIV la ase sptmni dup infecie primar n proportie
de80% i dup sptmna 12 n proportie de100% din cazuri, numai n cazuri foarte rare se
ajunge si pana la 6 luni pentru recunoastrea unei infectii..
Testele de screening de a patra generaie ncearc s scurteze durata de , prin
detectarea anticorpilor HIV i a antigenului p24HIV simultan (Grtler
1998, Ly 2001).
Christian Hoffmann, Jrgen K. Rockstroh, Bernd Sebastian Kamps, HIV Medicine
2007 15 edition capitolul 3 paginile 49-50