Suport LP Imunologie 2013-2014 PDF

UMF Carol Davila Bucureti Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie
Facultatea de Medicin Dentar Anul de studii: III
SUPORT PENTRU LUCRRILE PRACTICE

DE IMUNOLOGIE
CAPITOLUL 1. ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUN

Imunologia este tiina biomedical ce studiaz funcia de aprare a organismului i
bolile produse prin dereglarea sistemului imun:
Alergia = rspunsul imun fa de un alergen (ex: astmul bronic)
Autoimunitatea = rspuns anti-self (ex: screloza multipl)
Rejecia grefei = rspunsul imun fa de esutul transplantat
Imunodeficiena = rspunsul imun deficitar (ex: SIDA)
Imunologia clinic urmrete:

Imunosupresia = tratamentul bolilor autoimune
Imunostimularea = intervenii imunoterapeutice (ex: vaccinuri)
Sistemul imun asigur aprarea organismului fa de:

Agresorii externi de natur biologic: bacterii, virusuri, parazii, fungi, celule strine
Propriile molecule sau celule modificate, cum sunt celulele infectate i celulele
neoplazice
Celulele sistemului imun

Celulele sistemului imun sunt distribuite difuz n tot organismul:
La porile de intrare: tegumente i mucoase bucal, respiratorie, digestiv,
genital
n interstiiul organelor interne: ficat, plmni, rinichi
2013-2014 1
n sistemul circulator: snge i limf
n cavitile seroase: pleur, peritoneu, pericard
n sistemul nervos central
Exist structuri specializate, aflate n organele limfoide, care au roluri eseniale
pentru buna funcionare a sistemului imun.
Organele limfoide sunt:

organe limfoide primare (centrale) - n care se formeaz leucocitele i se
matureaz limfocitele: mduva hematogen i timusul; la adult, mduva
hematogen este sursa tuturor leucocitelor din organism
organe limfoide secundare (periferice) - organele care capteaz agenii
patogeni i unde exist un mediu favorabil interaciunii ntre acetia i limfocite:
ganglionii limfatici, splina, esutul limfoid asociat mucoaselor MALT (mucous
associated lymphoid tissue), esutul limfoid de la nivel cutanat SALT (skin
associated lymphoid tissue)
Principalele celulele efectoare ale sistemului nnscut sunt polimorfonuclearele

(n special cele neutrofile), macrofagele (MF) i celulele natural killer (NK). Macrofagele
i polimorfonuclearele sunt celule fagocitare. Celulele NK au activitate mpotriva celulelor
proprii infectate viral i celulelor tumorale.
Limfocitele sunt celulele eseniale pentru sistemul adaptativ.

Limfocitele recunosc specific antigenele pentru c au pe suprafa receptori cu
structuri complexe. Un limfocit prezint pe membran un anumit tip de receptor care
recunoate o singur structur antigenic. Nu exist limfocite care s recunoasc mai multe
tipuri de antigene.
Organismul vine n contact n timpul vieii cu un numr foarte mare de antigene
diferite, de ordinul milioanelor, astfel c este necesar existena unui numr foarte mare de
subpopulaii limfocitare care s aib pe suprafa o varietate la fel de mare de receptori.
Practic, n organism exist zeci de milioane de subpopulaii limfocitare, care difer prin
structura receptorilor de recunoatere a antigenelor.
O subpopulaie de limfocite are pe suprafa acelai tip de receptor pentru antigen i
deci recunoate acelai antigen. Aceast subpopulaie sau familie rezult dintr-o singur
celul mam i se numete clon de limfocite. O clon de limfocite cuprinde un numr
foarte mare de limfocite identice. Diferenierea clonelor se face prin reorganizarea
aleatorie a genelor care codific structura proteic a receptorilor pentru antigen.
Astfel, rspunsul imun antigen specific este asigurat de: LB, LT i APC (antigen
presenting cells), iar rspunsul imun antigen nespecific de: MF, neutrofile, NK.
2013-2014 2
Celulele APC se mpart n:

profesioniste a cror funcie principal este procesarea i prezentarea
antigenelor ctre LT helper: MF, celule dendritice i LB
ocazionale care, n anumite condiii, sub influena unor citokine exprim pe
suprafa MHC II: fibroblaste, celule gliale, celule pancreatice, celule epiteliale
timice i tiroidiene, celule endoteliale
APC sunt celule cu rol esenial n generarea RIU i RIC fa de antigenele

timodependente, care sunt cele mai frecvente n natur. APC sunt singurele celule care pot
recunoate antigenele timodependente n form nativ. APC prelucreaz aceste antigene,
selecteaz cele mai imunogene fragmente i le prezint limfocitelor.
Efectele sistemului imun

Efectele sistemului imun sunt pozitive, prin protecie mpotriva structurilor non-
self i eliminarea selfului alterat. Efectele negative sunt date de disconfortul generat de
sindromul inflamator i afectarea selfului (autoimunitatea).
Inflamaia este o reacie nespecific de aprare a organismului, cu caracter local sau

general, n funcie de severitatea i de ntinderea leziunilor produse de factorii patogeni.
Cnd factorul patogen are o intensitate mic sau moderat, reacia inflamatorie este un
proces local. Dac el are intensitate mare i produce leziuni tisulare importante, se
activeaz mecanismele de aprare din ntregul organism i apare reacia sistemic
postagresiv (RSPA).
Reacia inflamatorie se declaneaz cnd agenii patogeni au o intensitate suficient
de mare pentru a produce leziuni tisulare.
Din punct de vedere morfopatologic inflamaia cuprinde fenomene alterative i
reacionale. Fenomenele reacionale sunt de tip vascular-exudativ i proliferativ (de
reparaie).
Starea de disconfort a pacientului este dat de vasodilataie i creterea
permeabilitii capilare. n acest fel, histamina particip la formarea exudatului inflamator,
manifestat prin semnele clinice: tumor, rubor, calor. Hiperemia explic dou din semnele
clinice de baz ale inflamaiei: roeaa zonei inflamate (rubor) i creterea temperaturii
locale (calor). Acidoza din focarul inflamator stimuleaz n exces terminaiile nervoase
libere (TNL), declannd senzaia dureroas (dolor).
2013-2014 3
Tipuri de rspuns imun

IMUNITATEA NESPECIFIC IMUNITATEA SPECIFIC
( NNSCUT) (DOBNDIT)
- Antigen independent - Antigen dependent

- Fr timp de laten - Cu timp de laten
- Nu este antigen specific - Antigen specific
- Nu apare memoria imunologic - Apare memoria imunologic
BARIERE FIZICE
- Piele
- Mucoasa intestinal - Nu are
- Mucoasa respiratorie
FACTORI SOLUBILI
- Secreii proteice i neproteice - Ig (Ac)
CELULE
- Fagocite
- LT
- Celule NK
- LB
- Eozinofile
Celulele fagocitare
A. NEUTROFILELE
Neutrofilele provin din mduva hematogen, din celula su comun pentru
monocite i granulocite GM-CFU. Din seria granulocitar se difereniaz neutrofilele (peste
90%), eozinofilele i bazofilele.
Neutrofilele triesc n snge sub 24h, chiar dac nu extravazeaz spre un focar
inflamator. Aproximativ jumtate din ele se deplaseaz lent, rostogolindu-se pe endoteliul
vascular.
Neutrofilele sunt celule polinucleare, cu un diametru de aproximativ 12 microni, cu
o form variabil (datorit permanentei emiteri de pseudopode). Nucleul este multilobat i
prezint granulaii citoplasmatice care conin lizozim, NADPH oxidaz, lactoferin.
Neutrofilele se mai numesc polimorfonucleare neutrofile (PMN) datorit nucleului
multilobat. Reprezint 60 - 70% din totalul leucocitelor din sngele periferic.
Neutrofilele sunt primele celule care ajung intr-un focar inflamator. Sunt celule cu
rol foarte important n imunitatea innscut (nespecific).
Neutrofilele strbat endoteliul capilar (diapedez) i se deplaseaz n esuturi
(chemotactism) pentru a ajunge la nivelul focarului imun.
2013-2014 4
Neutrofilele au rol important mai ales mpotriva bacteriilor cu habitat extracelular,

pe care le fagociteaz.
Markerul membranar specific pentru neutrofile este CD67.
B. MACROFAGELE
Macrofagele (MF) provin din monocite, care se gsesc n snge, n esuturi i n
cavitile naturale ale organismului. Monocitele au originea n mduva hematogen, dintr-
un precursor comun cu PMN, sub influena M-CSF i GM-CSF.
Monocitele ader de endoteliu datorit unor molecule de adeziune de pe suprafa.
Aderarea se face numai pe anumite zone ale endoteliului, situate n vecintatea unui focar
imun. Celulele APC din focarul imun, respectiv MF i celulele dendritice, elibereaz o serie
de citokine IL-1, TNF-alfa i IFN-gama care stimuleaz celulele endoteliale din
vecintate.
Sub aciunea unor citokine (IFN i IL-2) cu rol inductor produse de limfocite,
monocitele se difereniaz, transformndu-se morfologic i funcional n MF rezidente i
apoi n MF activate. MF activate sunt capabile s ndeplineasc funcia de APC. MF tisulare
au o durat de via de cteva luni, pn la civa ani.
MF sunt prezente difuz n organism, la nivelul esutului conjunctiv i n apropierea
membranei bazale a vaselor sangvine mici. Ele se afl n numr mare n zonele unde exist
un aflux important de antigene: plmni, ficat, splin i ganglionii limfatici.
Markerul membranar caracteristic pentru MF este CD14.
Transformarea monocitelor n MF presupune schimbri importante:

Dimensiunea celulelor crete de 5-10 ori (MF au diametre de 25-50 microni).
Crete numrul i dimensiunea mitocondriilor i lizozomilor, se dezvolt
aparatul Golgi.
Crete cantitatea de enzime hidrolitice (fosfataz acid, beta-glucuronidaz,
catepsin, aril-sulfataz, lizozim, peroxidaz, colagenaz, elastaz, proteaze,
lipaze, fosfolipaze, muramidaz etc).
Devin multinucleate prin fuzionare sau prin endomitoz.
Citoplasma emite numeroase pseudopode.
Funciile principale ale macrofagelor sunt:

fagocitoza mecanism important de aprare nespecific;
procesarea i prezentarea antigenului rol de APC n aprarea nespecific;
secreia de citokine i de mediatori ai inflamaiei influeneaz att imunitatea
nnscut, ct i pe cea adaptativ;
2013-2014 5
particip la procesele de reparaie tisular prin activarea fibroblatilor;

determin moarte intra i extracelular.
MF particip la rspunsul imun datorit funciei lor de APC i asigur:

Captarea Ag - MF capteaz n special Ag corpusculate: bacterii, virusuri, parazii
mici, fragmente de celule self devenite antigenice; captarea este un proces
imunologic nespecific, adic se face la fel, indiferent de structura Ag.
Fagocitoza Ag - pseudopodele emise de MF se unesc nglobnd Ag corpusculat ntr-
o vacuol numit fagozom.
Prelucrarea Ag - fagozomul se unete cu lizozomii din citoplasma MF; Ag nativ
endocitat este fragmentat de enzimele din lizozomi; din fragmentele rezultate este
ales fragmentul cel mai imunogen, care se numete epitop.
Conservarea epitopilor - n MF se conserv o cantitate mic din epitopi, care sunt
eliberai progresiv n urmtoarele zile; conservarea are rol n ntreinerea
rspunsului imun mai mult timp i n generarea unui rspuns imun mai intens
printr-o stimulare mai puternic i prelungit a limfocitelor.
Prezentarea epitopilor - epitopul selectat este cuplat cu moleculele MHC II i este
expus pe membrana MF; prin expunerea cuplului MHC II-epitop se face prezentarea
epitopului spre LTH.
Succesiunea de evenimente care determin rspunsul celulelor fagocitare n infecii:
aderarea vascular diapedeza chemotaxia activarea fagocitoza i moartea celular
C. CELULELE KILLER NESPECIFICE

NK (natural killer) i LAK (celule killer activate de limfokine)
K
MF activate
Eozinofilele
CELULELE NK
NK fac parte din grupul mai numeros al limfocitelor mari, numite i non-B non-T.
Limfocitele non-B non-T au morfologie de LGL (large granular lymphocytes). NK au mai
mult citoplasm dect limfocitele mici.
2013-2014 6
NK au rol n imunitatea nnscut sau nespecific. Ele intervin n primele momente

ale unei infecii virale i elimin o parte dintre celulele self infectate. n acest mod ele ofer
organismului rgazul pentru proliferarea clonelor de LB i LT Ag-specifice, care vor eradica
infecia. De asemenea, celulele NK recunosc i distrug celulele tumorale. Recunoatererea
celulei int este imunologic nespecific.
Markerii membranari caracteristici pentru NK sunt CD56 i CD16.
Celulele NK activate de IL-2 i IFN-gama se transform n LAK (Limfokine Activated
Killer).
Recunoaterea celulei int de ctre NK

NK recunosc celula int nespecific, prin mai multe mecanisme:
recunoaterea nespecific mediat prin IgG: NK prezint pe suprafa receptori
FcR, prin care recunosc i distrug celulele opsonizate cu IgG.
recunoaterea prin receptori de tip lectinic: pe suprafaa celulelor infectate viral
apar structuri glicoproteice cu greutate molecular mare. Aceste structuri sunt
recunoscute prin receptori cu structur lectinic de pe membrana NK.
recunoaterea direct prin NK-R: se presupune c pe suprafaa NK se afl
receptori NK-R care recunosc o structur prezent fiziologic pe membrana
tuturor celulelor somatice din organism. La celulele sntoase aceste structuri
int sunt mascate de moleculele MHC I. Probabil c la celulele infectate viral sau
malignizate scade expresia membranar a MHC I i se demasc ligandul
membranar pentru NK, care se ataeaz de celule i le distruge.
Distrugerea celulei int prin citotoxicitate extracelular

LTC i NK realizeaz liza celulei int prin mecanisme asemntoare, prin eliberarea
unor mediatori care produc leziuni ale membranei i apoptoz. Mediatorii sunt coninui n
granulaiile vizibile n LTC activate i n NK. Cei mai importani mediatori citotoxici sunt:
perforina, limfotoxina, granzimele i TNF.
CELULELE KILLER
Celulele K sunt celule nedefinite morfologic, care au receptor de tip Fc pentru IgG
(de foarte mare afinitate) i recunosc intele mpachetate n anticorpi.
Activarea celulelor NK i K nu produce memorie imun. Nu exist diferene ntre
rspunsul imun primar i secundar. Celulele K interacioneaz cu celula int prin
intermediul receptorilor Fc. Celula tumoral tapetat cu IgG este astfel uor recunoscut
de celulele K. Ele se activeaz i lizeaz celula int.
2013-2014 7
D. CELULELE DENDRITICE
Celulele dendritice sunt specializate n prezentarea antigenelor. Se caracterizeaz
printr-o structur arborescent, cu un corp celular cu puin citoplasm perinuclear i
numeroase prelungiri ramificate care ptrund printre celulele din jur. Aceste pseudopode
au un aspect caracteristic care a fcut s fie comparate cu dendritele neuronilor. Datorit
lungimii lor, pseudopodele celulelor dendritice permit supravegherea unor spaii ntinse de
esut cu ajutorul unui numr relativ mic de celule.
Celulele dendritice au rol de APC pentru c pot s capteze i s prezinte antigenele.
Ele au pe suprafa principalii receptori implicai n funcia de APC: CR (receptori pentru
fragmentul C3b al complementului), FcR i pot s sintetizeze moleculele MHC II. Celulele
dendritice ndeplinesc n cadrul rspunsului imun urmtoarele funcii:
capteaz antigenele de la porile de intrare
transport antigenele spre organele limfoide secundare - ganglioni limfatici i
splin
prezint n organele limfoide secundare antigenele spre LB i LT
Pe parcursul desfurrii funciei lor imunologice, clasele de celule dendritice se
transform una n alta. Se consider n prezent c o celul dendritic i schimb
morfologia n funcie de teritoriul unde se gsete. Exista 4 tipuri principale de celule
dendritice:
celulele Langerhans
celule dendritice interstiiale
celulele dendritice foliculare
celulele dendritice limfoide
Hematopoieza
Hematopoieza este procesul prin care iau natere celulele sangvine mature,
funcionale, iniiat n viaa intrauterin i cantonat n final la nivelul mduvei osoase.
Necesit celule de origine i micromediul hematopoietic.
Celule hematopoietice (de origine) se mpart n 3 grupe: celule stem pluripotente
(CSP), celule progenitoare hematopoietice i celule hematopoietice ale seriilor sangvine.
n luna a 5-a fetal, n dou sptmni, cavitile osoase sunt populate cu celule
stromale. Celulele hematopoietice migrate din ficat traverseaz pereii vaselor sinusoidale
i formeaz parenchimul hematopoietic.
Componentele micromediului hematopoietic sunt: celulele stromale mezenchimale,
reeaua matriceal extracelular i factorii de cretere produi de celulele stromale:
Factori de stimulare ai coloniilor granulo-monocitare (GM-CSF)
Factori de stimulare ai coloniilor de macrofage (M-CSF)
2013-2014 8
Factori de stimulare ai coloniilor granulocitare (G-CSF)
Eritropoietina, trombopoietina
Citokine: interleukinele
Micromediul din timus. Timusul este un organ limfoepitelial care are n cortex
limfocite, celule epiteliale, macrofage. Nidarea limfocitelor T se face prin atragerea n afara
vaselor de ctre 2-microglobuline i dirijarea ctre zona cu celule epiteliale. Diferenierea
i maturarea se fac n zona epitelial. Migrarea celulelor mature se realizeaz ctre zona
medular.
Migrarea celulelor stem. n viaa intrauterin migreaz din sacul vitelin n ficat,
din ficat n mduva osoas, timus splin, ganglioni limfatici. La adult CSP se gsesc n
sngele circulant i mduva osoas.
Migrarea este explicat de:
intervenia CSP n sectoarele medulare intens solicitate
cutarea de noi teritorii hematopoietice
meninerea unei rezerve de CSP n snge atunci cnd mduva este lezat
La natere singurul organ hematoformator devine mduva osoas.
n jurul vrstei de 4 ani mduva roie din diafizele oaselor lungi dispare treptat
fiind nlocuit cu celule adipoase. La 18 ani esut hematopoietic se gsete n vertebre,
stern, coaste, oasele craniene, pelvine, partea proximal a epifizelor oaselor lungi.
esutul limfatic. esutul limfatic este strns legat de formarea mduvei osoase.
Apare n plexul limfatic n sptmna a 9-a i n glandele limfatice n sptmna a 11-a. La
nivelul splinei n perioada de declin a mielopoiezei apare limfopoieza. Timusul devine
organ limfopoietic n sptmna a 9-a. Aici vin celulele stem din ficat, splin i mduva
osoas. Dup natere, esutul limfatic rmne prezent n mduva osoas, dar devine mult
mai extins n ganglionii limfatici, plcile Peyer i timus.
Teorii asupra procesului de angajare a celulelor stem:

1) Teoria stochastic angajarea celular survine la ntmplare, factorii de reglare
acioneaz doar n etapele tardive ale hematopoiezei.
2) Teoria micromediului inductor direcionarea celulei stem depinde de structura
micromediului medular din acel moment.
3) Teoria umoral angajarea depinde de factori umorali care se ntrec ntre ei
pentru fixarea pe receptorii celulelor stem.
2013-2014 9
Modul de recoltare, prelucrare, transport i stocare a probelor de snge

(dup Synevo servicii medicale de laborator)
Pregatirea pacientului
1. Recoltarea probelor se face cu pacientul n condiii bazale, naintea oricrei proceduri
diagnostice sau terapeutice (ideal ntre orele 7 i 9 dimineaa, n condiii jeun pe
nemncate); pentru evaluarea metabolismului lipidic se recomand ca recoltarea s se
efectueze dup 12 ore de la ultima mas.
2. Cnd probele de snge nu sunt recoltate n condiii bazale, trebuie inut seama de
efectele adiionale pe care le pot produce efortul fizic (chiar i efortul fizic moderat
poate determina o cretere a c% de glucoz, acid lactic, proteine serice, CK), precum i
a strii emoionale sau ritmului circadian care poate afecta anumii parametri.
3. Pacientul st ntr-o poziie comod (n poziie eznd sau n decubit dorsal).
4. Datele demografice ale pacientului trebuie s fie corect scrise pe formularul de
nregistrare de la punctul de recoltare a sngelui i recipientul de recoltare corect
etichetat.
Recoltarea sngelui venos

Sngele este recoltat prin puncie venoas, la nivelul fosei antecubitale, cu ajutorul
unui sistem vacuum: tubul este vidat n momentul imediat anterior recoltrii, eliminndu-
se riscul pierderii de vid; proporia de snge recoltat-aditiv rmne constant, fapt ce
conduce la rezultate corecte.
Probele de snge sunt recoltate cu sistemul holder-vacutainer:
naintea recoltrii sngelui, se desface acul prin rsucirea capacului sigilat. Se

nltur capacul i se expune partea filetat (1), avnd grij s nu se ndeprteze teaca
steril n care se gsete acul (2). Se asambleaz acul la holder (3). Toate tuburile (4) pot fi
acum umplute unul dup altul, n concordan cu instruciunile de mai jos:
a. Se aplic un garou pe antebraul pacientului i se neap pielea din plica cotului,
cu ajutorul degetului mare i al indexului minii drepte.
2013-2014 10
b. Se inverseaz poziia minilor ct mai curnd posibil dup ce acul a penetrat

vena; se apas vacutainerul cu degetul mare al mainii drepte, indexul i degetele
mijlocii, susinndu-l.
c. Sngele este atras de vacuumul din vacutainer i curge n tub cu vitez proprie;
se elibereaz garoul din jurul braului pacientului imediat ce sngele a aparut n
vacutainer, cu ajutorul mainii stngi, susinnd n continuare holderul.
d. Se retrage vacutainerul cu mna dreapt, apsnd uor cu degetul mare pe una
dintre marginile holderului.
e. Pentru a asigura optima omogenizare a sngelui cu anticoagulantul, se
efectueaz 8-10 micri de inversiune a tubului.
f. Daca se recolteaz mai mult de un vacutainer, se inser cel de-al doilea tub i se
repet paii descrii anterior.
2013-2014 11
Indiferent de sistemul de recoltare folosit, se respect urmtoarele manevre:

- se utilizeaz mnui sterile, de unic folosin pentru fiecare pacient cruia i se
recolteaz probe;
- se evit puncionarea n zonele n care exist leziuni cutanate;
- se dezinfecteaz zona aleas pentru puncionare cu ajutorul unui tampon steril
mbibat n soluie apoas de izopropanol 70%, prin micri circulare, din interior spre
exterior, pentru a ndeprta contaminanii;
- dup tamponare, se las s se usuce zona nainte de a trece la puncionare (dac
zona este umed, poate fi indus hemoliza probei);
- la sfritul puncionrii, se aplic imediat un tampon compresiv pentru a asigura
hemostaza i a evita formarea hematomului (durata recomandat a compresiei este de 5
mininute);
- la sfrit se acoper zona cu un pansament steril;
- acul de puncie nu va fi reintrodus n teac (pentru a evita neparea), ndoit sau
tiat, ci va fi depus ntr-un container de plastic rezistent la reziduuri neptoare sau
tietoare.
Aditivi utilizai
Pentru a mpiedica procesul de coagulare a sngelui integral, unele vacutainere
conin substane anticoagulante; anticoagularea se produce fie prin legarea Ca2+ (EDTA,
citrat de dextroz), fie prin inhibarea trombinei (heparinat de litiu sau sodiu, hirudin).
Pentru a nu exista nicio confuzie n identificarea tubului de recoltare, capacele
vacutainerelor sunt colorate diferit, n funcie de aditivul folosit. Codurile de culoare pentru
substanele anticoagulante sunt descrise n ISO/DIS 6710:
1. Capac mov/roz - folosete ca anticoagulant EDTA i are utilitate n hematologie,
biologie molecular, unele teste imunochimice (ex. ACTH).
2. Capac bleu/verde - conine Citrat 9+1 i se folosete pentru analiza coagulrii.
3. Capac negru/mov - conine Citrat 4+1 i se folosete pentru VSH.
4. Capac verde/portocaliu - conine Heparinat i se utilizeaz plasm pentru testele
de biochimie.
5. Capac rou/incolor - este un tub fr anticoagulant. Serul este folosit pentru
testele de chimie, imunologie i serologie.
Unele vacutainere destinate obinerii serului conin un activator de coagulare (care

accelereaz formarea cheagului) i un gel separator, care permite meninerea serului dup
centrifugare n tuburile primare, n cursul fazei preanalitice (transport ctre laborator),
analitice i postanalitice (stocarea probelor n laborator).
2013-2014 12
Ordinea recoltrii tuburilor

n cazul n care este nevoie s se obin mai multe probe dintr-o singur flebotomie
(puncie venoas), se recomand s se respecte urmtoarea ordine de recoltare a tuburilor:
1. recipientele pentru hemocultur;
2. tuburile fr aditivi;
3. tuburile ce conin citrat;
4. tuburile ce conin heparin;
5. tuburile ce conin EDTA.
Volumul optim de prob

Una din erorile cel mai des ntlnite este trimiterea la laborator a unei cantiti
insuficiente de prob. Pentru a v asigura c exist un volum adecvat de prob, se
recolteaz ntotdeauna snge ntr-o cantitate de 2 ori i jumtate mai mare dect volumul
necesar efecturii unui anumit test (la fiecare test este precizat volumul minim de ser sau
plasm necesar procesului analitic).
n acelai timp, trebuie s se evite recoltarea excesiv de snge, n special la
vrstnici, copii mici, pacieni internai n seciile de terapie intensiv.
n cazurile frecvente, n care pacienilor le sunt indicate mai multe teste, se ine cont
de urmtoarele volume de snge recomandate n cazul folosirii analizoarelor automate
actuale:
- 4-5 mL snge pentru efectuarea unui profil de investigaii biochimice uzuale;
- 1 mL snge pentru efectuarea a 3-4 teste de imunochimie.
Obinerea sngelui pentru imunofenotipri

Urmrete determinarea populaiilor i subpopulaiilor celulare
Se recolteaz 2-3 mL snge venos ntr-o eprubet steril, pe anticoagulant (heparin)
Sngele se prelucreaz n maxim 6 ore de la recoltare
Metoda folosit - citometrie n flux.

Valori de referin i comunicarea rezultatelor
Buletinul final va conine intervalele de referin pentru subseturile limfocitare
adecvate vrstei pacientului mpreun cu o interpretare a rezultatelor obinute.
Trebuie cunoscut faptul c numrul absolut al populaiilor limfocitare este
influenat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatur i mediul
nconjurtor. Studiile legate de variaiile circadiane au demonstrat o cretere progresiv a
numrului de celule CD4+ n cursul zilei, n timp ce limfocitele CD8+ i limfocitele B CD19+
cresc doar n prima parte a zilei, fr a se modifica n cursul dup-amiezei.
2013-2014 13
Din acest motiv, atunci cnd se efectueaz o monitorizare seriat a populaiilor

limfocitare se recomand ca probele de snge s se recolteze n acelai moment al zilei.
Obinerea sngelui pentru determinarea activitii funcionale a Ly, Mo, Gran

Se recolteaz venos snge venos pe anticoagulant (heparin)
Se prelucreaz n maxim 4 ore
Determinarea activitii funcionale a leucocitelor este indicat n urmrirea

infeciei HIV, cu monitorizarea serial a numrului de celule T CD4+ pentru evaluarea
progresiei bolii, stabilirea indicaiei de terapie antiretroviral i de tratament profilactic al
infeciilor oportuniste, precum i evaluarea rspunsului la terapie. Este foarte important
determinarea ct mai precis a numrului absolut de celule CD4+, acest lucru realizndu-se
prin utilizarea unui numr cunoscut de microsfere (TruCount beads) la care se adaug un
volum cunoscut de prob.
Obinerea sngelui pentru tipizarea HLA (MHC)
Complexul HLA este plasat pe braul scurt al cromozomului autozom 6.
Se recolteaz 8,5mL snge venos periferic n vacutainer ce conine citrat de dextroz

(ACD). Sngele se prelucreaz n maxim 4 ore de la recoltare.
Kit-urile specifice permit tipizarea de rezoluie nalt a alelelor ntr-un singur test.
Metoda SSP (Sequence Specific Primers) se bazeaz pe tehnologia PCR care folosete
primeri specifici pentru tipizarea ADN din esuturi.
Fiecare kit de primeri specifici const ntr-un panel de primeri, fiecare coninnd o
pereche specific de primeri (specifici pentru o alel sau un grup de alele) ct i o pereche
de primeri de control specifici pentru secvenele non-alelice prezente n toate probele.
Acest control acioneaz ca un control PCR intern pentru a verifica eficiena
amplificrii PCR.
HLA = Human Leukocyte Antigen = antigene de histocompatibilitate = MHC = Major
Histocompatibility Complex = complexul major de histocompatibilitate
2013-2014 14
MHC este format din molecule solubile sau aflate pe diferite suprafee celulare, cu
roluri importante n funcionarea normal a sistemului imun.
Complexul major de histocompatibilitate este implicat n imunitatea adaptativ
(specific) avnd un rol esenial n discriminarea ntre self i nonself. De asemenea,
intervine i n imunitatea nespecific. Complexul major de histocompatibilitate mai este
cunoscut sub numele de sistemul HLA (human leukocyte antigen).
Exist 2 clase principale:

Moleculele MHC I sunt glicoproteine aflate pe suprafaa aproape tuturor
celulelor nucleate i a trombocitelor. Au rolul de a prezenta antigenele peptidice
interne limfocitelor T citotoxice. Neuronii i spermatozoizii nu prezint
molecule MHC I pe membrane. Limfocitele au pe suprafa numeroase molecule
ale complexului major de histocompatibilitate de tip I - pn la 105
receptori/celul.
Moleculele MHC II se gsesc pe suprafaa celulelor prezentatoare de antigen
(n special macrofage, monocite, celule dendritice i limfocite B). Au rolul de a
prezenta antigenele procesate de ctre aceste celule limfocitelor T helper.
Numrul moleculelor MHC II aflate pe suprafaa monocitelor i macrofagelor
neactivate este redus. Stimularea antigenic determin creterea semnificativ a
expresiei acestor receptori pe membran.
Funciile MHC I i MHC II

Moleculele MHC I i MHC II au un rol esenial n recunoaterea antigenului de ctre
limfocitele T. Aceste limfocite sunt implicate n generarea att a raspunsului imun umoral
ct i a celui celular. Spre deosebire de limfocitele B, limfocitele T nu pot recunoate dect
acele antigene prezentate n combinaii cu moleculele MHC (mecanism de restricie MHC).
Limfocitele T helper recunosc doar antigene exogene prezentate mpreuna cu MHC

II, iar limfocitele T citotoxice recunosc antigene endogene prezentate mpreun cu MHC I.
Moleculele MHC se asociaz cu fragmente peptidice care au fost procesate anterior

n diferite compartimente ale celulei:
MHC I se leag de peptide derivate din antigene endogene, care au fost
procesate n citoplasma celulei: proteine normale celulare, tumorale, virale,
proteine care provin din bacterii cu habitat intracelular.
MHC II formeaz complexe cu peptidele rezultate n urma procesrii
antigenelor exogene, care au fost internalizate prin fagocitoz de ctre celule
specializate (mai ales macrofage i celule dendritice).
2013-2014 15
Toate celulele care prezint pe suprafa receptori MHC I pot prezenta antigene
endogene limfocitelor T citotoxice. Aceast prezentare determin activarea limfocitelor T
citotoxice, cu declanarea raspunsului imun celular, care are drept finalitate eliminarea
acestor celule neoplazice sau infectate cu germeni intracelulari. Astfel, celulele care prezint
antigene prin intermediul MHC I catre LT citotoxice sunt de fapt celule int pentru acestea
din urm.
Antigenele exogene pot fi procesate i prezentate limfocitelor T helper doar de ctre
celule specializate care au pe suprafa molecule MHC II (celule prezentatoare de antigen).
Obinerea serului
- Se recolteaz 8-10mL snge venos ntr-o eprubet de centrifug
- Se introduce proba la 370C timp de 15 min, pn la completa coagulare
- Se decanteaz serul ntr-o alt eprubet de centrifug
- Serul rezultat se centrifugheaz 5 min la 3000 rpm
- Serul poate fi pstrat timp de 1-2 ani la -200C
Utilizarea antibioticelor (Ab) i antimicoticelor (Am) n mediul de cultur
Antibiograma presupune testarea sensibilitii unei tulpini bacteriene izolate dintr-

un produs patologic fa de diverse antibiotice. Astfel se caracterizeaz capacitatea
acestora de a opri dezvoltarea microbian i ofer informaii pentru selectarea celui sau
celor mai active antibiotice fa de microorganismul testat.
Antibiograma se face dup stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea n cultur
pur i prin identificarea agentului patogen. Tratamentul se realizeaz n funcie de
rezultatele date de antibiogram, alegnd antibioticul cel mai eficace, adic fa de care
bacteria izolat are cea mai mare sensibilitate.
Principiul antibiogramei const n capacitatea Ab de a mpiedica multiplicarea
bacterian, fenomen cunoscut ca efect bacteriostatic. Unele Ab au n anumite concentraii i
proprietatea de a omor bacteriile: efect bactericid.
Metode folosite pentru testarea sensibilitii in vitro la antibiotice

Metoda difuzimetric Kirby Bauer (clasic): aceasta se efectueaz pe medii solide,
n plci Petri, pe care s-a nsmnat n pnz cultura bacterian; apoi pe suprafaa
mediului se dispun discuri cu antibiotice astfel c n jurul acestora se va realiza un gradient
de concentraie prin difuziunea local a antibioticului (n imediata vecintate a discului
obinndu-se o c% mai mare de antibiotic care descrete pe msura ndeprtrii de acesta).
2013-2014 16
Se utilizeaz penicilina G (bacterii G+), streptomicina sulfat (bacterii G+/-),

gentamicina (mycoplasme, bacterii G+/-), amphotericina B (fungi).
Metoda cu antibiotic ncorporat n mediu semisolid (modern): permite

determinarea sensibilitii microbiene la un set de ageni antibacterieni/ antifungici,
ncorporate ntr-un mediu semisolid. Este alctuit din 16 perechi de godeuri, din care 2/4
nu conin antibiotice/antifungice i sunt martori de cretere. Celelalte perechi de godeuri
conin diferite antibiotice n cte dou concentraii (c = concentraie mai mica i C =
concentraie mai mare) pentru a putea eticheta fiecare tulpin testat ca fiind sensibil,
intermediar sau rezistent. Din tulpina de testat este preparat o suspensie care este
transferat n mediul de cultur cu care este inoculat galeria. Rezultatele se citesc vizual
sau automat dupa 24-48 ore de incubare la 37C.
Interpretarea rezultatelor:
Rezistena la un anumit antibiotic este evideniat prin virajul culorii spre rou
n godeurile unde microbii au crescut fr a fi deloc inhibai.
Rezistena intermediar la antibiotic este evideniat prin culoarea portocalie
din godeurile respective, unde microorganismele au fost inhibate doar la
concentraia crescut a antibioticului.
n godeurile n care microorganismele nu au crescut deloc, nici la concentraia
sczut, nici la cea crescut a antibioticelor, culoarea vireaz spre glaben i arat
sensibilitatea microbului fa de Ab respectiv.
Tehnici de biologie molecular

Reacia de amplificare enzimatic PCR
Reacia PCR (Polymerase Chain Reaction) este o metod de amplificare enzimatic
in vitro a unei anumite secvene de ADN. n prezent a fost dezvoltat o adevarat tehnologie
PCR care este folosit ntr-o varietate foarte mare de domenii: biologie molecular, tiinele
mediului, criminalistic, tiine medicale, biotehnologie, microbiologie, industria
alimentar, epidemiologie etc. Tehnica PCR imit replicarea ADN in vivo.
Variante tehnice i aplicaii ale tehnologiei PCR

diagnosticul unor boli monogenice, precum i detectarea de noi tipuri de mutaii
n gene importante n anumite boli
diagnosticul unor boli infecioase: permite detectarea particulelor infecioase
bacteriene i virale aflate ntr-o proporie mic, chiar pentru specii ce se cultiv
dificil in vitro, pentru patogeni cu variabilitate antigenic mare i pentru
2013-2014 17
patogeni ce au perioad mare de laten; astfel, pot fi identificai indivizii umani
pozitivi nainte de seroconversie
studii privind mecanismele genetice ce acompaniaz procesele maligne
(detectarea secvenei i esutului n care se exprim anumite oncogene n
diverse procese maligne)
studii de taxonomie, sistematic i filogenie molecular: obinerea rapid a unei
cantiti mari din secvene ADN cu valoare taxonomic i/sau filogenetic
biologia populaiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite
secvenierea rapid a unor molecule de ADN de la foarte muli indivizi, fr a
necesita n prealabil clonarea acestora
studii de antropologie: tehnica PCR permite n prezent recupe-rarea i analiza
unor secvene ADN din fosile
medicin legal: cu ajutorul reaciilor PCR pot fi n prezent analizate la nivel
molecular o serie ntreag de probe biologice
Materiale necesare
Tuburi PCR de 0,2/0,5 mL
Vrfuri pentru pipete automate
Materialele trebuie s fie noi i sterile
Tehnica de lucru
Se realizeaz prin combinarea unei probe de ADN cu primeri oligonucleotidici,
deoxiribonucleotidtrifosfai (dNTP) i o ADN-polimeraz termosensibil (Taq-polimeraza),
ntr-un tampon corespunztor.
Prin nclzirea i rcirea repetat a amestecului (30-40 cicluri), se obine nivelul de
amplificare dorit.
Treptele de temperatur ale unei racii PCR standard
Denaturarea iniial
Pentru ca o reacie PCR s se desfoare eficient, este foarte important ca moleculele
ADN matri s fie denaturate iniial complet. Acest lucru poate fi realizat prin
nclzirea iniial a amestecului de reacie 2 min la 94-95oC.
Treapta de denaturare din cadrul fiecrui ciclu
De obicei, este suficient o denaturare de 20-30 sec la 94-95oC, dar aceasta trebuie
adaptat funcie de termocycler i de tuburile folosite (de ex., dac se lucreaz n tuburi
de 500 L sunt necesari timpi mai lungi dect dac se lucreaz n tuburi de 200 L).
Ataarea primerilor
n marea majoritate a experimentelor, temperatura de ataare a primerilor trebuie
determinat i optimizat empiric. Alegerea acestei temperaturi reprezint unul din
factorii critici pentru asigurarea unei nalte specificiti a reaciei PCR. Dac
2013-2014 18
temperatura de ataare este mult prea nalt, nu are loc ataarea primerilor, iar dac
temperatura este prea sczut, atunci crete probabilitatea atarilor nespecifice.
Polimerizarea propriu-zis
Taq-ADN polimerizeaz aproximativ 60 baze per secund la 72 oC. n fiecare ciclu, o
perioad de polimerizare de 45 sec este suficient pentru amplificarea unor fragmente
de pn la 1 kbp. Pentru amplificarea unor fragmente mai mari de 1 kbp, timpul se
calculeaz n multiplii de 45 sec, urmat de ajustri pentru diverse matrie. Pentru a
obine o cantitate ct mai mare de amplicon, se poate varia timpul de polimerizare,
astfel:
pentru primele 10 cicluri se folosete un timp constant de polimerizare (de ex.
45 sec pentru 1 kbp)
pentru urmtoarele 20 de cicluri se crete timpul de polimerizare cu 2-5 sec per
ciclu (de ex. 50 sec pentru ciclul 11, 55 sec pentru ciclul 12 etc.).
O asemenea mrire progresiv a timpului de polimerizare ofer enzimei mai mult
timp pentru polimerizare, pentru c pe msur ce reacia PCR avanseaz, n amestecul de
reacie se gsete din ce n ce mai mult matri i din ce n ce mai puin enzim activ
(randamentul enzimei scade datorit expunerii prelungite la temperaturi nalte).
Numrul de cicluri
ntr-o reacie PCR obinuit, mai puin de 10 molecule de matri pot fi amplificate
n mai puin de 40 cicluri, obinndu-se un produs (amplicon) detectabil n electroforez n
gel de agaroz. La o cretere mult prea mare a numrului de cicluri, se pot acumula produi
de reacie nespecifici.
Polimerizarea (extensia) final
n multe reacii, dup ultimul ciclu de amplificare, tuburile de reacie se in 5-15 min
la 72oC pentru a realiza polimerizarea complet a produilor pariali, precum i
renaturarea moleculelor monocatenare.
PCR n mutageneza situs-specific

Pornind de la faptul ca primerii folosii ntr-o reacie PCR sunt inclui n produsele
PCR (ampliconi), au fost dezvoltate o serie ntreag de variante tehnice ale acestei reacii.
Astfel, n experimentele de mutagenez situs-specific, modificrile dorite pot fi introduse
n ampliconi pe calea primerilor, fie c este vorba de inserii sau de deleii. n toate aceste
cazuri se utilizeaz o tehnologie PCR n care reacia de amplificare este mprit n 2
reacii PCR separate n care sunt amplificate cele 2 secvene ADN aflate de o parte i de alta
a situsului de modificat. n aceste 2 etape se folosesc perechi de primeri constituite dintr-
un primer extern (pentru captul moleculei ADN iniiale) i un primer intern (primerii
interni sunt complementari situsului de modificat i conin n secven modificarea dorit).
Prin folosirea unor asemenea primeri, ampliconii rezultai conin deja modificarea dorit,
precum i o zon de complementaritate inter-ampliconi.
2013-2014 19
Dup aceast etap se realizeaz ndepartarea primerilor interni, amestecarea celor

2 produse PCR, denaturarea termic a moleculelor urmat de renaturarea acestora n
condiii de stringen. Se adaug primeri exteriori i se realizeaz o noua reacie PCR, al
crei rezultat va fi reprezentat de molecule ADN identice cu matria iniial, coninnd ns
i modificarea dorit.
Spre deosebire de tehnicile clasice de mutagenez, i chiar de experimentele de
mutagenez cu ajutorul transposonilor, asemenea variante tehnice de PCR permit o
rezoluie i o acuratee mult mai mare n obinerea de molecule ADN modificate. n marea
majoritate a cazurilor, aplicaiile practice vizeaz analiza corelaiilor dintre secvena de
nucleotide a unor molecule ADN i realizarea anumitor funcii.
Prelucrarea rezultatelor
Probele obinute se analizeaz prin electroforez n gel de agaroz 1%
Dup migrare, gelul se examineaz la UV
ARN-ul, n mod normal, migreaz n faa ADN-ului
SUBIECTE COLOCVIU CAPITOLUL 1:

1. Celulele sistemului imun
2. Efectele sistemului imun
3. Imunitatea specific
4. Imunitatea nespecific
5. Neutrofilele
6. Celulele NK
7. Celulele dendritice
8. Complexul HLA
9. PCR principii generale
10. Rolul celulelor sistemului imun
11. Rolul MF n cadrul rspunsului imun
12. Recoltarea sngelui venos pentru diverse evaluri imunologice
2013-2014 20
CAPITOLUL 2. RELAIA AG-AC I MECANISME DE RSPUNS IMUN
Imunoglobulinele sunt glicoproteine specializate n recunoaterea moleculelor non-

self. Se gsesc sub dou forme, circulant i de membran:
Forma circulant este reprezentat de moleculele de anticorpi, care se gsesc n
plasm, lichidul interstiial i secreii. Anticorpii sunt sintetizai de plasmocite, celule
care provin din LB activate n urma contactului cu antigenul.
Forma membranar este reprezentat de monomeri de imunoglobuline, fixai pe
suprafaa LB. Aceste molecule intr n alctuirea receptorilor pentru antigen ai
limfocitelor B (B-cell receptors - BCR). Au rol de de activare a LB.
Imunoglobulinele solubile sunt proteine care migreaz pe electroforez n principal
n fraciunea gamaglobulinelor. Imunoglobulinele nu migreaz exclusiv n fraciunea .
Exist clase importante de imunoglobuline care se regsesc n fraciunile i ale
electroforezei.
Cele mai multe antigene cu care organismul vine n contact au o structur complex.
n general, pentru un anumit antigen, sistemul imun va genera mai multe tipuri de
anticorpi, care vor recunoate diferii epitopi. Fiecare anticorp recunoate specific un
anumit epitop, de care se leag cu o poriune care are structur complementar cu a
epitopului. Aceast poriune se numete paratop, situs de legare sau situs combinativ.
Funciile anticorpilor
Anticorpii au un rol esenial n ndeprtarea antigenelor solubile i n distrugerea

antigenelor corpusculate. Nu toate clasele de anticorpi prezint aceleai proprieti
funcionale.
n cele mai multe cazuri, simpla legare a anticorpilor de antigene nu determin

distrugerea bacteriilor sau ndeprtarea antigenelor moleculare. Legarea anticorpului de
antigen se realizeaz prin intermediul fragmentului Fab, n timp ce fragmentul Fc este
responsabil de funciile biologice. Acest fragment are capacitatea de a activa molecule
efectoare ale sistemului imun i de a fi recunoscut de ctre celule imunocompetente.
2013-2014 21
Funciile principale ale anticorpilor sunt:
opsonizarea favorizeaz fagocitoza Ag de ctre MF i PMN. Aceste celule

prezint pe suprafaa receptori pentru fragmentul Fc, numii FcR. Aceti
receptori permit legarea complexelor antigen/anticorp pe suprafaa MF i
neutrofilelor. Legarea mai multor complexe imune pe suprafaa fagocitelor
determin iniierea unui semnal de transducie intracelular care are drept
rezultat fagocitoza acestora. Fagocitoza este un proces complex, prin care
agentul patogen este internalizat i devine inta unor mecanisme de distrugere
care determin liza patogenului.
activarea complementului pe calea clasic este o proprietate pe care o
posed moleculele de IgM i cele mai multe subclase de IgG.
citotoxicitatea mediat celular dependent de anticorpi (ADCC) permite
distrugerea celulelor proprii ale organismului care au fost infectate viral sau cu
bacterii intracelulare. Celulele infectate viral produc proteine virale care servesc
replicrii virusului. Unele dintre aceste molecule sunt expuse pe suprafaa
celulei respective. Moleculele virale sunt recunoscute ca non-self, ceea ce
declaneaz un rspuns imun umoral, cu producerea de anticorpi care se fixeaz
pe aceste molecule de suprafa. Celulele natural killer (NK), care au un rol
important n rspunsul imun celular, prezint receptori pentru fragmentul Fc.
Astfel, anticorpii direcioneaz celulele NK spre celulele infectate viral, cu liza
acestora din urm.
Structura anticorpilor
Similar altor molecule proteice, imunoglobulinele au o organizare spaial

complex, caracterizat prin structur primar, secundar, teriar i cuaternar. Toate
imunoglobulinele au o structur asemntoare, reprezentat de o unitate tetracatenar.
Planul de organizare al domeniilor imunoglobulinelor se regsete n multe alte proteine,
de exemplu la unii receptori de suprafa. Proteinele care conin cel puin un domeniu
imunoglobulinic constituie superfamilia imunoglobulinelor.
Toate tipurile de anticorpi au structur comun, fiind alctuii din 4 lanuri
peptidice: dou lanuri identice uoare (L) i dou lanuri identice grele (H).
Fiecare lan uor este legat de un lan greu printr-o punte disulfidic i prin diferite
alte legturi noncovalente. Astfel se formeaz un heterodimer H - L. Heterodimerii sunt
legai ntre ei de asemenea prin puni disulfidice i legturi noncovalente.
Numrul de legturi disulfidice i aezarea acestora difer n funcie de familia de
imunoglobuline.
2013-2014 22
Structura imunoglobulinelor este strns legat de funciile pe care acestea trebuie

s le ndeplineasc. Pe de o parte, anticorpii se leag n mod specific de antigene, iar pe de
alt parte pot forma legturi cu o varietate de molecule efectoare i celule.
Papaina este o enzim care scindeaz molecula de imunoglobulin n trei fragmente:

dou fragmente identice care au capacitatea de a lega antigene. Acestea au fost
denumite Fab - antigen binding. Aceste fragmente sunt alctuite dintr-un lan
uor L i captul N-terminal al unui lan greu H, legate prin puni disulfurice.
Fragmentele Fab conin regiunea variabil V. Existena a dou situsuri de legare
permite anticorpului s lege dou molecule de antigen.
un fragment Fc - fragment cristalizabil, care nu prezint capacitatea de legare a
antigenelor. Acest fragment este alctuit din resturile lanurilor H. Fragmentul
Fc este diferit n funcie de familia de imunoglobuline.
Exist dou tipuri de lanuri uoare L: i . Nu exist diferene funcionale ntre

anticorpii care au lanuri fa de cei cu lanuri , iar motivul pentru care exist aceast
variaie nu este cunoscut. Aceste dou tipuri de lanuri intr n alctuirea tuturor claselor
majore de imunoglobuline.
n schimb, diferenele structurale existente ntre lanurile grele H sunt definitorii
pentru ncadrarea imunoglobulinelor n anumite clase i influeneaz semnificativ funcia
acestora. Exist 5 izotipuri majore de lanuri grele H: , , , , . Pe baza deosebirilor
existente n structura lanurilor H au fost descrise 5 clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA,
IgD, IgE.
Situsul combinativ
Primii 100 de aminoacizi ai capetelor N-terminale ale lanurilor H i L prezint o
variabilitate marcat ntre anticorpi cu specificitate diferit. Aceste segmente sunt
denumite regiunile V: VL pentru lanurile uoare i VH pentru lanurile grele.
Specificitatea diferit a anticorpilor este datorat acestei regiuni variabile.
Asocierea dintre VH i VL creaz o zon hipervariabil, care este locul de legare a
antigenelor. Aceasta a fost denumit situs combinativ sau situs de legare a antigenului. n
interiorul regiunii variabile, exist anumite poziii care sunt relativ constante de la
molecul la molecul i zone care foarte rar sunt ocupate de acelai aminoacid. Aceste
poziii numite hipervariabile constituie locul de legare cu antigenul i au fost denumite
regiuni determinante ale complementaritii (CDR - Complementary Determining Regions).
Sistemul imun este capabil s produc anticorpi mpotriva unei repertoriu vast de antigene
prin generarea de imunoglobuline care prezint CDR specifice pentru fiecare antigen.
2013-2014 23
Situsul combinativ pentru antigen este o cavitate mic format prin plicaturarea
domeniilor VH i VL. Antigenul intr n aceast cavitate i angajeaz legturi cu domeniile V
prin complementaritate, pe principiul cheie-broasc.
Secvenele de aminoacizi care nu stabilesc legturi cu antigenul formeaz regiunea
suport FR (framework region).
Cu excepia regiunilor variabile, structura imunoglobulinelor este relativ constant

pentru moleculele din aceast clas.
Clasele de imunoglobuline
Imunoglobulinele G
Imunoglobulinele G (IgG) sunt distribuite egal n sectorul intravascular i
interstiial. Moleculele de IgG sunt formate din dou lanuri grele i dou lanuri uoare
sau . Exist 4 subclase de IgG, pe baza diferenelor existente la nivelul lanurilor : IgG1,
IgG2, IgG3 i IgG4.
Au concentraia plasmatic cea mai mare
Realizeaz imunizarea pasiv umoral a nou-nscuilor n primele luni de via
Fixeaz complementul (IgG4)
Reprezint peste 75% din totalul Ig circulante
Apar n RIU secundar
Sinteza lor este indus de IL-4
Imunoglobulinele M
Imunoglobulinele M (IgM) reprezint ntre 5 i 10% din totalul imunoglobulinelor
serice. Forma monomeric de IgM se afl pe suprafaa limfocitelor B i intr n structura
BCR.
Plasmocitele secret IgM circulant ca pentameri. Monomerii sunt aranjai astfel
nct fragmentele Fc se afl n centru iar cele 10 situsuri de legare al antigenului se afl la
periferia moleculei. Fiecare pentamer este format prin legarea monomerilor prin legturi
disulfurice, legturi care se constituie ntre anumite zone ale lanurilor grele, situate nspre
captul C-terminal. n plus, molecula de IgM conine un lan suplimentar polipeptidic numit
lanul J (joining), care este necesar pentru polimerizarea monomerilor.
2013-2014 24
Prima Ig produs de fetus i de ctre LB

IgM sunt mai eficiente dect IgG n activarea complementului
Particip la aprarea contra bacteriilor i virusurilor
Apare n RIU primar
Sinteza este stimulat de IL-2
Imunoglobulinele A (IgA)
IgA este clasa de imunoglobuline predominant n secreii: lapte matern, saliv,
lacrimi, mucusul tracturilor digestiv, bronic i genitourinar. n ser, IgA reprezint 10-15%
din totalul Ig.
n snge, IgA circul n principal sub forma de monomeri. n secreiile mucoase, IgA
exista aproape exclusiv sub form de dimeri (IgAs).
Moleculele de IgAs conin un lan polipeptidic J i o component secretorie, de
asemenea de natur peptidic. Lanul polipeptidic J este identic cu cel care se gsete n
pentamerii de imunoglobulin M. Componenta secretorie este sintetizat de celulele
epiteliale.
Mecanismele de protecie ale IgAs la nivelul mucoasei:
mpiedicarea colonizrii bacterene
neutralizarea particulelor virale
neutralizarea enzimelor i toxinelor
aciune sinergic cu factori ai sistemului de aprare nnscut: lactoferina,
peroxidaz, lizozim
IgAs au un rol important n meninerea relaiei simbiotice cu bacteriile comensale
din cavitatea oral. Exist un repertoriu larg de IgAs care conine anticorpi pentru
antigenele exprimate de bacteriile comensale i care mpiedic trecerea acestora prin
mucoas.
Imunoglobulinele E (IgE)
IgE este o clas de imunoglobuline cu efecte biologice importante, cu toate c se
gsete n cantiti reduse n plasm 0,3 micrograme/mL.
Lanul greu epsilon este format din cinci domenii, unul variabil i patru constante.
Molecula de IgE nu are o zon balama i din aceast cauz este foarte rigid.
Au rol n aprarea antiparazitar i intervin n reacia de hipersensibilitate de tip 1,
care este responsabil pentru o varietate de afeciuni alergice, de la rinit alergic,
urticarie, astm bronic, pn la oc anafilactic.
2013-2014 25
IgE sunt anticorpi citofili, adic dup ce sunt sintetizai nu rmn n lichidul
extracelular, ci se ataeaz prin receptori specifici pe suprafaa mastocitelor i bazofilelor.
Mastocitele i bazofilele posed un bogat echipament enzimatic i de mediatori ai
inflamaiei, care se afl n granulaiile citoplasmatice. Legarea antigenului de
imunoglobulinele E care se afl pe suprafaa acestor celule declaneaz degranularea i
eliberarea mediatorilor inflamaiei n esuturi, cu apariia manifestrilor alergice.
Genele imunoglobulinelor
Localizarea cromozomial a genelor pentru Ig:
Sinteza lanurilor grele este codificat de gene plasate pe cromozomul autozom
14, braul lung q, regiunea 32
Sinteza lanurilor uoare este codificat de gene plasate pe cromozomul autozom
2, braul scurt p, regiunile 11-12
Antigenele
Sistemul imun are capacitatea fundamental de a deosebi structurile proprii ale

organismului (self) de cele strine (non-self). Structurile non-self sunt eliminate prin
mecanismele aprrii imune.
Termenul de non-self nu implic obligatoriu originea exogen a substanei
respective. Exist molecule sau celule proprii ale organismului, care au fcut parte din self,
dar au suferit modificri i au devenit non-self.
Antigenul este o substan recunoscut ca non-self de ctre sistemul imun al
organismului.
In definiia clasic, termenul de antigen desemna orice substan de origine exogen
capabil s induc formarea de anticorpi i s reacioneze n mod specific cu acetia.
Aceast definiie a fost considerat prea restrictiv, pe msur ce s-a observat c exist
antigene de origine endogen sau antigene care nu induc sinteza de anticorpi, dei sunt
recunoscute de sistemul imun.
ntr-o definiie folosit n prezent, termenul de antigen denumete o substan de
origine endogen sau exogen capabil s determine un rspuns imun i s
reacioneze specific cu moleculele rezultate n urma declanrii acestuia (anticorpi
sau receptori celulari).
Aceast definiie subliniaz cele dou proprieti fundamentale ale antigenului:
imunogenitatea (capacitatea de a induce un rspuns imun) i specificitatea (capacitatea de
a reaciona specific cu produsele sistemului imun activat).
2013-2014 26
Imunogenele sunt antigene complete, avnd att capacitatea de a declana rspuns

imun umoral sau celular, ct i de a se lega de produsele rezultate. Antigenele incomplete
(numite i haptene) sunt capabile s reacioneze cu anticorpii sau receptorii de membran,
dar nu pot declana un rspuns imun, dect dac sunt cuplate cu o alt molecul (numit
carrier).
Au fost descoperite antigene care, dei ndeplinesc caracteristicile fundamentale de
imunogenitate, nu produc rspuns imun umoral sau celular. Acestea au fost denumite
tolerogene, iar semnificaia lor imunologic este diferit. Spre desebire de haptene, pe
care le putem aprecia ca fiind indiferente sistemului imun, tolerogenele activeaz
anumite mecanisme de inhibiie activ a sistemului imun.
Clasificarea antigenelor n funcie de origine
Majoritatea antigenelor sunt exogene: bacteriile, paraziii, unele substane chimice

industriale, alergenele ca polenul, praful de cas, alergenele alimentare.
O alt categorie important este reprezentat de antigenele endogene:
autoantigenele, antigenele virale i antigenele tumorale.
Autoantigenele sunt antigene proprii care n mod normal sunt sechestrate prin
bariere anatomice. Aceste antigene sunt situate n aa-numitele situsuri imunologice
privilegiate, protejate prin bariere hemato-tisulare cu permeabilitate sczut pentru
substanele hidrosolubile. n mod normal autoantigenele nu vin niciodat n contact cu
celulele sistemului imun i nu induc un rspuns imun. Exemple de astfel de autoantigene
sunt: sperma, cristalinul, esutul cerebral i unele structuri din celulele miocardice. Pentru
c autoantigenele nu sunt cunoscute de ctre sistemul limforeticular, pentru ele nu exist
toleran imun nnscut, ca pentru celelalte structuri self cu care limfocitele vin n
contact n cursul traficului lor prin organism. n condiii patologice se produce
desechestrarea acestor autoantigene. Autoantigenele vin n contact cu sistemul imun i se
produce un rspuns imun fa de ele, deci fa de nite structuri self. Aceste rspunsuri
imune autoreactive dau o patologie autoimun.
Antigenele virale fac parte din categoria antigenelor endogene pentru c virusurile
i includ genomul n genomul gazdei. Celula gazd sintetizeaz proteinele virale antigenice
pe aceleai ci metabolice ca proteinele proprii.
Antigenele tumorale se gsesc pe membranele i n citoplasma celulelor canceroase.
Ele nu se gsesc pe membranele sau n citoplasma celulelor normale din care a derivat
tumora. Orice organism normal produce un numr mic de celule canceroase, care sunt
distruse rapid de sistemul imun. Prevenirea apariiei tumorilor se face prin distrugerea
celulelor tumorale izolate, n cadrul unui proces de imunosupraveghere. Dac o celul
neoplazic izolat reuete s se divid i apare o tumor constituit, rspunsul imun
2013-2014 27
mpotriva tumorii seamn cu cel din respingere a grefelor. n ambele situaii acioneaz n
special mecanismele rspunsului imun celular.
Superantigenele sunt o categorie special de antigene, care prezint particularitatea

c nu sunt fagocitate de macrofage. Au rol n activarea mai multor limfocite prin
capacitatea lor de a se fixa pe exteriorul celulei, de MHC II de pe macrofag i de lanul al
receptorului pentru antigen de pe limfocitul T (TCR T cell receptor).
Din punct de vedere al necesitii participrii limfocitelor T helper n cadrul RIU,

antigenele se mpart n:
timoindependente - antigene care pot declana RIU n absena LT helper (mai
ales antigenele polizaharidice bacteriene). Rspunsul este rapid, fapt important
n infeciile cu microorganisme agresive (ex: pneumococul). Dezavantajul este c
aceti anticorpi nu sunt la fel de funcionali ca cei rezultai prin participarea LT
helper i nu exist mecanismul de comutare izotipic, care permite sinteza a
diferite clase de imunoglobuline. n plus, nu se formeaz limfocite B cu memorie.
timodependente - reprezint majoritatea antigenelor. Rspunsul imun
declanat de aceste antigene este mai puin rapid, dar mai versatil i mai eficient.
n plus, apar limfocite B cu memorie, care permit un rspuns mult mai rapid i
intens la un nou contact cu antigenul (rspunsul imun umoral secundar).
Antigenele cu care organismul vine n contact pot fi solubile sau corpusculate:

Antigenele solubile sunt molecule recunoscute ca non-self. De obicei antigenele
solubile sunt proteine cu greutate molecular mare. Uneori antigenele solubile
sunt polizaharide, acizi nucleici sau glicolipide.
Antigenele corpusculate sunt structuri non-self mai complexe: virusuri,
bacterii, protozoare, celule strine, celule infectate, celule neoplazice. De fapt,
antigenele corpusculate sunt formate dintr-un numr foarte mare de molecule
antigenice. Dintre ele, cele mai importante pentru recunoaterea i distrugerea
antigenului corpusculat sunt antigenele de suprafa.
Sistemul complement
Sistemul complement este un sistem multienzimatic care particip la rspunsul
imun i la reacia inflamatorie. n acest fel el face legtura ntre aprarea specific i
nespecific. Factorii sistemului sunt sintetizai n principal n ficat. Ca i sistemul coagulrii,
complementul funcioneaz pe principiul cascadei.
Factorii complementului se gsesc permanent n plasm. Ei extravazeaz n focarul
inflamator datorit permeabilitii capilare crescute. n circulaie factorii sistemului
2013-2014 28
complement se gsesc sub form de profactor (enzim inactiv sau zimogen). Profactorii se
activeaz succesiv prin procese de proteoliz limitat. Factorii C 2, C3, C4 i C5 sunt clivai n
cte dou fragmente notate cu a i b. Fragmentele a sunt mai mici. Ele rmn solubile
n lichidul interstiial i au efecte de tip proinflamator. Fragmentele b sunt mai mari. Ele
intervin n distrugerea antigenelor corpusculate i n epurarea antigenelor solubile.
Componentele sistemului complement:

C3a, C5a = anafilatoxinele
C5b = factorul chemotatic
C3b = factorul opsonizant
MAC = complexul litic terminal
Anafilatoxinele sau factorii anafilactici acioneaz asupra mastocitelor tisulare i

bazofilelor atrase n focarul inflamator prin chemotactism. Din aceste celule se elibereaz
mediatorii preformai, dintre care cel mai important este histamina i mediatorii
neoformai: factorul de activare plachetar (PAF), prostaglandine, leucotriene, tromboxan.
Factorii chemotactici au o aciune puternic asupra leucocitelor i macrofagelor.
Factorii opsonizani se ataeaz imunologic nespecific de membranele non-self i de
complexele imune. Acest proces stimuleaz fagocitoza bacteriilor i a complexelor imune.
Complexul litic terminal sau Membranary Attack Complex (MAC) se ataeaz pe
membrana celulei int, o perforeaz i produce liza osmotic a celulei int sau a bacteriei
acoperite de Ac.
2013-2014 29
Colaborarea ntre anticorpi i complement duce la ndeprtarea sau distrugerea

antigenelor prin intermediul a trei mecanisme principale:
anticorpii se fixeaz pe membrana bacteriilor i determin activarea
complementului. Sistemul complement este un sistem enzimatic care se activeaz n
cascad i care determin liza osmotic a antigenelor corpusculate prin perforarea
membranei.
activarea local a sistemului complement de ctre anticorpi determin apariia unor
cantiti crescute de molecule de C3b. Acestea au la rndul lor capacitatea de
opsoniza antigene i promoveaz fagocitoza.
eritrocitele prezint receptori pentru C3b. Molecule de C3b au capacitatea de a se
ataa de complexele imune. Complexele imune care nu pot fi fagocitate local sunt
transportate de ctre eritrocite la ficat sau splin, unde macrofagele locale
fagociteaz complexele imune fr a distruge eritrocitele care au avut rol de
transport.
Desfurarea rspunsului imun umoral
Rspunsul imun umoral (RIU) pentru antigenele timodependente se produce printr-

o cooperare celular la care particip patru tipuri de celule: APC, LTH (helper), LTS
(supresoare), LB. Cooperarea celular este bidirecional.
Cooperarea dinspre APC spre LB are ca efecte:
Selecia i activarea clonelor de LB i LT antigen-specifice
Expansiunea clonal a limfocitelor antigen-specifice
Producia unei cantiti adecvate de imunoglobuline pentru neutralizarea i
distrugerea antigenelor
Secvena de retrocontrol, de la LB spre APC, limiteaz intensitatea RIU la un minim

necesar pentru o aprare eficient.
Caracteristicile RIU primar si secundar

RIU primar este declanat de primul contact cu un anumit antigen. LB virgine sunt
recrutate n organele limfoide periferice i se nmulesc n foliculii limfatici, n aa-numiii
centri germinativi primari, care sunt activi cam trei sptmni. RIU primar are o serie de
caracteristici:
Producie de IgM, stimulat de IL-2, n titruri mici sau moderate
Laten de 4-5 zile de la contactul antigenic pn la decelarea Ac specifici
IgM au o afinitate sczut de legare a antigenului
2013-2014 30
RIU secundar apare la al doilea contact cu un anumit antigen i continu la

urmtoarele contacte. Dup contactul cu antigenul, RIU secundar ncepe mult mai rapid
dect RIU primar (n 2-3 zile), iar panta de cretere a titrului de anticorpi este foarte
abrupt. Se formeaz LB de memorie. Cooperarea celular i proliferarea clonal se produc
n centrii germinativi din foliculii limfatici secundari. Dup ndeprtarea din organism a
antigenului, n circulaie rmn doar anticorpii, cu titrul mult mai mare dect al
anticorpilor din RIU primar.
Anticorpii sunt IgG cu titru mare care persist mult, timp de mai muli ani. Frecvent
acetia confer protecie pentru toat viaa fa de antigenul corespunztor, ca n cazul
anticorpilor antirujeolici, antirubeolici i cei contra toxinei eritrogene a streptococului.
Majoritatea Ag care declaneaz RIU sunt Ag T-dependente, care induc activarea,

proliferarea i diferenierea LB antigen specifice, prin cooperarea cu LTh i secreia de
citokine. Factorii de transcriere induc expresia anumitor gene, ducnd la proliferare i
difereniere celular.
Desfurarea rspunsului imun celular
RIC are rol de aprare n trei condiii patologice:

eliminarea celulelor infectate cu microorganisme cu dezvoltare intracelular:
virusuri, bacterii (mycobacterii, Listeria, Brucella, Legionella)
supravegherea i distrugerea celulelor canceroase
rejecia grefelor
RIC este implicat n recunoaterea i distrugerea:

celulelor singenice devenite Ag: celulele infectate sau neoplazice
celulelor alogenice aprute prin gref sau transplant
Recunoaterea i distrugerea celulelor antigenice se face prin dou tipuri de celule:

LTC (LT citotoxice) i celulele NK (natural killer). Acestea recunosc celulele non-self prin
mecanisme diferite, dar le distrug printr-un mecanism comun, numit citotoxicitate
extracelular sau citotoxicitate mediat celular.
La contactul cu celula int, LTC i NK elibereaz nite mediatori care:
lezeaz membranele celulelor non-self, ducnd la liza osmotic a celulelor
altereaz nucleul celulelor int, producnd apoptoza lor
2013-2014 31
Recunoaterea celulei int de ctre LTC

LTC recunosc specific celulele int, pentru c acestea prezint pe suprafa Ag
cuplate cu moleculele MHC I. Normal celulele organismului prezint diverse fragmente
polipeptidice rezultate din proteinele celulare degradate n cursul procesului de regenerare
fiziologic sau din proteinele cu structur defectuoas, pe care celula le distruge.
Asamblarea MHC I cu aceste fragmente se face n RER, iar dup aceea complexul rezultat
este expus pe membran. Celulele sistemului imun, n special LT, nu reacioneaz fa de
fragmentele peptidice self, deoarece nc din timpul maturaiei intratimice au fost distruse
clonele de LT care recunosc autoAg.
Celula infectat viral sau care a devenit neoplazic prezint pe suprafa n complex
cu moleculele MHC I diverse Ag virale sau neoplazice, fa de care LTC reacioneaz.
Fragmentele din primele celule int distruse de LTC sunt fagocitate de MF, care
devin APC i prezint polipeptidele non-self pe suprafa n complex cu moleculele MHC II.
Sunt stimulate LTH. Secret IL2 i stimuleaz astfel chemotactismul, proliferarea i
activarea de noi LTC. LTC au pe suprafa CD25, receptorul pentru IL2.
Din punct de vedere funcional, limfocitele T se mpart n:

Limfocite T citotoxice (LTC) au pe suprafa receptorul specific CD8. Recunosc
peptidele antigenice rezultate din degradarea agenilor patogeni intracelulari,
peptide care sunt prezentate ctre LT citotoxice mpreun cu moleculele
complexului major de histocompatibilitate de tip I (MHC I). Rolul acestor
limfocite este de a distruge celulele int infectate.
Limfocitele T helper (LTH) prezint pe suprafa receptori CD4. Pot s
recunoasc peptide antigenice care rezult n urma prelucrrii agenilor
patogeni extracelulari, peptide prezentate mpreun cu molecule MHC II.
Limfocitele T supresoare reprezint o subpopulaie de limfocite T a crei
existen este controversat. Aceste limfocite au efecte inhibitorii n cadrul
rspunsului imun.
Concluziile mecanismelor de reacie imun

Celulele T i B recunosc diferit Ag
Ag trebuie prelucrat nainte de a fi prezentat celulelor T
Procesarea Ag genereaz peptide antigenice
Mecanismul de procesare a Ag depinde de compartimentul n care se replic agentul
patogen
2013-2014 32
Principalele reacii Ag-Ac i aplicaiile acestora
1. Testul pentru determinarea Ac antistreptolizina O reacia ASLO

Testul permite stabilirea diagnosticului anginei streptococice sau de infecie
streptococic, ca i a celui de reumatism articular acut (RAA)
Meninerea titrului ASLO ridicat chiar i la cteva luni dup puseul reumatismal
permite stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii.
Principiul metodei:
Reactivul folosit: suspensie de particule latex de polistiren ncrcate cu streptolizina
O stabilizat.
Reactivul a fost astfel preparat nct, n prezena unui titru ASLO normal de 200
U.I/mL sau mai crescut, s dea o aglutinare vizibil a particulelor latex, fr diluarea
serului.
Reactivi:
1 flacon cu reactiv latex de 5mL
1 flacon control pozitiv de 1mL
1 flacon control negative de 1mL
1 plcu pe care se efectueaz reacia
Interpretarea testului:
Reacia ASLO negativ: obinerea unei suspensii lptoase, fr aglutinare, ca cea
observat la controlul negativ
Reacia ASLO pozitiv: obinerea unei aglutinri observat n cercul probei
asemntoare cu cea observat la controlul pozitiv
Valori crescute:
> 200 U.I.: la pacienii care au avut n ultimele trei luni o angin streptococic sau
alte infecii streptococice
> 300 U.I.: n glomerulonefrita acut streptococic, scarlatin, purpura reumatoid
600-2500 U.I.: n RAA
2. Testul pentru identificarea proteinei C reactive

Testul este utilizat pentru identificarea CRP n ser n vederea diagnosticrii unor
afeciuni inflamatorii sau pentru monitorizarea inflamaiei.
Principiul metodei:
Reactivul CRP este o suspensie de particule latex de polistiren, marcate cu o
fraciune de gamaglobulin a serului anti-uman CRP specific. Cnd CRP este
prezent n prob, se observ o aglutinare ce indic un coninut de 6 mg/L.
2013-2014 33
Reactivi:
1 flacon cu reactiv latex de 5 mL
1 flacon cu control pozitiv de 1 mL
1 flacon cu control negativ de 1 mL
1 plcu pe care se efectueaz reacia
CRP nu este prezent n sensul pacienilor aparent sntoi
Valori crescute:
infecii bacteriene: pneumonii
infarct miocardic, afeciuni maligne, LES, stri post-operatorii
febr reumatic, afeciuni reumatice diverse, colagenoze, TBC activ
3. Testul RPR Carbon VDRL

Reactivul RPR Carbon este o suspensie stabilizat cu cristale de colesterol marcate
cu cardiolipin lecitin i particule de mangal (pentru mbuntirea interpretrii
rezultatelor). Reactivul are rol de Ag fa de Ac prezeni n organismal persoanelor
infectate cu Treponema pallidum.
Modul de lucru :
Se aduc reactivii i probele la temperatura camerei, nainte de folosire
Se agit uor reactivul pentru dispersarea particulelor
Se pune cte o pictur din controlul pozitiv i negativ n cte un cercule al plcuei
Se pune cte o pictur (50 l) de ser nediluat din fiecare prob n cte unul din
cercurile plcuei
Se adaug o pictur de reactiv RPR Carbon, ori se pipeteaz 20 l de reactiv n
fiecare cercule folosit
Se amestec ambele picturi, fr s se disperseze pe toat suprafaa cercului
Se rotete plcua manual ori cu un rotor mecanic de 80-100 rpm, 8 min
Se citete prezena aglutinrii vizibile cu ochiul liber. O aglutinare nespecific poate
apare dac testul este citit mai trziu de 8 min
Interpretarea rezultatului:
Rezultat pozitiv: prezena unor nori cenuii pe albul plcuei
Rezultat negativ: lipsa unei reacii de floculare uniforme i a unei culori cenuii
2013-2014 34
4. Testul pentru identificarea AgHBs

Testul pentru identificarea AgHBs este un test rapid, care se efectueaz din ser, este
util n diagnosticul infeciei cu virusul hepatitic B.
Rezultatul testului poate fi citit vizual, fr niciun instrument.
Testul se bazeaz pe principiul determinrii semicantitative a AgHBs din ser, cu
ajutorul metodei imunoenzimatice de tip sandwich. Anticorpii monoclonali i
policlonali sunt folosii pentru identificarea AgHBs cu o nalt sensibilitate. Testul
dureaz circa 15 min.
Principiul metodei:
25 de plcue imunocromatografice
Reactivul 1 = enzima conjugat
Reactivul 2 = soluia de splare
Reactivul 3 = soluia revelatoare
2013-2014 35
Negativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi mici
Intens pozitiv: toate cele 3 spoturi mici i spotul mare sunt vizibile, iar spotul mare
este intens colorat
Slab pozitiv: apar cele 3 spoturi mici i spotul central, dar spotul mare nu foarte
intens colorat
Neconcludent: cnd spotul central este vizibil, dar cele mici nu sau cnd nu apare
niciun spot; se repet testul
5. Testul COOMBS
Test de diagnostic pentru anemiile hemolitice autoimune
Const n reacia de hemaglutinare
Testul DIRECT: detecteaz Ac anti-eritrocitari (AAc) fixai deja pe Ag de pe
eritrocitele bolnavului
Eritocitele se pun n contact cu ser anti-Ig, care determin aglutinare n urma
cuplrii anti-Ig-AAc
Testul INDIRECT: detecteaz Ac anti-eritrocitari (AAc) circulani
Serul cu AAc provenit de la bolnav este pus n contact cu eritrocite normale care au
pe suprafa Ag eritrocitare
Are loc cuplarea AAc de Ag
Adugarea de ser anti-Ig determin aglutinarea eritrocitelor
2013-2014 36

1. Funciile imunoglobulinelor
2. Proprietile IgG, IgM, IgE
3. Antigene exogene i endogene
4. Componentele sistemului complement
5. RIU primar
6. RIU secundar
7. RIC
8. Cooperarea LB-LTh
9. Testul COOMBS principiu
10. Structura de principiu a unei imunoglobuline
11. Haptenele, Ag convenionale i superantigenele
12. Testele ASLO, CRP, VDRL, AgHBs: interpretarea rezultatelor
2013-2014 37
CAPITOLUL 3. TERAPII IMUNOSTIMULATOARE
IMUNIZAREA ORGANISMULUI
Imunizarea organismului presupune ansamblul de msuri prin care se ofer
protecie specific mpotriva patogenilor frecveni i agresivi.
Edward Jenner a descoperit vaccinul mpotriva variolei (vrsatului de vnt) n anul
1700.
Imunizarea natural activ const n apariia unui rspuns imun specific i
protector dup o boal infecioas, n urma contactului natural cu agentul patogen. Ea se
realizeaz prin mecanismul memoriei imunologice i reprezint o achiziie a sistemului
imun. Boala infecioas poate mbrca forme severe, uneori mortale, motiv pentru care
imunizarea natural nu este ntotdeauna o variant benefic de imunizare. De aceea
cercettorii au cutat nc de acum 200 de ani metode artificiale de imunizare.
Imunizarea natural pasiv const n motenirea de ctre nou nscut a unui titru
de anticorpi protectori de la mam, fa de bolile infecioase pentru care mama este
imunizat. Aceti anticorpi sunt de tip IgG i traverseaz placenta n timpul vieii
intrauterine. Dup natere ei continu s ajung la copil prin intermediul laptelui matern.
Astfel copilul este protejat n primele luni de via de o serie de boli infecioase. ns titrul
acestor anticorpi scade progresiv, astfel nct dup vrsta de 5-6 luni copilul nu mai este
protejat.
Imunizarea artificial activ const n inducerea memoriei imunologice prin

introducerea n organism a unor ageni infecioi sau a unor antigene ale acestora prin
intermediul vaccinurilor. Acestea nu sunt capabile s produc boala, dar pot induce un
rpuns imun protector, similar cu cel obinut dup boal.
Imunizarea artificial pasiv const n introducerea n organism a unor anticorpi

specifici preformai, prin intermediul serurilor sau imunoglobulinelor. Imunizarea pasiv
nu induce un rpuns imun din partea organismului, nu declanaz mecanismele memoriei
imunologice i asigur o protecie de scurt durat.
IMUNOPROFILAXIA ACTIV PRIN VACCINARE

Imunizarea activ determin protecie pe termen lung i memorie imunologic.
Profilaxia asigurat prin vaccinare se numete imunizare activ i este durabil n timp.
2013-2014 38
Ea nu trebuie confundat cu imunizarea pasiv realizat prin administrarea de

seruri hiperimune sau imunoglobuline specifice, care asigur o protecie imediat dar de
scurt durat, de circa 3-4 sptmni.
Vaccinul este un preparat care conine fraciuni antigenice din structura unui
agent infecios. El este capabil s induc la individul vaccinat un rspuns imun protector
mpotriva respectivului agent infecios. Acesta se instaleaz dup un interval de timp
necesar sintezei de anticorpi n urma vaccinrii.
Apariia unui rspuns imun n cursul vaccinrii nu este suficient pentru
protecie. Acesta trebuie s aib o anumit intensitate i este necesar apariia memoriei
imunologice, asigurat de limfocitele T i B de memorie.
Tipuri de vaccinuri:
Germeni vii atenuai (vaccinuri vii bacteriene sau virale)
Germeni mori
Fraciuni de germeni
Toxoizi (toxine secretate i detoxifiate)
Recombinani de determinani antigenici
Vaccinurile vii sunt utilizate pentru imunizarea mpotriva unor infecii virale:
rujeol (pojar), rubeol, oreion, varicella, poliomielit, hepatit A.
Pentru c pot determina simptome de boal majore, vaccinurile vii sunt atenuate
prin cultivarea agentului patogen pentru perioade ndelungate n condiii anormale de
cultur. Se vor selecta mutani care sunt adaptai supravieuirii n cultura anormal, dar
au patogenitate mai redus n organism. Un exemplu este vaccinul mpotriva
Mycobaterium (BCG bacilul Calmette Guerin). Acesta a fost obinut prin creterea
Mycobaterium bovis pe un mediu cu o concentraie crescut de bil.
Pentru c au capacitate mare de replicare, microorganismele determin un rspuns

imun intens i prelungit, cu un titru nalt de anticorpi i formarea de celule de memorie.
Astfel, n cele mai multe cazuri, vaccinurile atenuate necesit doar o singur imunizare. n
plus, n cazul vaccinurilor cu microorganisme intracelulare se declaneaz i un rspuns
imun celular.
Principalul dezavantaj al vaccinurilor atenuate este reprezentat de posibilitatea ca

agentul patogen respectiv s revin la patogenitatea iniial. Administrarea
vaccinurilor vii atenuate este uneori urmat de reacii adverse care mimeaz infecia
2013-2014 39
natural cu agentul infecios coninut n vaccin. Sunt contraindicate la pacienii
imunodeprimai pentru c pot determina reacii adverse severe i la gravide, din cauza
posibilului efect teratogen.
Vaccinurile inactivate conin virusuri sau bacterii lipsite total de putere patogen.
Induc, dup administrri repetate, o imunizare activ. Pot fi utilizate la gravide i
imunodeprimai. Vaccinurile inactivate determin inducerea unui rspuns predominant
umoral.
Exist mai multe tipuri de asemenea vaccinuri:

Vaccinurile complete sau corpusculare, care conin bacteria sau virusul n
ntregime. Ele sunt inactivate prin diverse procedee: formol, cldur,
betapropio-lacton. Microorganismele astfel inactivate sunt incapabile s se
replice n interiorul gazdei.
Vaccinurile macromoleculare conin fragmente antigenice sau subuniti din
structura virusului sau bacteriei: toxine detoxifiate (anatoxine), antigene
capsulare (polizaharidice), antigene de membran (proteice).
Vaccinurile preparate prin recombinare genetic, cum ar fi vaccinul contra
hepatitei B (Engerix B). Vaccinurile obinute prin inginerie genetic sunt
atenuate ireversibil prin ndeprtarea selectiv a genelor care sunt responsabile
pentru virulena agentului respectiv.
Vaccinurile obinute prin inactivarea toxinelor bacteriene (vaccinuri cu

toxoizi): antidifteric, antitetanic, antiholeric, polivaccinuri de tip Polidin (stimularea
imunitii pentru strepto, staphylo i meningococ).
2013-2014 40
Imunizarea pasiv prin seruri i prin imunoglobuline

Serurile hiperimune conin anticorpi specifici preformai care acioneaz imediat
dup administrare. Ele pot fi seruri: heterologe i homologe.
Serurile heterologe
Sunt recoltate de la animale (cai) n prealabil imunizate activ, care posed deci
titruri mari de anticorpi specifici.
Din cauza riscului de accidente anafilactice ele sunt din ce n ce mai puin utilizate,
fiind nlocuite cu Ig umane specifice.
Se administreaz n scop profilactic, imediat dup un presupus contact cu agentul
infecios (plag tetanigen, plag rabigen).
Serurile homologe (umane): provin de la convalesceni. Ele au fost abandonate din cauza
riscului transmiterii unor virusuri, ca HIV i virusurile hepatitice.
Imunoglobulinele umane se recolteaz de la populaia adult i sunt de 2 tipuri:

gamaglobuline standard (administrate n deficitele imune primitive cu
hipogamaglobulinemie, infecii bacteriene severe recidivante la copiii infectai HIV,
leucemie limfoid cronic i pentru profilaxia rujeolei sau a hepatitei A dup un
contact infectant)
gamaglobuline specifice (se utilizeaz Ig antitetanice, antirabice, antihepatit B,
antivariceloase)
Durata rspunsului imun post contact natural sau vaccinare

Pentru toat viaa rujeola, rubeola, oreionul, varicela
Pentru 10 ani HVB, antitetanic
Pentru cteva luni - holera
Imunoprofilaxia secundar
DTP diftero-tetanic-pertussis luna a 2-a de via i 3 rapeluri la 4, 6, 12 luni
HVB administrat la natere, lunile 2 i 6
VPI (antipolio) luna a 2-a de via, cu rapel
BCG (antituberculos) n primul an de via
Momentul administrrii vaccinurilor

Profilactic pre-expunere
Terapeutic post-expunere
2013-2014 41
Calea de administrare a vaccinurilor

Injectabil i.m, s.c, i.d - rapel
Reacii adverse la imunizare

Sindrom febril
Stare general alterat
Artralgii
Tulburri neurologice
Reacii alergice
Sindrom inflamator rubor, edem, durere

1. Imunizarea natural activ
2. Imunizarea natural pasiv
3. Imunizarea artificial activ
4. Imunizare artificial pasiv
5. Tipuri de vaccinuri
6. Vaccinurile vii
7. Vaccinurile inactive
8. Vaccinurile macromoleculare
9. Serurile heterologe
10. Serurile homologe
11. Imunoprofilaxia secundar
12. Momentele i calea administrrii vaccinurilor
13. Reacii adverse la imunizare
Acest material este proprietatea intelectual a Disciplinei de Fiziopatologie i Imunologie Medicin Dentar. Reproducerea
parial sau integral a textului este interzis.
2013-2014 42

Suport LP Imunologie 2013-2014 PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Suport LP Imunologie 2013-2014 PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UMF Carol Davila Bucureti Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie

Facultatea de Medicin Dentar Anul de studii: III

SUPORT PENTRU LUCRRILE PRACTICE

CAPITOLUL 1. ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUN

Imunologia clinic urmrete:

Sistemul imun asigur aprarea organismului fa de:

Celulele sistemului imun

Organele limfoide sunt:

Principalele celulele efectoare ale sistemului nnscut sunt polimorfonuclearele

Limfocitele sunt celulele eseniale pentru sistemul adaptativ.

Celulele APC se mpart n:

APC sunt celule cu rol esenial n generarea RIU i RIC fa de antigenele

Efectele sistemului imun

Inflamaia este o reacie nespecific de aprare a organismului, cu caracter local sau

Tipuri de rspuns imun

- Antigen independent - Antigen dependent

Neutrofilele au rol important mai ales mpotriva bacteriilor cu habitat extracelular,

Transformarea monocitelor n MF presupune schimbri importante:

Funciile principale ale macrofagelor sunt:

particip la procesele de reparaie tisular prin activarea fibroblatilor;

MF particip la rspunsul imun datorit funciei lor de APC i asigur:

Succesiunea de evenimente care determin rspunsul celulelor fagocitare n infecii:

aderarea vascular diapedeza chemotaxia activarea fagocitoza i moartea celular

C. CELULELE KILLER NESPECIFICE

NK au rol n imunitatea nnscut sau nespecific. Ele intervin n primele momente

Recunoaterea celulei int de ctre NK

Distrugerea celulei int prin citotoxicitate extracelular

Teorii asupra procesului de angajare a celulelor stem:

Modul de recoltare, prelucrare, transport i stocare a probelor de snge

Recoltarea sngelui venos

naintea recoltrii sngelui, se desface acul prin rsucirea capacului sigilat. Se

b. Se inverseaz poziia minilor ct mai curnd posibil dup ce acul a penetrat

Indiferent de sistemul de recoltare folosit, se respect urmtoarele manevre:

Unele vacutainere destinate obinerii serului conin un activator de coagulare (care

Ordinea recoltrii tuburilor

Volumul optim de prob

Obinerea sngelui pentru imunofenotipri

Metoda folosit - citometrie n flux.

Din acest motiv, atunci cnd se efectueaz o monitorizare seriat a populaiilor

Obinerea sngelui pentru determinarea activitii funcionale a Ly, Mo, Gran

Determinarea activitii funcionale a leucocitelor este indicat n urmrirea

Obinerea sngelui pentru tipizarea HLA (MHC)

Complexul HLA este plasat pe braul scurt al cromozomului autozom 6.

Se recolteaz 8,5mL snge venos periferic n vacutainer ce conine citrat de dextroz

HLA = Human Leukocyte Antigen = antigene de histocompatibilitate = MHC = Major

Histocompatibility Complex = complexul major de histocompatibilitate

Exist 2 clase principale:

Funciile MHC I i MHC II

Limfocitele T helper recunosc doar antigene exogene prezentate mpreuna cu MHC

Moleculele MHC se asociaz cu fragmente peptidice care au fost procesate anterior

Utilizarea antibioticelor (Ab) i antimicoticelor (Am) n mediul de cultur

Antibiograma presupune testarea sensibilitii unei tulpini bacteriene izolate dintr-

Metode folosite pentru testarea sensibilitii in vitro la antibiotice

Se utilizeaz penicilina G (bacterii G+), streptomicina sulfat (bacterii G+/-),

Metoda cu antibiotic ncorporat n mediu semisolid (modern): permite

Tehnici de biologie molecular

Variante tehnice i aplicaii ale tehnologiei PCR

PCR n mutageneza situs-specific

Dup aceast etap se realizeaz ndepartarea primerilor interni, amestecarea celor

SUBIECTE COLOCVIU CAPITOLUL 1:

CAPITOLUL 2. RELAIA AG-AC I MECANISME DE RSPUNS IMUN

Imunoglobulinele sunt glicoproteine specializate n recunoaterea moleculelor non-

Anticorpii au un rol esenial n ndeprtarea antigenelor solubile i n distrugerea