Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
ANALIZA CROMATOGRAFIC
VR = tRFe
VR' = VR V M
unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei,
Fe, prin produsul:
VM = tMFe
Vr= tr . Q
Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influen mare
asupra l irii de band ( vezi i cap. Cromatografia de lichide) influen a difuziei
longitudinale fiind important dtorit coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine
de m rime la gaze fa de cel al lichidelor.
Fig.II.2. Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purt tor, 2-reductor de
presiune, 3 - manometru de nalt presiune, 3- manometru de joas presiune, 5- regulator
de presiune i debit, 6- sering de injec ie pentru substan e de analizat n stare ini ial
lichid , 7-dispozitiv de evaporare rapid , 8-cuptor termostatat de nc lzire, 9- coloan
cromatografic tubular , 10- detector, 11- amplificator electronic, 12- sistem electronic de
achizi ie prelucrare i afi are date, 13 calculator, 14- imprimant
performant de injec ie trebuie s asigure injec ia n timp scurt a unor cantit i extrem de
mici de subsatan de analizat numai a a snt asigurate peak-uri nguste la baz .
Extragerea probei se face dintr-un minirecpient cilindric de sticl a ezat pe suportul
mobil a autosamplerului prin intermediul unei microseringi speciale ac ionat automat.
Acul seringii perforeaz un dop de cauciuc siliconic sau i absoarbe o cantitate bine
definit de prob , figura II.3. , dup care se ridic automat , se deplaseaz i injecteaz
proba printr-un semptum prev zut cu un dop de cauciuc siliconic ntr-un dispozitiv de
evaporare rapid situat la intrarea n coloan . Este foarte important ca evaporarea s
se produc practic instantaneu astfel nct amestecul fazei purt toare cu substan a de
analizat s se produc chiar la baza coloanei cromatografice. Volumul unei probe
analizate pentru coloane analitice normale variaz de la c iva l la cca 30 l, la
coloane capilare volumul probei este mult mai mic de ctiva nl fiind necesar folosirea
unui sistem de splitare ( divizare), figura II.4., a volumului probei , sistem care asigur
preluarea pentru analiz numai a unui volum extrem de mic restul fiind purjat n mediu.
Aceste sisteme de splitare snt n principiu diviz ri de debit cu tuburi de tip T,
existente att pe traseul gazului purt tor ct i pe cel al amestecului gazos, pe ale c rori
ramuri se creaz rezisten e hidraulice bine controlate astfel nct s poat fi purjat cea
mai mare parte din substan a de analizat, pe coloan ajungnd numai o parte infim de
amestec i gaz purt tor a a cum de altfel este necesar. Manipularea a unor cantit i
Fig. II.4. Dou procedee de splitatare a volumului probei la cromatograful de gaze
2- tub de evaporare cu dop de vata de sticl sau de cuar , 4 corpul
dispozitivului de injec ie , 5- ventil cu 3 c i, 6- ventil cu ace cu debit
reglabil
mici de prob , a a cum este cazul la gazcromatografie, pe cale manual duce la erori
importante motiv pentru care pentru dozare i injec ie snt recomandate dispozitive de tip
autosampler.
v ma
vr
v mg
Ld =p/S
Numai atunci cnd diferen a E ntre valoarea m rimii m surate i valoarea medie a
unei analize oarbe este de trei ori mai mare dect abaterea standard (s) a tuturor
semnalelor parazite p se poate sus ine cu o siguran de 99% c c un punct de
surare oarecare P de pe cromatogram reprezint un punct a semnalului util i nu a
componentelor parazite ale semnalului. La acest ra ionament se iau n calcul numai
abaterile pozitive ale Peak-urilor de la valoarea medie ( jum tatea semnalului de
eroare). Acest concept teoretic , dealtfel perfect valabil, este modificat n practica
cromatografic n sensul c se iau n considerare att abaterile pozitive ct i cele
negative , m sur torea f cndu-se vrf vrf. Din aceste m sur tori ar rezulta prin
mp ire un factor f , (f = 1,5 (n loc de 3) pentru distan a punctului de m surare P de
la valoarea median a semnalului de abatere . de regul pentru calculul limitei de
detectabilitate Ld se fololose te un factor f =1,2 2:
Selectivitatea unui detector Si,j descrie sensibilit ile diferite pentru dou
materiale diferite i i j. Selectivitatea Si,j este indicat ca fiind raportul sensibilit ii
detectorului pentru cele dou substan e:
Sij= Si/Sj
Fig.II.8. Domeniul liniar (a) i domeniul dinamic (b) al unui detector folosit n cromatografie
de detectabilitate Ld. n partea de sus prin o abatere tolerat de 5% de la dreapta ideal
de liniaritate. Pentru exemplificare grafic a domeniului liniar se reprezint n
coordonate dublu logaritmice suprafa a peak-ului Ai sau a semnalului detectorului Ei n
func ie de cantitatea mi a probei, concentra ia Ci , respectiv fa de debitul masic Qmii,
figura II.8.a, Intr-un alt tip de reprezentare folosit se reprezint sensibilitatea Si n
func ie de cantitatea de prob folosit mi, n func ie de concentra ia Ci sau n func ie de
debitul masic Qmii, figura II.8.b. Valoric domeniul liniar se exprim prin raportul dintre
limita superioar a domeniului liniar i limita de detectabilitate, este obligatorie i
indicarea naturii substan ei analizate i. Domeniul dinamic al detectorului este plasat n
continuarea domeniului liniar i reprezint domeniul n care o modificare a concentra iei
sau a debitului masic mai provoac o modificare sensibil i posibil de calibrat a
semnalului detectorului, figura II.8.a,b.
Detectorul pentru azot i fosfor este un detector modificat de tip FID care con ine o
surs alcalin de silicat sub forma unei perle din sticl sau ceramic dopat cu
elemente alcaline, precum K,Rb,Cs, ce elibereaz u or electroni. Perla alcalin este
fixat pe o srm de platin ntre flac ra de hidrogen i electrozii colectori de electroni
ai detectorului, figura fiind nc lzit att pe cale electric prin srma de platin pus sub
tensiune ct i prin flac ra de hidrogen, n jurul ei formndu-se un nor termic plasmatic
care prin norul de electroni emi i are totdeauna sarcina negativ fa de sarcina
pozitiv a electrozilor colectori .
Detectorul NPD poate fi folosit n dou moduri:
- ca detector de fosfor (P)
- ca detector de azot (NP)
n cazul utiliz rii lui ca detector de fosfor, figura II.11 a , flac ra de hidrogen arde ca la
detectorul FID deasupra arz torului cu deosebirea c arz torul este legat la p mnt,
figura, deoarece electronii rezulta i din arderea unor componente ce con in atomi de
carbon , electroni ce constituie semnalul electric la un detector FID , snt respin i n
acest caz de poten ialul negativ al perlei scurgndu-se la mas , n schimb electronii
ce iau na tere pe suprafa a perlei alcaline , al c ror num r este propor ional cu
concentra ia de fosfor, ajung nestingheri i la electrozii colectori formnd semnalul
electric al detectorului. n ce prive te mecanismul propriuzis de reac ie trebuie ar tat c
la nceput se formeaz n flac oxizi de fosfor cu un num r impar de electroni , prin
fixarea a electronului impar se formeaz n prima faz anionii diferi ilor acizi fosforici
care n flac snt oxida i n flac cu radicali OH la acizi neutrii de fosfor ,
a) b)
Fig. II.11. Schema de principiu a detectorului pentru: a- fosfor (P), b- azot i fosfor (N-P).
1-arz tor, 2- flac de hidrogen, 3,4 electrozi colectori de electroni, 5-perl alcalin ,
6-plasm , 7- amplificator electronic, 8-sistem electronic de prelucrare i afi are
Detectorul de conductivitate termic este unul din cele mai vechi detectoare
folosite n cromatografie. El se bazeaz pe m surarea continu a conductivit ii termice
a amestecului de gaze compus dintr-un gaz purt tor i amestecul gazos de analizat,
figura. Conductivitatea termic este o m rime fizic specific naturii i concentra iei
substan elor. Amestecuri de gaze de compozi ii i concentra ii diferite ce scald cei patru
rezistori nc lzi i ai pun ii Wheatstone modific propor ional cu natura i cu
concentra iilor substan elor rezisten a acestor rezistori ducnd la apari ia unei tensiuni
de dezechilibru a pun ii.
Detectorul de conductivitate termic , figura II.12, este format dintr-un bloc metalic
compact bine termostatat n care se g sesc patru celule de gaz identice prev zute cu
filamente de platin sau de wolfram , sub form de srm , legate electric ntr-o punte
de tip Wheatstone. n detector se realizeaz o m surare comparativ de compensa ie.
n acest scop prin dou celule, situate pe dou laturi opuse ale bra elor pun ii, trece
gazul purt tor pur, iar prin celelalte dou bra e ale pun ii trece gazul purt tor n amestec
cu gazele pentru analizat. Toate filamentele snt parcurse de un curent electric care
provoac nc lzirea acestora prin efect Joule-Lenz. Temperatura srmelor i prin aceasta
i rezisten a lor electric depinde de conductivitatea termic a gazelor ce trec prin
celule. Modific ri ale compozi iei gazelor provoac prin conductivit ile lor termice
specifice modific ri corespunz toare de temperatur i prin aceast modific ri ale
rezisten ei electrice a filamentelor de srm . Diferen ele de temperatur a filamentelor
n celulele de m surare i n celulele de referin duc la un dezechilibru electric
surabil al pun ii Wheatstone. Timpul la care se produce acest dezechilibru este
propor ional cu natura substan ei care traverseaz la acel moment dou bra e opuse
ale pun ii , iar valoarea dezechilibrului este propor ional cu concentra ia acelei
substan e din amestecul de gaze. Detectorul de conductivitate termic este un detector
universal, utilizabil la aproape toate substan ele, singurele ngr diri snt la substan e
puternic corozive care distrug filamentele, dar are o sensibilitate destul de sc zut .
Valorile din tabel 1 snt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al
ierarhiz rii. Sensibilitatea variaz destul de mult chiar n cadrul aceleia i grup ri
chimice deoarece ea depinde de structura leg turilor .
R R e
Doi electrozi colecteaz electronii rezulta i ca urmare a ioniz rii, electroni ce formeaz
de fapt semnalul electric al detectorului. Nivelul acestui semnal este propor ional cu
gradul de ionizare , iar acesta la rndul lui este propor ional cu concentra ia specieiei
anlizate ce se g se te n acel moment n camera de ionizare.
Fig. II.16. Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil nalt
presiune, 3-manometru nalt presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joas
presiune, 6- sistem distribuitor i dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- distribuitor,
10,11-filtru, 12-sistem de injec ie prob , 13-purj , 14-pomp de nalt presiune , 15-
precoloan , 16-filtru, 17-distribuitor, 18-coloana cromatografic , 19-incint de
termostatare coloan , 20-detector, 21- amplificator electronic, 22-sistem de achizi ie i
prelucrare date, 23-sistem de calcul, 24-imprimant
Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pna n prezent, att n LC,
ct si n HPLC. Pentru a putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie
colorati - adica sa absoarba lumina pe domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe
de alta parte, eluentul trebuie sa fie practic transparent pentru acelasi domeniu spectral.
Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea Lambert-
Beer (A=elC). Deci unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita
de detectie sau zgomotul de fond se prezinta n cazul acestor detectori n AUFS
(prescurtare de la Absorbance Units Full Scale = unitati de absorbanta raportate la
ntreaga scala, l. engl.). Astfel n cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de
0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.
Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele
substante organice, anume cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au
grefate functiuni organice cu electroni neparticipanti, absorb lumina n UV-VIS. Este
vorba de toate hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor
hidrocarburilor cu diferite functiuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH2). ntre
acestea se includ si numeroasele combinatii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici
etc.Un mare avantaj al acestor detectori este faptul ca sunt insensibili la micile variatii de
debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct propor ionala cu coeficientul
de extinc ie si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea detectorului ar trebui
rita lungimea celulei dar aceasta este restric ionata. Sensibilitatea este de ordinul
5x10-8g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm.
Se pot distinge si n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori.
1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza
doar la o lungime de unda. Modelul cel mai raspndit se compune dintr-o sursa
luminoasa cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separa un
domeniu ngust (de ex. linia 254nm a mercurului) si un detector. Schema bloc a unui
astfel de detector este prezentata n figura II.18.
10
2 3
6
7
1
4
I
5
8
9 t
Fig. II.19. Principiul de func ionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substan a ce vine de
la coloana cromatografica,3- substan a ce pleac , 4- geam de cuar , 5- tub capilar
prin care circula substan a de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7-
amplificator,8- sistem de achizi ie, prelucrare si afi are a datelor, 9-
cromatograma,10- cuva detectorului
1 M
5 6
9 7
6
C
I
2 10
t
Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce
separa cele 2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe
detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6 iar o parte se refracta pe fotoelementul
6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt
diferite, motorul prime te un semnal de corec ie, in scopul egaliz rii tensiunilor, astfel
are loc compensarea modific rii indicilor de refrac ie. In urma deplasarii urubului 8 ,
sistemul nregistrator 9 va nregistra datele sub forma unei cromatograme.Diferenta
dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate n cele doua compartimente vor fi practic
nule, atta timp ct din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita n momentul n care n
eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. n
momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din
detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre
detector.
n cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face
necesara aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lnga sensibilitatea
relativ coborta (10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal,
dar nu poate fi utilizat n cromatografia cu gradienti deoarece, n acest caz, compozitia
eluentului la intrarea n coloana difera de cea de la iesire si se modifica continuu,
neexistnd o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatura
(0.0001C) fiind necesara termostatarea, att a detectorului ct si a coloanei.
6
7
1 2
4
5 H 8
3
i 10
3 4
7
1 t
6
2 5
t
+i
E6 E5 E4 E3
0
E0 E1 E2 E(mv)
-i
1
2 I 16
15
3
t
13
8
5
14
6
7 9 10 11 12
Fig.II.24. Principiul de func ionare al detectorului de fluorescenta.1- sursa de radia ie, 2- fanta,
3- filtru, 4- lentila, 5- substan a ce vine de la coloana. 6- substan a de analizat, 7-
cuva cu pere i de cuar , 8- unghi de 90 grade,9- substan a ce iese din cuva, 10-
lentila, 11- filtru, 12- fanta, 13- detector de fluorescenta, 14- amplificator, 15- sistem
de preluare, prelucrare si afi are a datelor, 16- cromatograma.
Principiul de func ionare: Radia ia emisa de sursa (1) dup trecerea prin filtru este
focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90 pe radia ia incidenta. Lumina
fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la
detectorul de fluorescenta care ii m soar intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si
preluat de sistemul de prelucrare si afi are a datelor(15). Datele ob inute sunt afi ate
sub forma unei cromatograme (16).
2 3
1 6
4 5 I
10
7
t
8
9
+ +
electrozi
Solutie
tampon
A C
C A
A+B B+C
B B+C
A+B+C
b
a
Fig.II.26. Scema de principiu a electroforezei fara medii stabilizante
Electroforeza capilara (EC) este folosita pentru separarea speciilor ionice datorita
incarcaturii lor electrice si a fortelor de atractie si respingere. Se deosebeste de HPLC
doar prin faptul ca separarea pe componenti se face sub inalta tensiune electrica pe
cand la HPLC se face cu o pompa de inalta presiune. Exista si combinatii intre
electroforeza capilara si HPLC (ce nu se poate detecta cu HPLC intra in sistemul de
detectare al eletroforezei capilare).
8
9
10
5
_ +
2 1
4 3
11 t