Efectuarea preparatelor microscopice

Tehnica efectuarii frotiului

1 ) Etalarea
din cultura bacterian n mediu lichid
se prelev cu ansa o pictur i se
etaleaz n centrul lamei, n strat ct
mai subire, prin micri circulare
excentrice pe suprafat de 1-2 cm2 fr
a atinge marginile lamei;
din cultur pe mediu solid se prelev
o cantitate numai prin atingerea unei
colonii ( doar varful coloniei ! ) cu
ansa i se depune n centru lamei lnga
o pictur de ap distilat steril. Se

1
 omogenizeaz progresiv cultura n
pictura de ap i se etaleaz;
prelevatele patologice fluide se
etaleaz procednd ca pentru cultura n
mediu lichid.
pentru produsele patologice
fibrinoase se evit micrile de du-te
vino ale ansei pe aceeai suprafa. Se
depune n centrul lamei un mic flocon
fibrino- purulent care se ntinde n strat
ct mai subire prin micri radiare i
excentrice;
2) Uscarea
frotiurile se usuc la temp.camerei
3) Fixarea
fixarea se face prin cldur: se trece
lama cu frotiul n sus, cteva secunde

2
prin flacra unui bec de gaz. Dosul
minii trebuie s suporte atingerea
lamei astfel nclzite. O nclzire mai
puternic poate carboniza frotiul.

3
4
 Colorarea frotiurilor
1) Coloratia Gram
se pune lama cu frotiul n sus pe stativul
de colorare;

5
 se coloreaz frotiul 30 sec 1 min cu
soluie de violet de gentiana ( colorare)

se vars colorantul, se spala lama cu

apa de robinet
se acoper lama cu soluie Lugol
( fixare) proaspt i se menine 30 sec-
1 min;
6
 se scurge soluia Lugol i se acoper
lama cu soluia de decolorare (alcool-
aceton) imprimndu- i micri
alternative de nclinare pn cnd
preparatul nu mai elibereaz colorant:
cca 5- 10 sec pentru frotiurile subiri, cca
10 sec pentru cele mai groase. Se
stopeaz decolorarea prin splare
ngrijit cu ap.

7
 se recoloreaz cu soluie de fucsin
bazic timp de 30 sec. Pentru hemofili
se prelungete la 1- 2 min.

2 ) Coloratia cu Albastru de metilen

Se acopera frotiul cu albastru de metilen,
timp de 1 min, se spala.
Frotiurile colorate se pun in pozitie verticala,
in stativ si se lasa la uscat, apoi se
examineaza la microscop, initial cu
obiectivul de 40, apoi cu imersie .

8
Examinarea cu imersie se pun 1-2 picaturi
de ulei de cedru si se examineaza la
microscop.
Datorita structurii peretelui abcterian,
bacteriile Gram poztive se coloreaza in
violet, iar cele Gram negative pierd
colorantul si se recoloreaza cu fuxina, in
rosu
Ce se vede la microscop ?
Forma bacteriilor
1) forma sferic (coci)
- Diametre egale: stafilococ, streptococ
- Reniformi: neiserii
- Lanceolai: pneumococi
- Ovalari: enterococi
dispoziie
- Ciorchine: stafilococi
- Diplococi: neiserii, pneumococi
- Tetrade: Micrococcus tetragenus
- Cte opt: Sarcina
9
- Izolai
- Lanuri: streptococci
2) forma cilindric (bacili)
- drepi cu capete drepte: Bacillus
- drepi cu capete rotunjite: entrobacterii
- drepi cu capete ascuite
- ncurbai: bacil difteric
- deformai de spor: clostridia
dispoziie
- neregulat: entrobacterii
- diplobacili
- n lanuri (streptobacili): Bacillus
- sub aspect de litere, bee de chibrituri:
bacili difterici
forma spiralat (ncurbat)
- vibrioni
- spirili spire rigide
- spirochete spire flexibile
Dimensiunile bacteriilor
Coci: 0,5 2 m
Bacili: lungime 0,5 10 m / lime 0,3 2
m

10
Vibrioni: lungime 1,5 3 m / grosime 0,5
m
Spirochete: lungime 6 20 m / grosime
0,15 0,5 m

11
12
In cazul frotiului din cultura-
cocobacili, coci, bacili Gram pozitivi
(colorati in violet), Gram negativi
(colorati in rosu), albastru (coloratia
cu albastru de metilen)
In cazul frotiului din produs patologic-
bacterii ( coci, bacili, cocobacili),
Gram pozitivi, Gram negativi-
coloratia Gram si albastru coloratia
albastru de metilen; celule
inflamatorii care predomina fata de
celulele epiteliale, raportul bacterii

13
 /celule inflamatorii (intra,
perileucocitar, extraleucocitar)

Importanta examenului microscopic

direct (frotiu din produs patologic)
Criteriu de respingere a probei ( proba
incorect recoltata)
Corelatie frotiu-colonii dezvoltate pe
mediile de cultura
Evolutia sub tratament a infectiei

Microscopia optic pe cmp luminos

se aeaz pe masa port obiect
preparatul microscopic i se fixeaz
ntre suporii reglabili;
se rotete capul revolverului pentru a
aduce n axul optic obiectivul selectat. -

14
 privind lateral, manipuleaz butonul
micrii grosiere pn cnd lentila
obiectivului ajunge ct mai aproape de
preparat;
se privete prin oculare i se ajusteaz
pentru propria distan interpupilar
pn cnd se obine viziunea binocular
perfect a cmpului microscopic;
se focalizeaz preparatul acionnd
tubul microscopului numai de jos n sus
prin butonul micrii grosiere, apoi dac
se lucreaz cu un obiectiv puternic, prin
butonul micrii fine;
se selecteaz o suprafat din preparat
cu elemente bine etalate. Pentru
aceasta se acioneaz cu butoanele

15
 care controleaz micrile transversal
i longitudinal ale mesei port obiect;
se acioneaz butonul de focalizare a
condensorului pn se obine imaginea
diafragmei de cmp cu cel mai clar
contur. La examinri cu obiectivele 10x
se reduce apertura numeric a
condensorului prin deurubarea monturii
cu lentila superioar
se regleaz deschiderea diafragmei de
apertur. Pentru aceasta se scoate
ocularul, se privete prin tubul
microscopului i se acioneaz prghia
diafragmei de apertur pn ce
imaginea ei ocup - 1/3 din diametrul
pupilei de ieire a obiectivului.
Deschiderea spre maxim a diafragmei

16
 de apertur crete puterea de separare,
dar scade contrastul imaginii; invers,
micorarea ei scade puterea de
separare, dar crete contrastul imaginii;
Odat stabilite aceste reglaje, este
contraindicat reglarea fluxului luminos prin
modificarea diafragmei de cmp sau
poziiei condensorului. Acum fluxul luminos
mai poate fi crescut prin rabatarea filtrului
mat, sau sczut prin filtrului fumuriu NG 5/2
n lcaul filtrelor. Filtrul verde VG 6/2 ofer
un contrast mai bun imaginii i crete
puterea separatoare, dar altereaz
interpretarea culorilor preparatului;
n final se focalizeaz imaginea prin
ajustarea dioptriilor: se obtureaz
ocularul

17
stng, se privete cu ochiul drept prin
ocularul drept i se focalizeaz imaginea
prin butonul micrii fine. Se obtureaz
ocularul drept, se privete apoi cu ochiul
stng i se focalizeaz imaginea numai prin
rotirea inelului de ajustare a dioptriilor fr a
atinge butoanele micrii grosiere sau fine
a tubului.

ntreinerea microscopului

18
 microscopul se ine la adpost de praf:
sub hus sau n cutie;
ocularele i obiectivele nefolosite se in
n cutia lor;
dup fiecare examinare se cur uleiul
de cedru de pe lentila obiectivului IU cu
o hrtie moale, care nu las scame;
nu se ating cu mna suprafeele optice;
nu se apropie exagerat ochii de oculare;

19
stapylococcus spp.

S.aureus

20
streptococcus spp.

21
Group A, Streptococcus pyogenes

Sputum smear
Staphylococcus & Streptococcus
pneumoniae

22
Neisseria gonorrhoeae

23
streptococcus pneumoniae

Bacillus

24
Salmonella typhi, the agent of typhoid.
Gram stain. (CDC)

25
vibrio cholerae

26
Stained pus from a mixed anaerobic
infection. At least three different
clostridia are apparent.

27
Clostridium perfringens, Gram Stain.
Most clostridia are renowned for staining
"Gram-variable".

corynebacterium diphtheriae

28
Haemophilus influenzae

Pseudomonas aeruginosa

29
Escherichia coli/PMN

Peritoneal fluid Mixed

anaerobic infection

30
Urethral smear,
Neisseria gonorrhoeae

31
Modul de desfasurare a lucrarii practice
- studentii primesc manuscrisul cu
Efectuarea preparatelor
microscopice, Examinarea la
micoscop
- Lp se desfasoara interactiv
- Fiecare student efectueaza un frotiu
din cultura
- Fiecare student coloreaza frotiul
efectut
- Fiecare student prinde imaginea la
microscop si examineaza frotiul
colorat
- Fiecare student examineaza frotiuri
din produse patologice

32
Bibliografie
Bacteriologie Medicala, Olga
Dorobat, editura UTM, 2006
Clinical Microbiology Procedures
Handbook, Henry D. Isenberg,
editata American Society for
Microbiology, 2004
Koneman's Color Atlas and
Textbook of Diagnostic
Microbiology , Washington C
Winn, Stephen D. Allen, Gail L.
Woods, William M. Janda, Paul
C. Schreckenberger , editura
Lippincott Williams & Wilkins,
2005
Manual of Clinical Microbiology ,
Patrick R. Murray ,

33
Ellen Jo Baron ,
Michael A. Pfaller , Fred C. Tenover ,
Robert H. Yolken, editura ASM, 2007

34