Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
II.
1. Efectuarea si colorarea unui frotiu din cultura bacteriana
2. Efectuarea si colorarea unui frotiu din produs patologiec (colectie purulenta)
3. Colorarea prin metoda Ziehl-Nielsen un frotiu din sputa
4. Insamantarea unui produs patologic pe o placa Petri cu geloza in vederea izolarii
germenilor
5. Antibiograma difuzimetrica. Principiu. Interpretare.
6. Reactia ASLO. Principiu. Interpretare.
7. Identificarea serologica a unei tulpini bacteriene izolate prin corprocultura de la un
bolnav cu sindrom dinzenteric.
8. Caracterizarea comportamentului biochimic al unei enterobacterii insamantate pe medii
diferentiale.
9. Testul ELEK. Principiu, interpretare
10.Reactia ASCOLI. Principiu, interpretare
11.Reactia Bordet-Wasserman. Principiu, interpretare
12.Exudatul faringian. Mod de recoltare, insamantare, interpretare
13.Urocultura. Mod de recoltare, insamantare, interpretare
14.Coprocultura. Mod de recoltare, insamantare, interpretare
I. Examinarea de frotiuri colorate Gram, Z-N si AM.
1. Produs patologic sau cultura pura? Daca e cultura pura, toate celulele vor avea
aceleasi dimensiuni si acelasi aspect. Daca e produs patologic, se vor vedea si celule
umane (celule epiteliale, polimorfonucleare) care vor trebui mentionate. De asemenea,
daca este produs patologic, trebuie facut diferenta intre bacteriile libere si cele
surprinse in interiorul unei celule fagociatere.
2. Coloratia. Gram – fundal violet, celulele pot fi rosii sau violet.
3. Z-N – fundal albastru cu puncte rosii (bacteriile acid-alcool rezistente).
4. AM- totul este albastru; se deosebeste doar forma bacteriilor
5. Aspectul bacteriilor:
a). formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat.
Majoritarea steptococilor şi stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt
lanceolaţi, gonococii şi meningococii pot fi reniformi.
Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultură în care se dezvoltă, de vârsta culturii
bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum şi de modul în care are loc diviziunea în cursul
procesului de creştere şi multiplicare (planul de diviziune).
Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele
genuri de bacterii, de ex.:
- stafilococii sunt coci sferici dispuşi în grămezi („ciorchine”);
- pneumococii sunt coci lanceolaţi dispuşi doi câte doi, eventual înconjuraţi de o capsulă
comună (în diplo);
- streptococii sunt coci dispuşi în lanţuri etc.;
b). formă de bastonaş (bacili, „rods”), drepţi cu capetele uşor rotunjite (enterobacterii),
drepţi cu capetele tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuţite
(Fusobacterium nucleatum), dispuşi uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în palisade”,
ca şi scândurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici);
c). aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus);
d). actinomicete, care în culturi tinere formează filamente lungi, ramificate (asemănător
mucegaiurilor); aceste filamente se fragmentează şi rezultă aspecte bacilare (ex. Actinomyces
israelli);
e). forma spiralată (bacili curbi - V. cholerae, spirili şi spirochete - T. pallidum).
Prezinta/ nu prezinta capsula (in col Gram si AM). Prezinta/ nu prezinta spor.
Functie de coloratie, daca sunt gram positive sau gram negative, daca exista sau nu bacterii
acid-alcool rezistente (Z-N).
II.
1. Efectuarea si colorarea unui frotiu din cultura bacteriana
2. Efectuarea si colorarea unui frotiu din produs patologic (colectie purulenta)
Frotiurile se pot realiza pornind de la produse patologice (recoltate de la om sau de la animale
de experienţă) sau din cultura microbiană (în mediu lichid sau solid). Frotiul trebuie întins în
strat cât mai subţire (preferabil în unistrat). Este de preferat să folosim lame şi lamele noi
supuse următoarelor proceduri successive (imersare în amestec sulfocromic câteva zile, spălare,
clătire, păstrare în alcool 50%). Lamele se usucă (folosim o cârpă curată) apoi se degresează
suplimentar prin flambare (trecere de câteva ori prin flacăra becului Bunsen).
Executarea frotiurilor din p.p. cu consistenţă fluidă sau din culturi microbiene realizate în
mediu de cultură lichid
după ce am flambat lama, o aşezăm cu partea flambată în sus
sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească
prelevăm aseptic p.p. / cultură şi depunem produsul în centrul lamei
întindem prin mişcări de “dutevino” (de “haşurare”) pe axul lung al lamei produsul
prelevat, în strat cât mai subţire, având grijă să nu ne apropiem de marginile lamei /
întinderea se poate face şi prin mişcări circulare, excentrice
lăsăm lama să se usuce lângă becul de gaz (nu grăbim uscarea prin eventuale treceri
ale frotiului prin flacără) – în cazul în care avem în dotare un dispozitiv în care lama se
poate aşeza şi usca la +70ºC, vom utiliza această metodă
fixăm frotiul; există metode chimice de fixare, însă cel mai frecvent folosim fixarea prin
căldură, distrugând în acelaşi timp şi microorganismele (care prezintă o afinitate
tinctorială mai mare decât celulele vii)
în acest scop, trecem frotiul prin flacără (aşa cum am procedat şi pentru flambarea
lamei, înainte de executarea frotiului) însă de această dată partea pe care am întins p.p.
sau cultura este orientată în sus; ca o modalitate de control, atingem dosul mâinii cu lama
flambată iar temperatura atinsă prin flambare nu trebuie să fie mai mare decât pe care o
putem suporta
frotiul fixat este gata pentru colorare
Executarea frotiurilor din p.p. cu consistenţă solidă sau din culturi microbiene realizate
în mediu de cultură solid
după ce am flambat lama, o aşezăm cu partea flambată în sus
cu ajutorul flaconului cu picurător sau cu ansa bacteriologică sterilizată şi răcită depunem
în centrul lamei o picătură de soluţie salină fiziologică sau apă distilată
sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească
prelevăm aseptic p.p. / un fragment din colonie şi depunem produsul în picătura de fluid
de pe lamă
omogenizăm foarte bine p.p. / fragmentul de colonie în picătura de fluid
procedăm ca mai sus pentru întinderea, uscarea şi fixarea frotiului
Coloraţia cu albastru de metilen
acoperim frotiul cu soluţie de albastru de metilen, pentru 3-4 minute (nu are rost să
acoperim cu colorant lama în întregime)
spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare cu
sugativă sau hârtie de filtru
examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm
Coloraţia Gram
diluăm într-un recipient fucsina (9 părţi apă distilată / 1 parte fucsină)
acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de genţiană), pentru 1-3
minute (nu are rost să acoperim cu colorant lama în întregime)
îndepărtăm colorantul
acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute
îndepărtăm lugolul
acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonă (1 parte acetonă / 3 părţi alcool de
96º) pentru un timp foarte scurt, 7-8 secunde
spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet
acoperim frotiul cu fucsina diluată 1/10 pentru 1 minut
spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare cu
sugativă sau hârtie de filtru
examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm
Interpretare
Frotiu colorat cu albastru de metilen (A.M.) / putem vizualiza: bacterii colorate în albastru
închis, în cazul bacteriilor capsulate, această structură va apărea ca un halou necolorat, celule
diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul apare într-o
culoare albastru mai închis în timp ce citoplasma apare cu nuanţe de albastru; coloraţia cu A.M.
permite o mai bună diferenţiere a detaliilor structurale.
Frotiu colorat Gram
∙ în cazul în care frotiul a fost realizat din cultură pură putem vizualiza microorganisme
cu
aceeaşi formă, aceleaşi dimensiuni (excepţie Proteus spp.), o anumită dispoziţie, cu sau
fără
capsulă (halou necolorat), gram pozitive (colorate în violet) sau gram negative (colorate
în roşu),
levurile se colorează în violet
în cazul în care frotiul a fost realizat din produs patologic putem vizualiza celule diferite
(în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul şi citoplasma
apar în diverse nuanţe de roşu, bacterii gram pozitive şi / sau gram negative, fibrină şi
levuri care se colorează învio let etc
Frotiu colorat Ziehl-Neelsen / putem vizualiza: bacili de culoare roşie, relative fini (în cazul
prezenţei BAAR), alte bacterii (neAAR), celule diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi
celule inflamatorii de culoare albastră (toate structurile ne-ARR apar colorate albastru) etc; în
cazul colorării unui frotiu din cultură pură vom evidenţia numai bacili de culoare roşie.
5. Antibiograma difuzimetrica
Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar
Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin
„inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui
tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu
capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în care
sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată. Aplicarea microcomprimatelor se
poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator „automat”
(la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de marginea plăcii; vom utiliza 5
antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).
Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu
ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile peste
noapte în termostat, la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de multiplicare a
microorganismului testat.
Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie în
care coloniile microbiene nu se dezvoltă.
Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă
în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă
colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent.
Elementele necesare standardizării sunt:
mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă
corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)
există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor microorganisme
(ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci când este testată
sensibilitatea la aminoglicozide);
se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor microorganisme
pretenţioase;
grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);
inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să aibă o
turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 10 8 unităţi
formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;
timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3
plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea
microcomprimatelor (6 mm diametru);
alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de
polietilenă, la +4°C);
utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;
interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară
rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de
referinţă).
6. Reactia ASLO
Această reacţie poate fi utilizată în diagnosticul retrospectiv al unei infecţii streptococice sau
pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (împreună cu criteriile minore şi
majore de diagnostic). Reacţia ASLO determină titrul Ac anti streptolizină O (SLO).
Principiu:
Titrarea Ac antiSLO se bazează pe faptul că SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de
iepure sau de berbec. În cazul în care în serul de cercetat există Ac antiSLO, acţiunea hemolitică
a SLO este neutralizată. Combinând diluţii din serul de cercetat cu o cantitate constantă de SLO
vom putea determina titrul ASLO.
Tehnica de lucru:
Trebuie urmate toate indicaţiile din protocolul de lucru, respectiv
se omogenizează suspensia de hematii
se îndepărtează inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizăm soluţie de rivanol şi
suspensie de cărbune activ, realizăm o diluţie de 1/10 a serului care se va menţine 30
minute la 56°C)
se realizează diluţiile de ser şi se repartizează în tuburile de reacţie (ser în diluţii
succesive)
împreună cu SLO (în cantitate constantă, câte 0,5 ml / tub); combinarea serului de
cercetat cu SLO reprezintă prima etapă a reacţiei
se agită tuburile pentru omogenizare şi se menţin timp de 15 minute la 37°C
urmează a doua etapă a reacţiei ASLO, respectiv adăugarea suspensie de hematii (5%),
câte 0,5 ml în fiecare tub
se agită pentru omogenizare şi se incubează timp de 45 minute la 37°C
se centrifughează tuburile timp de 1 minut (1.500 rotaţii / minut) şi se menţin până a doua
zi la 4°C (temperatura frigiderului).
Interpretare:
Pornind de la o diluţie iniţială a serului de 1/10, după adăugarea tuturor reactivilor titrul
(numărul de unităţi ASLO) va fi 12, 50 în tubul următor, 100, 125, 166, 250, 333 etc în tuburile
următoare.
Titrul reacţiei ASLO este dat de cea mai mare diluţie de ser la care lipseşte complet hemoliza.
Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi ASLO.
Există teste serologice şi pentru evidenţierea prezenţei şi titrului anticorpilor faţă de alte
structure antigenice (de exemplu streptodornază, hialuronidază, streptokinază).
Control de calitate:
Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, în care se verifică rezistenţa
hematiilor şi respectiv tubul martor pentru SLO în care se pun SLO şi suspensia de hematii.
precipitare.
REGULI GENERALE
este recomandabil ca recoltarea şi stabilirea modalităţii de transport a p.p. să fie făcută de
medic sau sub îndrumarea unui medic de specialitate
∙ prelevarea p.p. trebuie să aibă loc înainte ca pacientul să fi primit antibiotice sau
chimioterapice
chiar dacă boala este gravă iar tratamentul antibiotic “pare” urgent, trebuie reţinut că
pentru recoltarea p.p. care poate duce la un diagnostic care ar putea salva viaţa
pacientului sunt necesare numai câteva minute; după recoltarea p.p. se poate administra
prima doză de antibiotic sau chimioterapic, ales “empiric”, pe criterii de probabilitate
∙ în cazul în care evoluţia sub tratament antibiotic este nefavorabilă, diagnosticul
microbiologic va permite (între timp) izolarea agentului etiologic şi stabilirea
sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice astfel încât “schimbarea” tratamentului se va
putea face în mod riguros, ştiinţific
în cazul în care (dintr-un motiv sau altul) tratamentul cu antibiotice a fost început înainte
de prezentarea la spital / laborator, în funcţie de boala suspectată se pot recomanda
următoarele abordări
o ∙ oprirea, dacă este posibil, tratamentului pentru 24-48 ore, cu recoltarea p.p. şi
începerea diagnosticului microbiologic
o ∙ recoltarea p.p. imediat înainte de următoarea doză de antibiotic
o ∙ încercarea de “antagonizare” a efectului antibioticului, în mediul de cultură (ex.
cu sulfat
o de magneziu în cazul în care s-au administrat tetracicline)
o ∙ diluarea inoculului (mai ales dacă pacientul a primit un tratament bacteriostatic)
în mediul de cultură fără antibiotic
o ∙ notificarea în formularul în care se solicită analiza de laborator şi care însoţeşte
p.p. precum şi în buletinul de analiză, a tuturor datelor privitoare la tratamentul
primit de către pacientul investigat
∙ recoltarea şi transportul p.p. trebuie să se realizeze cât mai aproape de debutul bolii, dar
trebuie ales momentul cel mai potrivit (optim), respectiv momentul în care este cea mai
mare probabilitate ca agentul etiologic să se găsească în produs
∙ în funcţie de evoluţia bolii (de ex. coprocultura în febra tifoidă se va efectua “după”
prima săptămână de evoluţie)
∙ în funcţie de specificul fiziopatologic al bolii respective (de ex. se recomandă efectuarea
hemoculturii în “accesul febril”)
∙ produsul patologic din care estimăm că vom putea izola agentul etiologic al bolii
suspicionate va fi ales în funcţie de maladie şi va putea fi reprezentat spre exemplu de
o ∙ o secreţie de la nivelul presupusei porţi de intrare (ex. secreţie nazală sau
faringiană în difterie, secreţie genitală în cazul unei boli veneriene etc)
o ∙ un produs de la nivelul căilor de răspândire în organism (ex. sânge, ţesut recoltat
prin biopsie de la nivelul ganglionilor limfatici)
o ∙ un produs de la nivelul căilor de eliminare din organism (ex. urină în infecţiile
tractului urinar, materii fecale într-o boală diareică acută etc)
o ∙ un produs de la nivelul focarului infecţios (ex. lichid cefalorahidian / LCR în
meningită, spută în pneumonie etc)
∙ în vederea alegerii produsului care urmează a fi recoltat este necesară cunoaşterea
patogeniei, evoluţiei şi elementelor clinice legate de bolile infecţioase, ceea ce este
esenţial în cazul practicării cu adevărat a microbiologiei clinice
∙ periodicitatea cu care se realizează recoltarea de p.p. poate influenţa rezultatul în
anumite cazuri, spre exemplu
o ∙ în suspicionarea unui sepsis (denumirea acceptată actual pentru septicemie) se
recomandă recoltarea a 2-3 probe de sânge în 24 ore, pentru hemocultură
o ∙ în suspicionarea unei boli diareice acute se recomandă recoltarea a câte unei
probe de materii fecale, trei zile consecutiv, pentru coprocultură
o ∙ în suspicionarea unei tuberculoze pulmonare se recomandă recoltarea a câte unei
probe de spută, trei zile consecutiv etc
∙ ceea ce a fost prelevat şi transmis pentru examinare trebuie să reprezinte cu adevărat
p.p. (acel produs care conţine cu mare probabililtate microorganismul infectant), spre
exemplu
o ∙ în cazul în care este suspicionat diagnosticul de meningită şi a fost recoltat LCR,
în cazul în care meningita este de etiologie bacteriană sau fungică,
microorganismul implicat patogenic va putea fi identificat în cursul diagnosticului
microbiologic
o ∙ în schimb, dacă în cazul în care este suspicionată tuberculoza pulmonară se vor
trimite spre examinare salivă sau secreţii de la nivelul arborelului respirator
superior în loc de spută, diagnosticul microbiologic este imposibil etc
∙ din p.p. se vor preleva şi utiliza în cursul diagnosticului microbiologic porţiunile cele
mai reprezentative, respectiv acele porţiuni în care sunt cele mai mari şanse de
identificare / vizualizare prin microscopie / cultivare şi izolare a microorganismului
infectant, spre exemplu în cazul recoltării de materii fecale (suspiciune de boală diareică
acută) se vor selecta porţiunile mucopurulente (eventual mucosanguinolente)
∙ este necesar să se recolteze o cantitate de p.p. suficientă pentru efectuarea diagnosticului
microbiologic (preparate proaspete, frotiuri, cultivări pe medii de cultură, inoculări la
animale de experienţă, reluarea unor manevre în cazul că este necesar
∙ recoltarea şi transportul p.p. trebuie să se realizeze în condiţii stricte de asepsie, pentru
prevenirea contaminării celui care recoltează, pentru prevenirea suprainfectării
pacientului şi pentru prevenirea contaminării p.p.
∙ se vor respecta precauţiunile universale privind prevenirea contaminării în unităţile
sanitare
∙ se va evita, pe cât posibil, contaminarea p.p. cu microorganisme care aparţin florei
microbiene normale (spre ex. prin tehnica de recoltare / vezi recoltarea urinei sau prin
manevre invazive care şuntează căile naturale prin care sunt eliminate microorganismele /
vezi recoltarea sputei prin lavaj bronhoalveolar)
∙ se vor utiliza instrumente sterile şi recipiente (containere / recoltoare) sterile.