Nanoparticulele de bilirubină în ameliorarea inflamației

pulmonare alergice

Astmul, o boală inflamatorie cronică a căilor aeriene este relativ tratat de

către corticosteroizi inhalatori, însă efectele secundare asociate cu utilizarea pe
termen lung ai acestor agenți implică nevoia de opțiuni terapeutice alternative
bazate pe alte moduri de acțiune.

Bilirubina, un antioxidant endogen puternic și o moleculă

antiinflamatoare, a demonstrat că ameliorează simptomele astmatice; totuși,
uzul sau clinic a fost limitat datorită insolubilității sale în apă și toxicității
potențiale asociate.

În acest articol este descrisă prima aplicație a nanoparticulelor bazate pe

bilirubină (BRNP) ca medicament pentru tratamentul bolilor inflamatorii
pulmonare alergice.

BRNP-urile s-au preparat direct din bilirubină conjugată în soluție apoasă

și au avut un diametru hidrodinamic de ~ 100 nm. Deoarece limfocitele T
helper de tip 2 (Th2) alergenic joacă un rol-cheie în patogeneza și progresia
astmului alergic, efectele BRNP asupra răspunsurilor imunitare Th2 au fost
investigate atât in vivo, cât și in vitro.

BRNP după injecția intravenoasă (i.v.) au prezentat o concentrație serică

mult mai mare și un timp de circulație mai lung față de injecția intraperitoneală
(i.p.) a BRNP sau a bilirubinei neconjugate (UCB).

Efectele anti-astmatice ale BRNP au fost evaluate cu ajutorul șoarecilor

de laborator ce sufereau de astm bronșic indus cu ajutorul unor alergeni.

În comparație cu UCB (bilirubina neconjugată), tratamentul cu BRNP a

suprimat simptomele astmului alergic experimental și a ameliorat dramatic
inflamația pulmonară alergică legată de limfocitele Th2.

Prin urmare aceste rezultate demonstrează ca BRNPs este un important

agent imunomodulator care poate fi util ca terapie pentru boala inflamatorie
pulmonara alergica si alte afectiuni mediate imunitar.
 Astmul este o boală cronică inflamatorie a căilor aeriene asociată cu
obstrucția reversibilă a fluxului de aer, hiper-responsivitate a căilor respiratorii
persistente (AHR) și remodelarea căilor aeriene care afectează mai mult de 300
de milioane de indivizi la nivel global.Până în prezent, cea mai buna opțiune
pentru tratamentul astmului bronșic este inhalarea corticosteroizilor, care pot
menține simptomele astmului sub control în fiecare zi.

Cu toate acestea, utilizarea pe termen lung a unor astfel de

corticosteroizi poate provoca diferite efecte secundare și, prin urmare, există o
nevoie de opțiuni terapeutice alternative bazate pe un mod de acțiune diferit
de cel al medicamentelor existente.

Recent, Ohrui și colaboratorii săi au raportat că simptomele astmatice

sunt calmate temporar în timpul icterului, sugerând un rol benefic al creșterii
nivelului de bilirubină în ser. Mai mult, bilirubina s-a dovedit a fi o puternică
moleculă antioxidantă și antiinflamatorie.

De fapt, eficacitatea antiinflamatoare a acesteia a fost demonstrată într-

o varietate de boli inflamatorii, variind de la inflamația cronică la cea acută. În
ciuda acestei eficacități promițătoare, aplicațiile clinice ale UCB au fost limitate
datorită insolubilității sale în apă și a toxicității potențiale asociate cu celulele
neuronale și eritrocitele.

Foarte recent s-au dezvoltat nanoparticule bazate pe bilirubină (BRNP)

cu un diametru de ~ 100 nm, compus din bilirubină conjugată, solubilă în apă.

În timp ce BRNP-urile păstrează efectele cheie antiinflamatorii ale UCB-

ului părinte, așa cum s-a demonstrat în modelul colitei la șoareci, ele nu
provoacă icter.

BRNP după injecția intravenoasă (i.v.) au prezentat o concentrație serică

mult mai mare și un timp de circulație mai lung față de injecția intraperitoneală
(i.p.) a BRNP sau a bilirubinei neconjugate (UCB).
 Materiale si metode
Materiale

Au fost achiziționați: anti-interferon γ, anti-interleukină-4, anti-

interleukină-5, anti-interleukină-13 și anti-interleukină-17A pentru utilizare ca
anticorpi de captare.

Anticorpii de detecție cu anticorpi conjugați au inclus anti-interferon-γ,

anti-interleukină-4, anti-interleukină-5, anti-interleukină-13 și anti-interleukină-
17A.

Sinteza BRNP

Bilirubina conjugată s-a sintetizat așa cum s-a descris anterior. Aceasta (2
mmoli) s-a dizolvat mai întâi în 200 ml cloroform, apoi s-a format un strat de
film prin evaporarea solventului, după care stratul de film a fost hidratat cu apă
distilată și sonicat timp de 10 min pentru a obține BRNP de dimensiuni
uniforme. Dimensiunea hidrodinamică și potențialul zeta al BRNP-urilor au fost
caracterizate folosind Zetasizer Nano ZS90.

Morfologia BRNP a fost examinată prin microscopie electronică de

transmisie (TEM) și prin microscopie electronică de scanare (SEM) utilizând
sistemele Tecnai TF30 ST (FEI Co., Hillsboro, OR, SUA) și, respectiv, Magellan
XHR 400L (FEI Co.). Soluția diluată de BRNP a fost utilizată pentru studiile in
vitro și in vivo.

Șoareci C57BL / 6 de tip sălbatic au fost achiziționați de la Jackson

Laboratory (Bar Harbor, ME, SUA) și crescuți fără agenți patogeni. Șase șoareci
de sex feminin de șase săptămâni au fost utilizați pentru acest studiu. Îngrijirea
animalelor și procedurile experimentale au fost efectuate cu aprobarea
Comitetului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din Coreea, Institutul de
Știință și Tehnologie din Asia.

S-a injectat BRNP (4 mM; 50 mg / kg) sau UCB (4 mM; 11,6 mg / kg)
intravenos sau intraperitoneal la șoareci. La un interval de timp predeterminat,
sângele a fost colectat din plexul orbital după ce șoarecii au fost sacrificați prin
expunerea la gazul izofluran.
 Probele de sânge au fost amestecate în tuburile BD Microtainer și
centrifugate la 15.000 x g timp de 5 minute.

Supernatantul (serul) a fost colectat și concentrația serică a componentei

bilirubinei din BRNP sau UCB a fost măsurată utilizând un analizor de chimie
automat Hitachi 7080 din cadrul Laboratorului de Cercetare a Animalelor de la
Universitatea Națională Chungbuk.

Inducerea astmului alergic

O protează alergenă extrasă din Aspergillus oryzae a fost achiziționată și

reconstituită în 1 mg / ml folosind soluție salină tamponată cu fosfat (PBS),
sterilă.

Ovalbumina din ouă Sigma-Aldrich a fost reconstituită în 0,5 mg / ml

folosind PBS steril. Alergenul APO (o combinație a Aspergillus oryzae cu
ovalbumina) a fost amestecat la un raport 1: 9 (v / v) imediat înainte de
administrare. Șoarecilor li s-au făcut cinci administrari intranazale cu 50 ml
alergen APO la fiecare 4 zile (0, 4, 8, 12 și 16).

Pentru administrarea intranazală, șoarecii au fost ușor anesteziați prin

inhalarea de izofluran. Pentru evaluarea efectelor terapeutice ale BRNP,
acestea au fost administrate intraperitoneal sau intravenos înainte de
administrarea APO alergen.

BRNP atenuează fenotipurile astmului experimental

S-au examinat efectele terapeutice ale BRNP cu ajutorul șoarecilor

astmatici. Recrutarea de eozinofile, metaplazia celulelor calciforme,
hiperproducția mucusului și AHR sunt semnele distinctive ale astmului alergic.

Din modelele de astm bronșic disponibile la șoarece, s-a constatat că

utilizarea alergenului Aspergillus oryzae (A. oryzae), care acționează ca
adjuvant în declanșarea alergiilor, împreună cu ovalbumina de ouă de pui
(OVA), induce o reacție inflamatorie puternică mediată de Th2.

Prin urmare, șoarecilor li s-a administrat proteaza A. oryzae împreună cu

OVA (APO) în zilele 0, 4 și 8 și s-a constatat creșterea AHR și aglomerarea
celulelor inflamatorii în lichidul de lavaj bronhoalveolar (BALF), care indică
inducerea simptomelor de astm alergic.

Pentru a testa eficacitatea BRNP-urilor, a fost creat un model complet de

inflamație pulmonară alergică prin administrarea intranazală de APO șoarecilor
C57BL / 6 de tip sălbatic în zilele 0, 4, 8, 12 și 16.

BRNP-urile au fost apoi administrate intravenos la șoareci în doze de 2,

10 și 50 mg / kg în zilele 12, 14 și 16 (Figura 1).

Fig. 1.

Așa cum este arătat în figura 2 tratamentul cu BRNP în doze de 10 și 50

mg / kg a redus semnificativ AHR comparativ cu șoarecii astmatici netratați,
scăzând simptomele până la niveluri aproape normale, în timp ce doza cea mai
mică (2 mg / kg) nu a fost eficace.

Fig. 2.
 Mai mult decât atât, în comparație cu șoarecii cărora li s-a administrat
fosfat salin (PBS), grupul căruia i s-a administrat APO a arătat o creștere majoră
a celulelor inflamatorii în BALF care a fost substanțial redusă prin tratamentul
cu 10 sau 50 mg / kg de BRNPS (fig. 3).

Fig. 3.

Mai exact, aglomerarea eozinofilelor a fost în mod clar diminuată la

aceste doze mai mari de BRNP (Fig. 4).

Fig. 4.
 Mai mult, tratamentul cu 10 sau 50 mg / kg de BRNP a scăzut nivelurile
de glicoproteine ale căilor aeriene față de cele ale controalelor astmatice
netratate; din nou, 2 mg / kg BRNPs nu au avut o reducere semnificativă (Figura
5).

Fig. 5.

În mod colectiv, aceste rezultate indică faptul că BRNP-urile sunt foarte

eficiente în ameliorarea simptomelor inflamației pulmonare alergice într-un
model specific de șoarece experimental.