Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
printre produsele farmaceutice care se utilizează cel mai frecvent ca bază de prescripție
medicală și se combină frecvent în preparate fără prescripție medicală. În tratamentul clinic,
aceștia acționează prin același mecanism, inhibând sinteza prostaglandinelor și prezintă
diferite niveluri analgezice, antipiretice, antiinflamatorii și antiplachetare. PAR este, de
asemenea, unul dintre medicamentele care se eliberează cel mai frecvent la supradoze. Ca
intermediar sintetic sau produs de degradare hidrolitică primară a PAR, 4-aminofenolul (AP,
fig.1) a fost detectat de obicei în prepararea farmaceutică a PAR. Datorită nefrotoxicității
semnificative, efectului teratogen și potențial carcinogenic [1], conținutul maxim de 4-AP în
medicamente este limitat de Farmacopeea Europeană și Statele Unite [2, 3]. PAR este
metabolizat în principal în ficat în produse nontoxice când se utilizează dozele recomandate.
Cu toate acestea, hepatotoxicitatea și nefrotoxicitatea supradozajului PAR sunt principala
cauză a insuficienței hepatice acute în Occident și reprezintă cea mai mare morbiditate și
mortalitate în cazurile de otrăvire cu medicamente
Din punct de vedere clinic, ASA și PAR sunt formulate în general în medicamente analgezice
în raport de 3: 2. Această combinație este utilizată pe scară largă pentru tratarea febrei și
durerii [5]. Studiile recente au arătat că aspirina poate bloca hepatotoxicitatea indusă de PAR
[6], iar co-formularea ASA cu PAR poate reduce insuficiența hepatică indusă de PAR. În
ficat, ASA se metabolizează rapid și se hidrolizează pentru a produce acid salicilic (salicilat,
SA) și alți compuși, cum ar fi acidul gentisic (GA), acidul saliciluric (SUA) și acidul 2,3-
dihidroxibenzoic (2,3- (Figura 1). Concentrația serică a SA este un indice cheie al intoxicației
cu supradozaj cu aspirină [4], care este clinic
caracterizată prin tetanie și acidoză. Unii cercetători au constatat, de asemenea, că utilizarea
excesivă a ASA sau PAR a fost legată de afectarea rinichiului [7]. Monitorizarea
concentrațiilor serice ale acestor medicamente de coformulare și a produselor lor de degradare
și metabolice este esențială pentru înțelegerea farmacodinamicii și a toxicologiei acestora,
precum și a posibilelor interacțiuni. O metodă analitică sensibilă și selectivă este necesară în
mod urgent datorită complexității matricelor biologice și a concentrațiilor scăzute ale acestor
compuși
Deși unele dintre medicamentele nesteroidiene (PAR, AP, ASA) au fost analizate individual
prin cromatografie în fază gazoasă (GC) [8-10], detecție electrochimică [11-13],
cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) [14-17] LC-MS [18], foarte puține
metode analitice s-au concentrat pe determinarea simultană a acestor coformulări și a
produselor lor de degradare sau metabolice [4, 5]. În ceea ce privește cele mai utilizate
metode de separare prin HPLC, schimbarea ionilor sau modurile de interacțiune hidrofilă sunt
mai preferate decât modul de infuzie de rutină aplicat în mod curent, datorită polarității relativ
ridicate a acestor compuși [19].
În ultimele decenii, tehnicile de microseparare pe bază de capilare au fost introduse ca o
metodă alternativă de separare în analiza farmaceutică [20-22], datorită eficienței lor ridicate,
vitezei și costului redus. Cu toate acestea, există încă o dificultate în separarea eficientă a
medicamentelor acide prin electroforeză capilară (CE), deoarece direcția fluxului
electroosmotic este opusă direcției electroforetice a analitilor acidi. Ca urmare, timpul de
analiză ar fi prea lung sau chiar nu poate fi detectat. Distins de CE, cromatografia lichidă
capilară este o altă tehnică de microseparare bazată pe miniaturizarea HPLC convențional.
Prin urmare, selectivitatea și timpul de analiză a separării cromatografiei lichide capilare
(cLC) pot fi ușor îmbunătățite prin modificarea grupului funcțional al coloanei și fazei mobile.
Unele formate noi de faze staționare, cum ar fi coloana monolitară care și-au demonstrat deja
capacitatea excelentă de separare în LC [23, 24], oferă un mare potențial pentru aplicarea la
cLC. Sensibilitatea scăzută la detectare, care a provenit din foarte mult
volumul mic de injecție va crește cu siguranță prin cuplarea cLC la detectoarele sensibile,
cum ar fi detectoarele electrochimice. Fiind una dintre cele mai cunoscute metode de detecție
electrochimică, detecția amperometrică se dovedește a fi extrem de sensibilă, ieftină, selectivă
și rapidă. Se poate anticipa că cuplarea cLC la detecția amperometrică oferă o abordare ideală
pentru analiza conținutului scăzut de analiți în matricele biologice
În această lucrare am propus combinarea cLC cu detecție amperometrică și utilizarea fazei
staționare monolitice de interacțiune hidrofilă / schimb puternic de anioni (SAX), pentru
rezolvarea problemei de separare și detectare a produselor farmaceutice și metaboliților polari
/ acizi, inclusiv acetaminofen, p-aminofenol, acid salicilic, GA, SUA și 2,3-DBA. Adecvarea
acestei metode pentru evaluarea acestor medicamente în probele biologice a fost demonstrată
prin analiza serului uman spicat
injector, și apoi au fost transportate la supapa cu patru porturi (splitter) prin faza mobilă prin
intermediul pompei. După despicarea în supapa cu patru porturi, debitul a fost descărcat de la
a treia ieșire a separatorului și a intrat într-o coloană de separare sub presiune constantă,
controlată de un regulator de presiune de spate, al cărui capăt a fost conectat la al doilea
orificiu al separatorului și celălalt capăt a fost introdus în flaconul de solvent pentru deșeuri
prin tubul PEEK. Ieșirea coloanei de separare a fost introdusă în celula electrochimică prin
suportul electrodului și legată la pământ. A fost utilizată o celulă electrochimică prealiniată,
compusă din trei electrozi (electrod de lucru cu diametru de 300 mm, electrod auxiliar platină
și electrod de referință Ag / AgCl), în combinație cu un detector amperometric potențial de
LC-4C (BAS, West Lafayette , ÎN SUA). Colectarea datelor a fost efectuată utilizând o stație
de lucru cromatografică (Qianpu Software, Shanghai, China). Coloana de separare a fost o
coloană monolitată poli (PETA-co-DMMSA-co-AETA) (50mm id 375mm od cu o lungime
de 28 cm). Experimentele voltametrice ciclice au fost efectuate pe o stație de lucru
electrochimică CHI 660 (Shanghai CH Instruments, China) constând din trei electrozi identici
cu cei utilizați în detecția amperometrică. Toate experimentele au fost efectuate la temperatura
camerei (251 ° C).
out utilizând sistemul cLC și s-a utilizat un mod de eluare izocratic. Fazele mobile au fost
preparate prin amestecarea unui volum adecvat de tampon ACN și Tris (20 mmol / L, pH 8,5)
și au fost livrate de pompă la o rată constantă de flux de 0,05 ml / min. Soluțiile standard de
analiți au fost injectate într-o supapă cu șase porturi și apoi au fost livrate în coloana de
separare prin fază mobilă după despicare. O presiune suplimentară (500 psi, 3,1 MPa) a fost
aplicată la intrarea în coloană. Potențialul de lucru al electrodului cu disc de carbon a fost
stabilit la 10,9 V (față de Ag / AgCl).
Eșantioanele serice au fost obținute de la pacienți cu vârste cuprinse între 74-81 ani cu boală
cardiacă coronariană (furnizată de Departamentul de Laborator Clinic, Spitalul General
Fuzhou). O sută de microlitri de ser s-au amestecat cu 10 ml de soluție stoc de 1 mg / ml și s-
au amestecat bine cu un amestecător turboreact cu miniatură. Înainte de analiză, proteinele au
fost precipitate prin adăugarea a 200 ml de ACN și 30 s de turburare. Probele au fost apoi
centrifugate la aproximativ 13 000 rpm timp de 5 minute la temperatura camerei. În final,
supernatanții au fost colectați, diluați cu ACN și apoi au fost analizați prin cLC cu detecție
amperometrică
ACN este de obicei selectat ca modificator organic în HPLC pentru vâscozitatea sa scăzută.
Pentru a examina efectul conținutului de ACN asupra selectivității de separare și reținerea
analiților selectați, conținutul ACN în faza mobilă (20 mmol / L, pH 8,5) a fost variat de la 80
la 88% v / v
(Figura 2). S-a constatat că factorii de retenție (k) ai metaboliților aspirinei înalți polari au
crescut cu creșterea conținutului de ACN în faza mobilă, ceea ce a demonstrat un mecanism
tipic de reținere a interacțiunii hidrofilice între substanțele dizolvate și faza staționară, în timp
ce nu a existat un efect evident al ACN conținutul pe k de analiți polari moderați, AP și PAR.
Când concentrația de ACN a crescut, polaritatea fazei mobile a scăzut, iar interacțiunile
hidrofilice și SAX dintre analizele polar și faza staționară au fost întărite; prin urmare,
ameliorarea atât a retenției, cât și a separării acestor analiti. Cu toate acestea, timpul de
analiză mai lung a fost de asemenea necesar în cazul utilizării unui conținut mai mare de
ACN. Pentru a obține cel mai bun compromis în timpul rezoluției și analizei, a fost selectat
84% v / v de ACN în faza mobilă.
A fost introdusă presiune suplimentară în acest sistem pentru a crește viteza fazei mobile,
pentru a evita formarea bulei și pentru a îmbunătăți repetabilitatea. Efectul de a varia
presiunea suplimentară asupra separării analitilor a fost studiată în intervalul de la 1,5 la 7,1
MPa prin modificarea regulatorului de contrapresiune de la 250 la 1000 psi. Odată cu
creșterea presiunii suplimentare, timpul de analiză pentru toate substanțele dizolvate a fost
dramatic redus la un sfert, adică de la 18 la 4 minute, iar curenții de vârf au fost mult
îmbunătățiți. Cu toate acestea, o presiune suplimentară prea mare va face ca separarea să fie
mai gravă. Pentru a obține o rezoluție mai bună și un timp de analiză mai scurt, 3.1 MPa a fost
selectată ca presiune suplimentară.
Pentru analiza cLC-AD a acetaminofenului, p-aminofenolului și a patru metaboliți ai
aspirinei, o coloană monolit poli (PETA-co-DMMSA-coAETA) ca fază staționară, o fază
mobilă constând din ACN 84% v / v și 16% / v Tampon Tris-HCI (20 mmol / l, pH 8,5) cu
viteză de curgere 0,05 ml / min, presiune suplimentară de 3,1 MPa (500 psi) și potențial de
lucru 10,9 V (față de Ag / AgCl) considerate ca fiind condițiile optime de separare și
detectare. Cromatograma cLC în condiții optime este prezentată în figura 5. Șase analiți pot fi
separați în timp de 8 minute, ceea ce este ușor mai rapid decât utilizarea HPLC [4] pentru
PAR și SA sau CE [30] pentru GA, SA și SUA. Datorită utilizării modului HI / SAX de
monolit și a unui detector AD foarte selectiv, care sunt potrivite pentru analiții polari
electroactivi, metoda propusă se îndepărtează de procedurile de curățare a probei
consumatoare de timp și de eluția cu gradient care sunt întotdeauna necesare prin HPLC- UV
sau MS [18] în testul matricei biologice complexe, reducând astfel foarte mult timpul total de
analiză. În plus, eficacitatea coloanelor variază de la
Au fost obținute 33 000 până la 53 000 plăci / m pentru toți analiții. În comparație cu
rezultatele obținute pe coloanele capilare cu schimb de anioni [31,32], este destul de evident
că eficacitatea de separare și forma de vârf a analitului anionic sunt mult îmbunătățite prin
utilizarea coloanei monolitice HI / SAX.
Validarea metodelor de analiză prin cCC cuplată cu detecția amperometrică folosind coloana
monolită a fost examinată în termeni de liniaritate, sensibilitate și repetabilitate în condiții
optime. Calibrarea externă a fost utilizată în acest experiment. Fiecare punct al graficului de
calibrare corespunde valorii medii a trei măsurători independente ale ariei vârfului. Valorile
analitice ale meritului sunt prezentate în Tabelul 1. În condițiile optimizate, s-au determinat
șase compuși până la 10-50 ng / ml (LOD, S / N53), care au fost mai mici decât cei ai HPLC-
UV SA au fost 36 și 107 ng / ml) [4] și CELIF (LOD din SA, SUA și GA au fost 160, 140 și
120 ng / ml) [30]. Metoda cLC-AD propusă a oferit o gamă liniară de concentrație largă de
trei ordine de mărime pentru fiecare analit care este superioară altor rapoarte și ar putea
satisface cerințele analizei clinice. Deviațiile standard relative intraday și intermediare (RSD)
(n55) ale timpului de retenție au fost în intervalul de 0,26-0,90 și, respectiv, 0,46-3,1%, în
timp ce valorile intra și intraday pentru vârf a fost cuprinsă între 2,4 și 8,9% (a se vedea
Tabelul informațiilor de susținere S1), care este relativ mai mare decât cel al HPLC-UV și
apropiat de cel al HPLC-MS-MS [15] sau CE. Reproductibilitatea mai puțin dorită în acest
caz ar putea fi datorată unui
volumul injecției la nivelul nanoliterului și influența poziției electrodului asupra detectorului
electrochimic.