FACTORII CARE DECID MULTIPLICAREA

“ IN VITRO” LA UNELE SPECII FLORICOLE

( rezumat)

Scopul şi obiectivele lucrării

Majoritatea cercetărilor de până acum folosesc un număr foarte

redus de explante, iar metodologia de lucru este de abia schiţată. Din
această cauză adesea se întâmpină greutăţi în aplicarea rezultatelor
obţinute. Anumite informaţii prezintă omisiuni voite, iar modul de
valorificare în practică a cercetărilor nu este decât sumar prezentat, toate
având ca scop prevenirea concurenţei.
În lucrarea de faţă ne-am propus să conturăm factorii care decid
multiplicarea “ in vitro” la unele specii floricole mai ales la garoafe, în
condiţiile specifice laboratorului de cercetare de la SC SERE CODLEA
SA scontând ca rezultatele obţinute să servească unor scopuri practice,
impuse de necesitatea găsirii unor mijloace eficiente pentru
multiplicarea garoafelor în marea producţie.
Experienţele efectuate au avut ca punct de plecare meristemul de
garoafă, iar obiectivele cercetărilor s-au referit la :

 influenţa condiţiilor climatice la cultura de meristeme a

garoafelor

 influenţa compoziţiei mediului de cultură

 cultura de meristeme şi neoformarea de plantule înrădăcinate

 cultura de calus

1
  înmulţirea vegetativă “ in vitro”

Cultura “in vitro” a meristemelor constituie, la garoafe, o tehnică

cu largi aplicaţii, care a fost folosită în experienţele noastre atât în
scopuri practice, regenerarea la plante libere de virusuri, înmulţirea
rapidă, neoformarea de material săditor cu valoare biologică ridicată
etc., cât şi pentru aprofundarea unor studii fundamentale, privind aspecte
ale diferenţierii şi dediferenţierii celulare, a totipotenţei celulelor vii.
 Cercetările noastre au debutat cu observaţii morfologice şi
fiziologice asupra diferitelor tipuri de meristeme în cultura “in
vitro” şi “in vivo”. Cu această ocazie, s-a stabilit că meristemul de
garoafă poate fi împărţit în cinci zone de caracteristici citologice şi
morfofuncţionale specifice, fără a stabili o delimitare categorică
între acestea.
 Meristemul tipic la garoafă este reprezentat de domul meristematic,
care are o înălţime de 0,15 - 0,20 mm şi o lăţime de 0,2 - 0,3 mm.
Datorită dimensiunilor reduse, el a putut fi explantat cu mari
dificultăţi şi cu riscul de a fi distrus sau dezorganizat, caz în care
urmările sunt drastice asupra evoluţiei ulterioare în cultura “in
vitro”.
 Prelevarea de meristeme mai mari de 0,2 - 0,4 mm, care conţin şi
zona organogenă (cu primordii foliare), a avut un efect pozitiv
asupra evoluţiei explantului.
 Datorită faptului ca la nivelul primordiilor foliare au fost detectate
urme ale viitorului ţesut procambial, care face joncţiunea cu
cordoanele precambiale de la celelalte niveluri, există pericolul real
de contaminare cu infecţii sistematice, iar eliberarea de virusuri prin
cultura de meristeme devine incertă.
 Între meristemele apicale şi cele axilare există similitudini, ambele
putând fi folosite cu succes în cultura “in vitro”. Totuşi, datorită
conţinutului diferit de constituenţi endogeni, evoluţia acestor
meristeme “in vitro” manifestă reacţii specifice.

2
 Pentru a putea surprinde meristemul în perioada de creştere
vegetativă, se recomandă, pe baza observaţiilor făcute, ca prelevarea
să se facă numai la butaşii cu minimum 6 internoduri vizibile
(indiferent de anotimp).
 Cultura de meristeme prezintă avantajul de a putea fi efectuată pe tot
parcursul anului, indiferent de factorii climatici externi, cu condiţia
asigurării condiţiilor optime de mediu; lumina şi temperatura.
 Cercetările efectuate au demonstrate că fotoperioada optimă este de
18 ore, având şi avantajul valorificării maxime a consumului de
energie electrică pentru neoformarea de plantule.
 Tot din considerente de economisire a energiei electrice, ca şi pentru
asigurarea unor neoplantule de calitate, intensitatea luminoasă de
2400 lucsi a fost considerată ca optimă.
 Calitatea luminii nu a influenţat semnificativ evoluţia meristemelor
“in vitro”. Flourescenţa prin tuburi Daylight de 40 W a asigurat o
bună neoformare de plantule.
 Temperaturile experimentate nu au produs modificări semnificative
în neoformarea de plantule. Considerăm, totuşi, că temperatura de
20 ± 20C, asigurată pe întregul parcurs al culturii “in vitro”, este
optimă, deoarece calitatea neoplantulelor a fost superioară celor
obţinute la temperaturi mai mari, care au manifestat evidente semne
de vitrificare.
 Mediul de cultură influenţează major evoluţia meristemelor “in
vitro”, în special prin conţinutul de macroelemente, hormoni şi
datorită glucidelor. Efectul macroelementelor, vitaminelor şi al pH-
ului s-a resimţit în mai mică măsură.
 Utilizarea mediului Murashige-Skoog (macro-, microelemente,
vitamine, glucide) a dus la cea mai bună neoformare de plantule
înrădăcinate, dovedindu-se superior celorlalte medii.
 Prin utilizarea unei balanţe hormonale echilibrate cu 1μm NAA şi K,
s-au obţinut neoplantule înrădăcinate de bună calitate, fără calus
bazal şi cu foliaj nevitrificat.

3
 Creşterea concentraţiei de citochinina ( K=20μm ), în raport cu
auxina (NAA=1μm), a dus la proliferarea abundentă de lăstari
bazali. Prin inversarea raportului dintre citochinina ( K = 1μm ) şi
auxină ( NAA = 20μm) s-a realizat o calusare abundentă a
majorităţii meristemelor.
 În scopul optimizării neoformării de plantule înrădăcinate, se
recomandă ca mediul de cultură să conţină zaharoza, în cantitate de
30 g/l, iar în lipsa acesteia, glucoza 40 g/l. pH-ul optim al soluţiei
este 5,5 - 5,75.
 Studiul efectuat asupra posibilităţii de neoformare de plantule
înrădăcinate pe un singur mediu şi pe două medii de cultură a
evidenţiat faptul că utilizând formularea Murashige-Skoog (1962)
cu 0,5 μm NAA şi K s-au obţinut 52,11% neoplantule înrădăcinate,
iar folosind două medii (de neoformare şi separate de înrădăcinare)
s-au obţinut 60,55% neoplante înrădăcinate. Datorită cheltuielilor
duble cu cele două medii de cultură, utilizarea a două medii de
cultură nu este economică, pentru că sporul de neoplantule nu
compensează dezavantajele menţionate.
 Tipul de meristem a influenţat semnificativ neoformarea de plantule
înrădăcinate. Evoluţia cea mai bună a avut-o meristemul apical
(54,44%) şi apoi cel auxiliar de vârf (49,55%) şi auxiliar de internod
(39,55%).
 Mărimea meristemului a influenţat, de asemenea, foarte semnificativ
neoformarea de plantule înrădăcinate, ea fiind de 3,6 ori mai bună la
meristemele mari de 1 mm ( 67,33% ), faţă de cele mici de 0,2 mm
(18,33%). Paralel cu acestea, s-a constatat o scădere a duratei de
neoformare ( plantule de 2 cm) cu aproape trei săptămâni ( 41 de
zile la meristemele mari, faţă de 61 de zile la meristemele mici).
 Variaţia sezonală a influenţat semnificativ neoformarea, ea fiind
maximă primăvara ( luna aprilie 52,33% ) şi minimă vara ( luna
iulie 40,33% ).

4
 Pregătirea fiziologică diferită a plantulelor tinere şi adulte,
vegetative sau cu flori, a influenţat, prin conţinutul de componente
endogene din meristeme, neoformarea de plantule înrădăcinate, care
a fost maximă (47% ) la plantele tinere vegetative şi minimă
(37,22% ) la cele adulte cu flori.
 Prelevarea de meristeme apicale cu mărimea de circa 0,5 mm,
efectuată pe parcursul experienţei ( în toate anotimpurile ), de la
butaşi tineri vegetativi, de la diferite soiuri de garoafe, a dus la
neoformarea a 45,98% plantule înrădăcinate, din tabelul
meristemelor explantate.
 Capacitatea de neoformare de calus nu a fost influenţată de mărimea
meristemului ( 0,3 mm sau 0,6 mm), realizându-se o calogeneză de
peste 90% ( 90,33% şi 90,67% ). Prelevarea de meristeme de la
plantele vegetative a permis iniţierea de calus la 90,50% din
explante, faţă de numai 66,33% de la plantele cu flori. Meristemele
vegetative au indus calusuri mai grele ( 231mg ), decât cele de la
plantele cu flori ( 173mg).
 Cea mai bună reacţie organogenă ( 27,13% ) s-a manifetat la
calusurile de la plantele vegetative şi meristemele de 0,6 mm, iar cea
mai mică (16% ) la meristemele de 0,3 mm de la plantele cu flori.
 Potenţialul organogen al calusului a scăzut mult în subculturi : de la
22% la calusul iniţial, la 10,67% în prima subcultură, 5,33% în a
doua şi 1% în cea de a treia subcultură. Declinul potenţialului
morfogen şi organogen al calusului a fost asociat cu schimbarea
raportului dintre calusul autotrof verde ( clorofilian) şi cel heterotrof
alb (aclorofilian), în favoarea ultimului.
 Calogeneza şi organogeneza caulinară au fost influenţate de soi. Cea
mai bună regenerare de plantule din cultura de calus s-a realizat la
soiul Katya (19,50% neoplantule înrădăcinate). Nu s-au semnalat
modificări ale culorii sau habitusului la explantele regenerate din
calus.

5
 Înmulţirea “in vitro” prin minibutaşi constituie o metodă eficientă
de multiplicare, care permite înmulţirea a peste 80.000 de plantule
într-un singur an. La estimarea capacităţii de înmulţire prin
minibutaşi, trebuie avută în vedere influenţa pe care o are poziţia
minibutaşului pe neoplantulă ( 82,78% la minibutaşii de vârf şi
51,11% la minibutaşii bazali ), precum şi scăderea capacitaţii de
înmulţire, la 66,62% în cea de a doua subcultură).
 Micropropagarea cea mai bună (din cele 9 variante experimentate)
s-a realizat pe mediul Murashige-Skoog cu 10μm K şi 0,1 μm
NAA. S-a obţinut 74,33% meristeme cu reacţie de proliferare, 5,6
bucăţi fiind media lăstarilor pe explant şi 4,2 rata de multiplicare.
Micropropagarea a manifestat o tendinţă de scădere a ratei de
multiplicare în subculturi, ca fiind de 3,4 lăstari/inocul în subcultura
a treia .
 Stimularea bazală a plantelor micropropagate cu Radistim pudră a
permis înrădăcinarea “in vivo” ( în substrat de perlit cu turbă în părţi
egale ) a 42,70% plante, în lipsa ceţii, şi 72,10% în prezenţa de
ceaţă artificială.
 Înmulţirea prin minibutaşi şi micropropagarea “in vitro” oferă o
bună stabilitate genetică a materialului înmulţit.
 Datorită gradului mare de infecţie cu virusuri ( 97% în plantaţia
floricolă existentă ) s-au iniţiat cercetări în vederea creării de
material săditor cu valoare biologică ridicată, liber de virusuri şi de
boli sistemice. Eficienţa eliberării de virusuri prin culturi de ţesuturi
a fost maximă ( 40,30% ) la meristemele mici ( de 0,2 mm ) şi a
scăzut apoi treptat, o dată cu creşterea mărimii meristemului.
 Efectul eliberării de virusuri este foarte evident exprimat prin
calitatea florilor. Au fost substanţial îmbunătăţiţi toţi parametrii
calitativ studiaţi.
 Producţia de flori la plantele libere de virusuri a fost cu 38,52% mai
mare. Prin cumularea efectului favorabil, datorat creşterii
productivităţii şi calităţii florilor, s-a realizat o creştere a veniturilor

6
 la cultura liberă de virusuri cu 45,12%, comparativ cu cultura
infectată.
 Pe baza experienţelor efectuate, s-a trecut la aplicarea în practică a
rezutatelor obţinute, elaborându-se în acest sens o tehnologie de
producere a materialului săditor liber de viroze.