AN. I.N.C.D.A. FUNDULEA, VOL.

LXXV, 2007, VOLUM JUBILIAR

GENETIC I AMELIORAREA PLANTELOR

REALIZRI N DOMENIUL BIOTEHNOLOGIEI VEGETALE

MARIAN VERZEA, FLORENTINA RDUCANU Biotehnologiile moderne constituie o achiziie cu valoare fundamental i aplicativ a tiinei contemporane. Odat cu dezvoltarea cunotinelor de biologie celular, genetic molecular, biochimie, biofizic, microbiologie i inginerie genetic, a devenit posibil manipularea artificial a informaiei genetice a organismelor vii i, pe aceast baz, au aprut biotehnologiile moderne cu implicaii deosebite n ameliorarea plantelor i animalelor, n producerea de substane farmaceutice i cosmetice, de produse chimice i bioenergetice valoroase. Biotehnologiile sunt privite ca mijloace sigure de nfruntare a problemelor alimentare, energetice, asigurarea resurselor de materie prim i ecologice. Biotehnologia reprezint una din direciile prioritare n numeroase ri pentru obinerea produselor clasice industriale (antibiotice, vaccinuri, factori alergeni, drojdii alimentare, aminoacizi, enzime etc.), conservarea germoplasmei, testarea, selecia, micromultiplicarea i propagarea variabilitii utile, diagnosticarea, profilaxia i tratamentul unor boli cu ajutorul microorganismelor i al celulelor animale i vegetale (inclusiv al celor obinute prin metode de inginerie genetic i celulare), componentelor celulelor i al protoplatilor de biosintez, al enzimelor i al agenilor biologici imobilizai (substraturile i produsele rezultate din procesele biotehnologice cum ar fi: ngrmintele bacteriene i mijloace de protecia plantelor, hormoni i alte produse ale biotransformrii, acizi organici, polizaharide, preparate proteice etc.). Principalele direcii de dezvoltare a biotehnologiilor sunt condiionate, pe de o parte, de cerina n anumite produse i energie concomitent cu acumulrile cantitative de materii prime neutilizabile, inclusiv de deeuri, iar pe de alt parte, de apariia noilor descoperiri n cercetarea fundamental. Biotehnologiile contemporane au implicaii cu totul deosebite n agricultur i industria alimentar, n medicin i industria farmaceutic, n industria chimic i metalurgic, n valorificarea biomasei i producerea de energie neconvenional etc. n agricultur, prin aplicarea metodelor in vitro (embriocultura, embriogeneza, androgeneza, ginogeneza, hibridare somatic), au fost obinute, la aproape toate speciile agricole, plante libere de viroze, multiplicarea genotipurilor rare, somaclone valoroase, plante haploide care contribuie la scurtarea procesului de ameliorare pentru rezistena la diferii factori de stres sau pentru mbuntirea

44

MARIAN VERZEA i colaboratorii

unor caractere calitative. Transferul unor caractere agronomice utile de la speciile slbatice la cele cultivate se poate realiza prin hibridare somatic (fuziunea de protoplati), cunoscut fiind faptul c ncruciarea sexuat convenional ntre specii sau genuri diferite este dificil datorit incompatibilitii. Scurt istoric al cercetrilor de biotehnologie vegetal la I.N.C.D.A. Fundulea Cultura de esuturi i celule vegetale ca problematic nou i are nceputul n ara noastr n anul 1975, iar la Institutul Naional de Cercetare-Dezvoltare Agricol Fundulea, n 1976. Dup o perioad de cercetri metodologice, au fost obinute cu succes culturi de calus i regenerarea plantelor din celule somatice la principalele specii de cereale, plante tehnice i furajere. Cercetrile privind extinderea capacitii de fixare a azotului atmosferic la plante neleguminoase (cereale i plante tehnice) au debutat n anul 1977, cu studiul unor asociaii fixatoare de azot, ntre rdcinile plantelor i microorganismele diazotrofe, capabile s furnizeze partenerului vegetal azot asimilabil i fitohormoni (P a p a c o s t e a i P o p e s c u , 1977). Ca rezultat al unui numr mare de experiene, a fost elaborat un mediu original de cultur (H u r d u c i colab., 1980), i s-au obinut culturi stabile de calus la mai multe specii de cereale i graminee furajere (gru, triticale, orz, porumb, Elymus sp., raigras), att din esuturi somatice, ct i din polen. S-a reuit, de asemenea, inducerea i meninerea de culturi stabile de calus la floarea-soarelui, lucern i soia. Un interes deosebit a fost acordat simbiozelor asociative la porumb, gru i graminee cu bacteriile din genul Azospirillum, demonstrndu-se faptul c aceste sisteme plastice sunt condiionate n special de genotipul plantei i agrofond. n scopul ameliorrii acestor simbioze asociative naturale (rizogeneze diazotrofe) a fost urmrit reacia diferitelor genotipuri de porumb i de gru la inocularea experimental cu mai multe tulpini bacteriene. Concomitent, s-a studiat modul n care asociaiile bacteriene au asigurat parial necesarul de azot prin procesul de fixare biologic, precum i aportul la creterea produciei (P o p e s c u i colab., 1981). Paralel cu aceste cercetri au fost iniiate din anul 1981 i lucrri de transfer de informaie genetic nif la plante neleguminoase (P o p a i P o p e s c u , 1983). Regenerarea plantelor din esuturi cultivate s-a realizat cu randament satisfcator att pe calea embriogenezei somatice, ct i prin organogenez somatic, la urmatoarele specii: Triticum aestivum, Triticum durum, Triticale, Hordeum vulgare, Oryza sativa, Zea mays i Lolium multiflorum, selecionndu-se dintrun inocul iniial linii din calus embriogen din care s-au regerat ulterior un numr mare de plante la gru i raigras (P a l a d a , 1984 b). n programele de ameliorare, se remarc n mod deosebit lucrrile privind androgeneza la orez i triticale (V e r z e a, i colab., 1982). Pe aceast cale, plante haploide i dublu haploide (DH) sunt utilizate n programele de ameliorare pentru crearea de noi soiuri de orez i triticale. Avantajele aplicrii metodei androgenezei experimentale se regsesc n: scurtarea procesului de ameli-

REALIZRI N DOMENIUL BIOTEHNOLOGIEI VEGETALE

45

orare cu 5-6 ani prin realizarea homozigoiei ntr-o singur generaie, evidenierea genelor recesive, exprimarea plasmagenelor paterne, homozigoie total, soiuri uniforme, mare diversitate genetic i creterea eficienei procesului de selecie. n anul 1989, P a l a d a i colaboratorii au efectuat studii privind optimizarea culturii anterelor i obinerii haploizilor i dubluhaploizilor prin androgenez la gru, triticale i orez. La gru au fost identificate dou surse genetice cu capacitate androgenetic i s-au obinut plante homozigote fertile ntr-o singur generaie la toate cele trei specii de cereale investigate. O alt aplicaie a culturii in vitro este micromultiplicarea clonal a unor genotipuri valoroase. Acest procedeu a fost folosit la raigrasul aristat n scopul constituirii cmpului de clone al laboratorului de ameliorare a gramineelor furajere. Prin aceast metod biotehnologic, n anii 1984-1985 au fost multiplicate 201 genotipuri realizndu-se cmpul de clone de circa 2000 plante anual. Tot n aceast perioad a fost efectuat micropropagarea in vitro metoda meristemelor i a calusurilor meristematice pentru obinerea plantelor de lucern libere de Fusarium ( e r b e a i I t t u, 1984). V e r z e a (1989, 1990), folosind tehnica embryo rescue pentru obinerea hibrizilor gru x secar, a concluzionat c metoda aplicat constituie o cale eficient de obinere a plantelor viabile F1. n anul 1991, P a p a i colaboratorii au efectuat cercetri n scopul testrii potenialului regenerativ n cultura de durat (long term culture) la 21 genotipuri de gru, constatnd c intensitatea procesului de variabilitate somaclonal este direct proporional cu durata culturii. A fost, de asemenea, evaluat variabilitatea cromozomal a calusurilor neregenerative meninute timp de 150 zile prin subculturi repetate. Rezultatele studiului au evideniat faptul c la unele linii pierderea capacitii embriogene este asociat cu variaii numerice i structurale ale cromozomilor, prezente n celulele calusale cu frecven vizibil n funcie de genotip. V e r z e a i colaboratorii (1992) au efectuat numeroase cercetri cu privire la utilizarea androgenezei experimentale la formele hexaploide de triticale i rolul unor factori implicai n obinerea plantelor cu origine polinic. S-a concluzionat c n germoplasma speciei triticale de la I.N.C.D.A. Fundulea exist gene care confer capacitatea de a parcurge androgeneza in vitro. ncruciarea unor linii i soiuri care posed aceast capacitate conduce la obinerea unor hibrizi la care se manifest efectul heterozis pentru acest caracter. n prezent, se obin anual prin androgenez n medie 2000 plante haploide, care sunt utilizate n programul de ameliorare al speciei Triticale. Cercetrile de androgenez la forme hexaploide de triticale (B a d e a i colab., 1992) au avut drept scop stabilirea influenei mediilor de cultur i a genotipului asupra abilitii androgenetice. S-au folosit cinci forme de triticale i 20 hibrizi F1 obtinui din ncruciarea lor. Rezultatele obinute au evideniat faptul c ncruciarea unor linii i soiuri care posed capacitate androgenetic ridicat conduce la obinerea de hibrizi la care se manifest efectul heterozis pentru acest caracter.

46

MARIAN VERZEA i colaboratorii

C e a l c u i colaboratorii (1992) au efectuat studii referitoare la controlul biochimic al embriogenezei somatice la lucern i au evideniat specificitatea de soi i de tip de explant a peroxidazei la trei soiuri cu potenial embriogen diferit. Din esuturile cultivate in vitro au fost identificate dou tipuri de zimograme caracteristice pentru calusul embriogen, respectiv neembriogen. n 1993, V e r z e a i colaboratorii au studiat embriogeneza somatic la formele parentale i hibrizi F1 rezultai din ncruciri dialele (6 x 6) la triticale 6x, n vederea identificrii genotipurilor hexaploide care s posede capacitate androgenetic ridicat i acumularea unor date care s contribuie la elucidarea unor aspecte privind determinismul genetic al abilitii androgenetice. S-a constatat c performana per se a prinilor nu este reflectat ntr-o performan similar la combinaiile hibride n care sunt implicate. Selecia prinilor pentru programul de ncruciri trebuie efectut pe baza analizei capacitii lor de combinare. Diferenele mari obinute n privina valorilor nregistrate la hibrizii reciproci sugereaz ideea influenei citoplasmei asupra intensitii exprimrii diferitelor componente ale capacitii androgenetice. Primele informaii privind rezistena la nivel celular la stresul salin, la lucern, au fost furnizate de ctre C e a l c u i V a r g a (1994), care au raportat obinerea de linii celulare tolerante la salinitate. Studii ulterioare efectuate la nivel biochimic (activitatea peroxidazei, chitinazei i coninut n prolin) au evideniat o cretere a toleranei la salinitate a plantelor generaiei R1. Prin metode biotehnologice (utiliznd selecia in vitro la nivel celular) i metode clasice de ameliorare, a fost creat soiul Sigma, soi cu nsuiri superioare de producie i calitate superioar a furajului (distinctivitate, stabilitate, omogenitate) fa de soiurile martor Adonis i Selena (V a r g a i colab., 1994). M o r a r u i R d u c a n u (1994) au efectuat studii privind cultura de antere la specia Triticum aestivum, lund n studiu 10 genotipuri de gru de toamn create n Romnia, 5 dintre ele fiind cunoscute ca fiind purttoare ale translocaiei 1B/1R. S-a constatat c genotipurile purtatoare ale translocaiei 1B/1R au manifestat o pretabilitate superioar, asigurat statistic, la toi parametrii studiai, iar frecvena plantelor verzi/100 antere cultivate au fost semnificativ corelate cu frecvena anterelor cu rspuns i rata regenerrii, dar nu i cu producia de embrioizi i frecvena plantelor albinotice. La gru i triticale (M o r a r u i colab., 1994) au fost investigai diferii ageni selectivi (NaCl, PEG i ABA), n vederea testrii i seleciei pentru rezistena la diferii factori abiotici de stres (salinitate, stres termic/hidric). A fost evideniat existena corelaiilor pozitive ntre reacia genotipurilor n condiii in vitro, n prezena agenilor selectivi i comportamentul plantelor n condiii de stres de aceeai natur, in vivo. n perioada 1994-1996, au fost efectuate studii privind elaborarea unor metode de testare i selecie in vitro pentru rezistena florii-soarelui fa de patogenii Sclerotinia sclerotiorum i Phomopsis helianthi. Rezultatele acestor studii s-au concretizat prin elaborarea a doua metode eficiente de testare/selecie a materialului de ameliorare, utiliznd embriocultura i drept agent selectiv filtratul patogenilor respectivi. n ceea ce privete metoda de testare a florii-soarelui pentru rezistena la patogenul Phomopsis helianthi, aceasta este o metod relativ mai uor de efectuat

REALIZRI N DOMENIUL BIOTEHNOLOGIEI VEGETALE

47

(deoarece acest patogen, spre deosebire de Sclerotinia, nu manifest forme de atac diferite i control genetic diferit (n funcie de forma de atac), este sigur i rapid, putndu-se afla gradul de toleran al materialului de ameliorare n maximum 21 de zile. Pentru Sclerotinia sclertotiorum se recomand utilizarea amestecurilor de filtrate, att dup forma de atac, dar i din zone ecologice diferite, deoarece din aceste studii s-a observat c virulena este influenat i de factorii de mediu, n funcie de zona ecologic de unde s-a prelevat izolatul (R d u c a n u, 1996). n 1992, 1994, 1996, M a x i m i colaboratorii au efectuat studii privind capacitatea de regenerare in vitro la peste 40 de soiuri i linii de orz i orzoaic de toamn, utiliznd ca explante embrioni imaturi. Au fost identificate linii cu nalt potenial embriogen i capacitate de regenerare. De asemenea, au fost identificate genotipuri de porumb cu capacitate mare de regenerare in vitro. Aceiai autori au efectuat studii privind tolerana la ioni de Al3+ a calusului neembriogen/embriogen de orz i orzoaic. S-a constatat c variaia greutii calusului dup perioada de selecie a fost corelat cu tipul de calus utilizat, calusul neembriogen nregistrnd modificri minime, deoarece situsul activ de fixare a ionilor de Al3+ este reprezentat de membranele celulare i nucleele celulelor n diviziune activ. Rezultate ale unui studiu privind potenialul embriogen la unele genotipuri de gru comun, linii i soiuri romneti i strine, n care s-a urmarit identificarea tipurilor de calus embriogen i stabilirea unor parametri cantitativi, precum i expresia izoenzimelor peroxidaza i esteraza n timpul embriogenezei somatice au fost raportate de C e a l c u i colaboratorii (1996). Autorii au observat c tipul de calus embriogen, prezent cu frecvena cea mai mare, pe parcursul embriogenezei somatice, a fost calusul de tip II cf. nomenclaturii TCA, iar n urma analizei electroforetice a peroxidazei i esterazei, s-a constatat c acestea sunt carateristce fiecrui genotip. Calusurile embriogene au exprimat un numr mai mare de izoperoxidaze iar esteraza a prezentat un polimorfism mai accentuat comparativ cu peroxidaza. Variabilitatea manifestat de ctre peroxidaz sugereaz faptul c aceast enzim poate fi considerat drept marker al capacitii embriogenetice n cultura in vitro, la grul comun. n scopul evalurii variaiei induse la nivelul locilor care codific gluteninele cu greutate molecular mare (beta-amilaza i fosfataza acid), ca urmare a regenerrii din calusuri cu origine diferit: microspori i embrioni imaturi, H a g i m a i colaboratorii (1996) au efectuat cercetri, folosind ca material biologic o linie DH de Triticum aestivum, obinut prin dihaploidizarea unui haploid obinut prin cultura de antere, selecionat pentru aptitudine androgenetic. Rezultatele obinute au evideiat faptul c numrul, frecvena i amplitudinea variaiilor generate de cultura in vitro la nivelul markerilor biochimici studiai au avut valori diferite, n funcie de locii implicai n biosinteza componentelor respective i de originea calusului utilizat. Att la gametoclone, ct i la somaclone a fost nregistrat un singur tip de modificare a compoziei n subuniti gluteninice. n schimb, la gametoclone s-au obinut dou noi tipuri de enzimograme pentru beta-amilaz, iar la somaclone s-au conturat cinci tipuri de enzimograme. n cazul fosfatazei acide nu au fost evideniate modificri induse ca urmare a

48

MARIAN VERZEA i colaboratorii

culturii in vitro sau a regenerrii. Regenerarea din calusuri, prin androgenez, a determinat o frecven mai mare a variaiilor pentru subunitile glutanice cu greutate molecular mare, n timp ce regenerarea din calusuri cu origine n embrioni imaturi a indus o frecven mai mare a variaiilor enzimogramelor betaamilazei. Unele rezultate preliminare obinute n urma hibridrilor interspecifice ntre speciile Phaseolus vulgare i Phaseolus acutifolius, n vederea diversificrii materialului iniial de ameliorare a fasolei cultivate pentru rezistena la arit, au fost raportate de D i n c i R d u c a n u (1996). Astfel, specia cultivat a fost folosit ca form matern iar specia slbatic, purtatoarea genelor de rezisten la ari, ca form patern. Datorit incompatibilitii ntre specii, s-a apelat la tehnica de salvare a embrionilor la 15 zile de la efecturea hibridrilor. Folosind embriocultura au fost obinute plante hibride viabile. M o r a r u i colaboratorii (1997) au efectuat un studiu, utiliznd ca agent selectiv toxina sintetic ZEN (Zearalenone), embriocultura ca metod in vitro, 5 genotipuri de gru de toamn i 3 linii consangvinizate de porumb ca material biologic. Rezultatele studiului au evideniat faptul c utilizarea toxinei ZEN a determinat o reducere a greutii calusului la toate soiurile de gru, comparativ cu varianta martor. Reduceri asigurate statistic s-au nregistrat numai la genotipurile care au manifestat rezisten sczut i la testarea n condiii de cmp. Un studiu privind frecvena induciei de calus embriogen din cultura in vitro a embrionilor imaturi, la cinci specii de cereale de toamn (gru comun, gru durum, triticale 6x, triticale 8x i secara), a evideniat rolul primordial pe care l ocup genotipul, n ceea ce privete frecvena induciei de calus embriogen, la toate cele cinci specii de cereale folosite n studiu. Valori relativ mari ale potenialului embriogen au fost obinute la genotipurile de gru comun, triticale 8x i triticale 6x. La genotipurile de gru durum i mai ales la cele de secar au fost nregistrate valori reduse ale frecvenei induciei de calus embriogen (V e r z e a i C e a l c u, 1997). Cercetrile ntreprinse de M a x i m (1998) au demonstrat faptul c utilizarea androgenezei n ameliorarea orzului i orzoaicei a fost limitat din cel puin trei considerente: obinerea unui procent relativ sczut de plante verzi, influena mare a genotipului asupra rspunsului androgenetic i costul ridicat al mediului de cultur cu Ficoll. Eficiena culturii de antere la specia triticale este, n general, mai mic dect la gru, n special datorit ratei sczute de regenerare de plante verzi. n vederea testrii potenialului embriogenetic, V e r z e a (1998) a iniiat un studiu pe 11 combinaii hibride F1 de triticale, folosite n programul de ameliorare de la I.N.C.D.A. Fundulea. n urma efecturii acestui studiu au fost identificate cinci combinaii hibrde F1 de triticale hexaploide, cu valori ale frecvenei regenerrii plantelor androgenetice de peste dou plante verzi la 100 antere cultivate. Randamentul culturii de antere la formele hexaploide de triticale poate fi mrit semnificativ, prin reducerea substanial a numrului de plante albinotice regenerate. n vederea mbuntirii performanelor tehnicii de cultur a anterelor in vitro la grul comun, V e r z e a (1998) a efectuat un studiu utiliznd un sistem de selecie n trepte. Pentru regenerare s-au folosit trei medii de cultur: P a u k i colab. (1991); Z h u a n g i H u (1983) i C h u (1978). Plantele obinute de pe

REALIZRI N DOMENIUL BIOTEHNOLOGIEI VEGETALE

49

oricare din aceste medii au fost transferate n vederea inrdcinrii pe mediul N6-1, suplimentat cu 2,0 mg AIA /l. S-a remarcat faptul c n treapta a doua i a treia de regeneare s-a obinut un numr mai mare de plante dect la prima treapt i au fost identificate cteva combinaii hibride F1, cu valori de 8,4-18,3 plante verzi la 100 antere cultivate. n scopul evalurii variabilitii genetice a florii-soarelui fa de patogenul Sclerotinia sclerotiorum precum i studiul relaiei dintre simptomele morfologice, coninutul de acid oxalic i activitatea enzimei SKDH, R d u c a n u i colab. (1999) au efectuat un studiu pe patru hibrizi de floarea-soarelui cu niveluri cunoscute de rezisten fa de acest patogen. Plantule obinute aseptic din germinarea embrionilor imaturi au fost transferate n soluii hidroponice, suplimentate cu filtrate de Sclerotinia, i au fost meninute timp de 28 zile n condiii controlate. Analiza varianei pentru parametrii coninut de acid oxalic i activitatea enzimei SKDH, la variana martor, a evideniat diferene asigurate statistic, dar nu i ntre genotipuri, pentru caracterele: nlimea plantei, diametrul bazei tulpinii, greutatea proaspt a capitulului. La cele dou variante de tratament s-au semnalat scderi semnificative pentru toi parametrii studiai; acest fapt ar putea nlesni selecia timpurie a genotipurilor rezistente la acest patogen. M a x i m i B g i u (1999) au analizat 11 genotipuri de porumb, folosind ca explante embrioni imaturi (16-18 zile de la polenizare), n vederea idetificrii acelora cu aptitudini embriogene, n scopul introducerii lor n programul de ameliorare la diferii factori de stres. Au fost identificate patru genotipuri care au format embrioizi cu simetrie bilateral, asemntoare celor zigotici, pe mediu de cultur suplimentat cu sorbitol. n practica ameliorrii curente ca i pentru cercetrile moderne de genetic, generaii haploide de plante se obin prin utilizarea a dou categorii de metode biotehnologice; metode bazate pe embriogenez somatic (androgeneza, microsporogeneza i ginogeneza) i metode bazate pe embriogenez zigotic (zigoi produi prin hibridarea ndeprtat, urmat de eliminarea genomului partenerului polinic i salvarea embrionului haploid prin cultur in vitro. Prin ambele categorii de metode se realizeaz urmatoarele: fixarea variabilitii genetice utile dup primele cicluri de recombinare (F1, F2, F3) prin homozigotare complet ntr-o singur generaie; accelerarea i creterea eficienei seleciei (coresponden perfect/fenotip); reducerea semnificativ (5-6 ani) a perioadei de obinere de noi soiuri; soiurile cu origine dublu haploid corespund ntru totul criteriilor de diversitate, uniformitate i stabilitate genetic (DUS) impuse de UE. Pe de alt parte, cerinele aplicrii cu succes a unui sistem biotehnologic de producere de linii DH sunt reprezentate prin: obinerea unui numr ct mai mare de linii DH la ct mai multe genotipuri de interes; tehnologia sistemului s nu determine variaii somaclonale in vitro (variabilitate intralinie) i liniile DH cu origine n aceeai combinaie hibrid s manifeste o gam ct mai larg de variabilitate genetic. n cercetrile moderne de genetic haploizii i populaiile DH constituie materiale biologice ideale pentru o arie larg de domenii: inducerea de mutaii la nivel haploid; studii de genomic i proteomic (analize cu markeri moleculari i analize QTL, hartare genetic); introgresia de gene utile din germoplasma slbatic; transformarea genetic la nivel haploid etc.

50

MARIAN VERZEA i colaboratorii

La I.N.C.D.A. Fundulea s-au iniiat n 1991 cercetri privind aplicarea sistemelor biotehnologice Zea i Bulbosum pentru inducerea de haploizi i obinere de linii DH la grul comun, grul durum i triticale, respectiv la orzul i orzoaica de toamn i primavar i la orzul gola (G i u r a i M i h i l e s c u, 2000). Stabilirea protocolului de lucru pentru utilizarea celor dou sisteme n condiii experimentale suboptime (ser) s-a realizat pe durata mai multor cicluri de hibridare i a determinat creteri semnificative ale ratelor de succes pentru fiecare din cele 12 faze de lucru ale protocolului (G i u r a, 1993, 1998, 2006; M i h i l e s c u i colab., 1993, 1994, 1995). La grul comun (Triticum aestivum L.), mbuntirile aduse protocolului de lucru au condus la creterea valorilor componentelor ce definesc eficiena producerii de haploizi prin sistemul Zea. Astfel, numrul de cariopse formate per spic lucrat s-a dublat, ajungnd de la o valoare medie de 9,2 n 1991 la 18,8 n 2002 i 16,5 in 2005, iar valoarea medie de embrioni la 100 flori polenizate a crescut de la 8,0 n 1991 la 24,7 n 2002 i, respectiv, 24,1 n 2005. n perioada 1991-2005 n programul producerii de haploizi pentru ameliorarea grului comun au fost cuprinse 265 combinaii hibride F1 de la care s-au obinut 58339 embioni haploizi, din care s-au cultivat in vitro peste 50.000 embrioni. n medie, la grul comun s-au produs n ultimii ani ntre 1500 i 2000 linii dublu haploide ntr-un singur ciclu anual de hibridare gru x porumb, de 30-40 zile. La grul durum (Triticum durum L.) i triticale ncercrile de aplicare a sistemului Zea au fost pentru nceput relativ neconcludente din cauza rspusurilor genotipice foarte difereniate, cele dou specii fiind considerate uneori refractare la aplicarea sistemului Zea. mbuntirea procedeelor de hibridare ca i aplicarea unor combinaii hormonale specifice au condus la creterea eficienei producerii de haploizi la aceste dou specii (G i u r a , 2007). Numrul mediu de cariopse formate/spic la grul durum a crescut de la 11,0 n 1996 la 15,4 n 2004, iar valorile procentuale ale embrionilor haploizi din florile polenizate a variat de la 6,6 n 1996 la 16,7 n 2004. n cazul speciei triticale numrul mediu de cariopse formate pe spic a crescut de la 9,6 n 1995 la 15,6 n 2004 iar procentul embrionilor haploizi din florile polenizate de la 6,4 la respectiv 11,9. Este de ateptat ca perfecionarea protocolului de lucru s permit introducerea curent a sistemului Zea n practica ameliorrii i la aceste dou specii. Primul soi de gru durum, GRANDUR, obinut prin aplicarea sistemului Zea, a fost nregistrat n 2005, iar primele soiuri de gru comun, FAUR i GLOSA, cu origine haploid, au fost nregistrate n 2004, respectiv, 2005. La orz, valorile medii anuale ale parametrilor componeni ai eficienei producerii de haploizi (HPE) au crescut constant, reuindu-se obinerea de haploizi i linii DH la scar industrial. La orzul i orzoaica de toamn valorile medii pentru capacitatea de regenerare in vitro de plante haploide (exprimat prin numrul de haploizi regenerai la 100 embrioni cultivai) au fost cuprinse ntre 4,7 (1992) i 41,1(1999). Eficiena producerii de haploizi (numrul de haploizi la 100 flori polenizate) a crescut semnificativ de la 1,2 (1992) la 16,1 (2006) cu valori maxime de 25,7 la genotipuri de orzoaic de primavar, 27,4 la orzul de toamn, 31,5 la orzoaica de toamn i 36,6 la orzul gola de primavar. Numrul de haploizi indui/spic lucrat a manifestat, de asemenea, o evoluie poziti-

REALIZRI N DOMENIUL BIOTEHNOLOGIEI VEGETALE

51

v. n perioada 19921998, valoarea medie pentru acest parametru a fost de 0,7 crescnd pn la 2,9 n 2003, iar valorile maxime au fost de 4,7 la orzoaica de primvar, 6,7 la orzul de toamn, 7,0 la orzoaica de toamn i de 7,5 la orzul gola (M i h i l e s c u i G i u r a, 1998; G i u r a i M i h i l e s c u, 2000). Sistemul biotehnologic Bulbosum de inducere de haploizi i producere de linii DH a devenit, pe baza rezultatelor obinute, una din componentele principale ale programului de ameliorare a orzului. n medie, anual se produc ntre 500800 linii DH linii de orz i orzoaic de toamn incluse n testri preliminare n reeaua I.N.C.D.A. Fundulea i n testri finale la I.S.T.I.S. (jumtate din liniile testate la I.S.T.I.S. au origine haploid). Programele de inducere de haploizi i producere de linii DH prin sistemele Zea i Bulbosum la grul comun, grul durum, triticale, orzul i orzoaica de toamn i orzul gola au fost incluse n Proiectele Naionale de Cercetare: AGRAL 314, AGRAL 353, BIOTECH 4545, AGRAL33, AGRAL 316 i CEEX 2. n perioada 2003-2006 cercetrile privind rezultatele aplicrii sistemelor biotehnologice Zea i Bulbosum au fost ncadrate n Aciunea de Colaborare European COST 851 (Gametic cells and molecular breeding for crops improvement). ncepnd cu anul 2001, n cadrul Colectivului de Biotehnologie au fost efectuate cercetri finanate prin proiecte naionale. Astfel, R d u c a n u i echipa de cercetare (2001-2003) au efectuat cercetri privind posibilitile de Utilizare a tehnicilor in vitro n ameliorarea lucernei (Medicago sativa L.) pentru rezistena la excesul ionilor de aluminiu din sol (Proiect BIOTECH. 60), iar M o r a r u i echipa au efectuat studii privind Utilizarea metodelor biotehnologice pentru obinerea de genotipuri noi de gru cu rezisten la stresul termic i hidric (Proiect BIOTECH. 55). Ambele proiecte au avut ca obiectv prioritar identificarea i selecia in vitro de genotipuri cu grade sporite de rezisten la factorii abiotici studiai, respectiv obinerea de somaclone de lucern rezistente la aluminiu i linii de preameliorare la gru. Materialul genetic astfel obinut a fost introdus n programele de ameliorare al speciilor studiate. Au fost obinute noi tehnologii de cultur i au fost mbuntite cele deja existente n vederea creterii randamentului de regenerare i aclimatizare a plantelor la transferul de la condiii de cultur in vitro la cele in vivo. Pentru perioada 2006-2008, se afl n derulare proiectul Studii avansate privind posibilitile de prevenire a mbolnvirilor produse de unele specii toxigene de Fusarium sp. n lanul trofic plante animal om, finanat de Programul CEEX, Agral 74, proiect care se vrea a fi un preludiu pentru accesarea de fonduri din cadrul programului FP7 (R d u c a n u i echipa de la I.N.C.D.A., parteneri: Universitatea Ovidius Constana i I.N.C.D.O.C. Palas-Constana).
RESULTS IN PLANT BIOTECHNOLOGY Summary In the practice of current breeding as well as modern genetic research, haploid generations are obtained by using two biotechnological method categories: one of them based on somatic embryogenesis (androgenesis, microsporogenesis and ginogenesis) and the other based on zygotic embryogenesis (zygotes produced by intergeneric crossing followed by the elimination of pollinic partner genome and haploid embryo saving by in vitro culture.

52

MARIAN VERZEA i colaboratorii

By both method categories, one can achieve: fixation of useful genetic variability after the first recombination cycles (F1, F2, F3) by complete homozygosity in one generation acceleration and increasing of selection efficiency (connection/phenotype) significant reduction (5-6 years) of period to obtain new varieties varieties with double haploid origin are in accordance with EU diversity, uniformity and genetic stability criteria (DUS) The programs of haploid induction and double haploid lines production, by systems Zea and Bulbosum in common and durum wheat, triticale, winter, spring and naked barley were included in Research National Programs : AGRAL 314, AGRAL 353, BIOTECH 4545, AGRAL 33, AGRAL 316 and CEEX 2. During 2003-2006, the research regarding the results of Zea and Bulbosum biotechnological system application were framed into COST 851 European Collaboration Action (Gametic cells and molecular breeding for crop improvement"). Starting with 2001, research financed by National Projects were performed as part of Biotechnological team. Thus, Rducanu and research team (2001-2003) were performed research regarding the possibilities of "Using in vitro techniques in alfalfa (Medicago sativa L.) breeding for resistance to soil aluminum ion excess" (Project BIOTECH 60), and Moraru et al. were performed studies regarding Using of biotechnological methods to obtain new winter wheat genotypes resistant to thermic and hydric stress" (Project BIOTECH 55). Both project had as main aim the identification and in vitro selection of genotypes with increased resistance to studied abiotic factors as well as the obtainment of alfalfa somaclones resistant to aluminum and pre-breeding lines in wheat. The genetic material was introduced in breeding program of tested species. New crop technologies were obtained and the current ones were improved to increase the crop regeneration and acclimatization to transfer from in vitro to in vivo culture conditions. For 2006-2008 period, the project Advanced studies regarding the possibilities to prevent the diseases produced by some toxigenic species of Fusarium sp. in plant-animal-human chain", financed by Program CEEX, Agral 74, as an opportunity to access funds of FP7 Program (Rducanu and NARDI team, partners : University Ovidius" Constana and I.N.C.D.O.C. Palas Constana). REFERINE BIBLIOGRAFICE SELECTIVE DINC, VERONICA, RDUCANU, FLORENTINA, 1996 Preliminary results about interspecific crosses between P. vulgaris and P. acutifolius. Romanian Agricultural Research, 5-6: 3335, ISSN 1222-422. GIURA, A., 1993 Progress in wheat haploid production. In: Proc 8th Int. Wheat Genet. Symp. Beijing, China, I: 741-745. GIURA, A., 1998 Wheat haploid production efficiency in wheat maize crosses. In: Current Topics in Plant Cytogenetics Related to Plant Improvement (Ed. T. Lelley), IFA, Tulln, Austria: 303-309. GIURA, A., 2006 Improvement of Zea system protocols for haploid induction in common wheat, durum wheat and triticale. In: Book of Abstracts-Gametic Cells and Molecular Breeding for Crop Improvement: 50 (Cost Action 851, Vienna, Austria, 2006). GIURA, A., 2007 Haploid and doubled haploid lines production by Zeasystem in Triticum durum and triticale. In: Cercetri tiintifice, Seria XI, Horticultur i Inginerie genetic, USAMVB Timioara. Edit. Agroprint, Timioara: 32-37. GIURA, A., MIHILESCU, ALEXANDRINA, 2000 Metode moderne de reducere a duratei programelor de ameliorare la gru i orz. In : Metode de cercetare n cultura plantelor. Edit. Agris, Bucureti: 17-36. HURDUC, N., PALADA, MAGDALENA, 1980 Rezultate privind obinerea i cultura ndelungat a calusului de gru i orz. Analele I.C.C.P.T., XLV: 437-443. MAXIM, P., DU, ZOE, 1996 Aluminium tolerance of barley. Efficiency of in vivo procedures in estimation of genotypic difference. Romanian Agricultural Research, 5-6: 21-29. ISSN 1222-4227.

REALIZRI N DOMENIUL BIOTEHNOLOGIEI VEGETALE

53

MIHILESCU, ALEXANDRINA, BUDE, A., GIURA, A., 1993 Reconsiderarea metodei Bulbosum alternativ de homozigotare rapid a orzului cultivat. Probleme de genetic teoretic i aplicat, XXV (1): 1-26. MIHILESCU, ALEXANDRINA, BUDE, A., GIURA, A., 1994 Increasing efficiency of barley haploid production by treatments with plant growth regular applied in vivo. Romanian Agricultural Research, l: 25-53. MIHILESCU, ALEXANDRINA, GIURA, A., 1995 Production of winter barley haploids by bulbosum system. 1.Crossing compatibility between winter barley Romanian varieties and H. bulbosum. Romanian Agricultural Research, 4: 1-9. MIHILESCU, ALEXANDRINA, GIURA, A., 1998 Sistemul biotehnologic bulbosum la orz 5 ani de aplicare la I.C.C.P.T. Fundulea. Cercetri de genetic vegetal i animal, V: 93-120. MORARU, IRINA, RDUCANU, FLORENTINA, 1994 Response of the Romanian winter wheat genotypes to in vitro anthers culture. Romanian Agricultural Research, 2: 13-19. ISSN 1222-4227. PALADA-NICOLAU, MAGDALENA, 1994 b Results concerning in vitro plant regeneration in cereals and grasses with possible uses in plant breeding. Proceedings of the Int. Symp. Plant tissue and cell culture application to crop improvement: 439. PAPACOSTEA, P., POPESCU, ANA, 1977 Cercetri asupra rizosferei unor graminee din flora spontan. Al XIV-lea Simpozion de biologia solului, Cluj-Napoca, 11-13 noiembrie. POPA, L.M., POPESCU, ANA, 1983 Progrese n ingineria genetic aplicat n agricultur. Probleme de genetic teoretic i aplicat, XII, 1: 881-102. POPESCU, ANA, HERA, CR., PAPACOSTEA, P., BURCEA, MIHAELA, HURDUC, N., SARCA, TR., BURLACU, GH., 1981 Cercetri privind asociaiile de bacterii fixatoare de azot la unele plante neleguminoase. Anale I.C.C.P.T., XLVIII: 529-544. VARGA, P., BADEA, ELENA MARCELA, SCHITEA, MARIA, MARTURA, T., 1994 Sigma the first alfalfa cultivar composed exclusively of somaclones. Romanian Agricultural Research, 2: 73-77. ISSN 1222-422. VERZEA, M., 1998 Inducerea de calus i regenerare de plante din cultura de antere la hibrizi F1 de gru comun (Triticum aestivum). Cercetari de genetic vegetal i animal: 137-149. VERZEA, M., PALADA, MAGDALENA, POPESCU, ANA, 1987 Prezent i perspective n cercetrile de biotehnologie i inginerie genetic. Analele I.C.C.P.T., LV: 26-38. VERZEA, M., BADEA, ELENA, PALADA, MAGDALENA, MORARU, IRINA, RDUCANU, FLORENTINA, 1993 Cultura de celule i esuturi vegetale n ameliorarea cerealelor, plantelor tehnice i furajere. Lucrri tiinifice, XXVI I, partea II. Agronomie, USAMVB Timioara: 138-142. VERZEA, M., BADEA, ELENA, LUPUANCHI, ELENA, MORARU, IRINA, RDUCANU, FLORENTINA 1994 Efectul genotipurilor parentale asupra capacitii androgenetice la hibrizii F1 de triticale 6x. Cercetri de genetic vegetal i animal, IV: 55-62. VERZEA, M., RDUCANU, FLORENTINA, BALDINI, M., RARANCIUC, STELUA, MORARU, IRINA, 2003 Evaluarea variabilitii genetice a unor genotipuri de floareasoarelui fa de Sclerotinia sclerotiorum prin diferite teste de rezisten i analize AFLP. Probleme de genetic teoretic i aplicat: 35-45, ISSN1016-4871. RDUCANU, FLORENTINA, 1998 The using of cells and tissues cultures in sunflower breeding for Sclerotinia sclerotiorum and Phomopsis helianthi resistance. Sunflower year book: 83-84, ISSN 1025-6024. (Doctoral Thesis), ISA, France. RDUCANU, FLORENTINA, VRNCEANU, A.V., PCUREANU, MARIA, 2000 Studies about the influence of Sclerotinia sclerotiorum filtrate on some quantitative and qualitative traits in Romanian sunflower genotypes in vitro and in vivo tested. Proceeding of the 15th International Sunflower Conference, Toulouse: K29 - K34. RDUCANU, FLORENTINA, PETCU, ELENA, MORARU, IRINA, 2004 Rezultate preliminare privind utilizarea tehnicilor neconvenionale n ameliorarea lucernei (Medicago sativa) pentru rezistena la toxicitatea ionilor de aluminiu i la aciditate. Probleme de genetic teoretic i aplicat, 1-2: 31-45. Prezentat Comitetului de redacie la 27 aprilie 2007