Curs 2

Replicarea ADN

ADN-ul mitocondrial

Acizii ribonucleici
Replicarea AND
Replicarea ADN-ului este procesul prin care se sintetizează ADN-ul
A fost descoperit de Watson și Crick: fiecare catenă a unei molecule de ADN se
comportă ca o matriță pentru sinteza unei noi molecule de ADN, iar secvența de
nucleotide din catena nou formată este determinată de complementaritatea bazelor
Are loc în timpul fazei S a diviziunii celulare
Pentru ca procesul replicării să se desfășoare într-o perioadă de timp rezonabilă
sunt necesare mai multe puncte de start ale replicării denumite REPLICONI
Schematic, dubla spirală a ADN-ului se separă în 2 catene complementare formând
o structură în formă de Y numită “furcă de replicare
Etapele replicării
Inițierea
1. Implică recunoașterea regiunilor de pe o moleculă de ADN unde va începe
procesul de replicare
2. Elongarea
- Cuprinde evenimentele ce se desfășoară la o bifurcație de replicare, unde catenele
parentale sunt copiate în catene fiice
3. Terminarea
- Presupune încheierea procesului atunci când molecula parentală a fost complet
replicată
Mecanismele replicării
1.Inițierea
Sub acțiunea unor enzime numite TOPOIZOMERAZE ADN-ul este
despiralizat
Catenele sunt separate de către alte enzime numite HELICAZE, iar
proteinele SSB (strand binding proteins) stabilizează și împiedică
respiralizarea lor
Desfacerea ADN-ului are loc simultan în mai multe puncte denumite
REPLICONI, la aceste nivele apărând “furcile de replicare” sau
bifurcațiile de replicare în formă de Y
ADN-ul devine monocatenar, iar ambele catene se replică simultan,
servind ca matrițe pentru catenele nou formate
Pentru inițierea replicării este nevoie de enzima ARN primază care va
așeza primul nucleotid (ARN primer), iar apoi enzimele necesare
replicării numite ADN polimeraze vor elonga catenele
ADN polimerazele prezintă două caracteristici generale:
Toate ADN polimerazele sintetizează ADN numai în direcția 5’-3’
Nu știu să înceapă sinteza unei catene ci numai să o alungească
adăugând un nucleotid la extremitatea 3’OH
Polimerizarea celor două catene care sunt antiparalele se va face
diferit, deoarece ADN polimeraza se poate deplasa doar în direcția 5’-3’
1. pentru catena matriță 3’-5’ sinteza catenei noi (denumită
leading strand sau catena avansată) se realizează continuu, ARN
polimeraza fiind necesară doar la începutul replicării, iar apoi ADN
polimeraza va adăuga nucleotid cu nucleotid la capătul 3’OH
 2.pentru catena matriță 5’-3’ sinteza catenei noi (denumită
lagging strand sau catena întârziată) se va face discontinuu cu ajutorul
ADN polimerazei gama, începând din punctul mai îndepărtat al furcii de
replicare, prin sinteza unor fragmente de 100-1000 nucleotide numite
fragmente Okazaki, care apoi sunt legate cu ajutorul ADN ligazei
Într-o fază mai avansată a replicării primerii sunt îndepărtați atât din
structura catenei avansate, cât și din cea întârziată, după care golurile
sunt umplute de ADN polimeraza α
Replicarea este bidirecțională , având loc în ambele sensuri,
terminându-se când ADN polimeraza ajunge la capătul repliconului
Replicarea este semiconservativă, moleculele de ADN fiice fiind formate
dintr-o catenă veche și una nouă
ADN mitochondrial
Mitocondriile sunt organite celulare a căror funcție este producerea de
energie
Cu toate că majoritatea ADN-ului se regăsește în nucleul celulei (98%),
mitocondriile prezintă și ele ADN-ul propriu.
Acest material genetic este denumit ADN mitocondrial (ADNmt)
Caracteristicile ADN-ului mitochondrial
Genomul mitocondrial are un ADN circular, bicatenar format din 16.569
perechi baze
Este format din două catene: catena H (grea) și catena L (ușoară)
Într-o regiune mică denumită bucla CR/D în care se află situsul de
inițiere al transcripției și replicării, ADN-ul este alcătuit din 3 catene:
catena H, catena L și o secvență ADN 7S
Genomul mitocondrial este compact și conține 37 de gene (28 pe
catena H și 9 pe catena L)
13 gene codifică enzime implicate în fosforilarea oxidativă
22 gene codifică ARNt (de transfer)
2 gene codifică ARNr (ribozomal)
Genele ADNmt nu conțin introni
ADNmt nu este asociat cu proteine și nu conține ADN repetitiv
Numărul copiilor de ADN variază de la o mitocondrie la alta, fiind între 2
și 20
Codul genetic mitocondrial are o semnificație diferită
ADNmt se transmite exclusiv pe cale maternă
Rata mutațiilor în ADNmt este de 10-15 ori mai mare ca în ADN nuclear
și de obicei se produce fenomenul de heteroplasmie, într-o mitocondrie
existând atât ADN normal cât și cu mutație
Mutațiile ADNmt produc boli neurodegenerative severe cu un debut
tardiv și evoluție progresivă precum:
Miopatia mitocondrială
Sindromul Kearns-Sayre
Neuropatia optică ereditară Leber
Acizii ribonucleici
Acizii ribonucleici sunt macromolecule prin intermediul cărora
informația genetică este exprimată și vehiculată în organismul uman.
Structura lor moleculară este foarte asemănătoare cu a ADN-ului cu
diferențele că:
Glucidul din compoziție este reprezentat de riboză în loc de
dezoxiriboză
Timina este înlocuită cu uracilul
ARN-ul se regăsește în majoritate sub formă monocatenară, însă poate
forma și dublu helix în anumite condiții.
Din totalitatea moleculelor de ARN regăsite într-o celulă care este
activă din punct de vedere metabolic:
a)ARNm 3-5%
b)RNr 90%
c)ARNt 4%
Tipuri de ARN
1.ARN mesager (ARNm
2.ARN de transfer (ARNt)
3.ARN ribozomal (ARNr)
4.Alte tipuri de ARN:
- ARN mic nuclear (ARNsn)
- ARN mic nucleolar (ARNsno)
- Micro ARN (ARNmi)
- ARN interferent mic (ARNsi)
- ARN necodant lung
ARN mesager (ARNm)
1.Rezultă din ARN mesager precursor (pre-ARNm) printr-un proces de
maturare (matisare) care presupune înlăturarea intronilor și protejarea
extremităților
2.Este o copie a secvenței codante a unei gene și servește ca și matriță
pentru sinteza unei proteine
3.Este exportat din nucleu în citoplasmă unde se leagă de ribozomi și
translatat în proteină cu ajutorul ARNt
4.O secvență de trei nucleotide reprezintă un codon care este apoi
tradus printr-un aminoacid în protein
5. Mărimea moleculei ARNm este direct proporțională cu dimensiunea
peptidului pe care îl codifică, de exemplu o secvență codantă de
1000pb va determina formarea unei proteine de 333 aminoacizi
6. Unele ARNm sunt comune tuturor celulelor specificând proteine
house-keeping, iar altele sunt specifice anumitor celule, de exemplu
hemoglobina regăsită doar în hematii
7. într-o celulă există câteva sute de molecule de ARNm diferite
ARN de transfer (ARNt)
1.Se găsește în citoplasma celulelor
2,Este o moleculă mică de ARN formată din 70-93 de nucleotide care
transferă la situsul ribozomal în timpul translației un aminoacid specific
lanțului polipeptidic în formare
3.Într-o celulă care sintetizează activ proteine se regăsesc simultan cel
puțin 50 de tipuri de ARNt
4.Există cel puțin un ARNt pentru fiecare dintre cele 20 de tipuri de
aminoacizi regăsiți în proteine
5. o structură particulară, prezentând un sit pentru atașarea
aminoacidului și trei bucle, dintre care una prezintă o regiune de trei
nucleotide denumită anticodon pentru recunoașterea codonului din
ARNm de care se leagă prin legături de hidrogen
6.Secvența anticodonului ARNt este esențială pentru formarea lanțului
de aminoacizi al proteinei
ARN ribozomal (ARNr)
1.Este sintetizat în nucleu
2.În citoplasmă se combină cu proteine fiind elementul majoritar din
structura ribozomului având atât rol catalizator cât și structural în
sinteza proteinelor prin procesul translației
3.Ribozomii umani conțin patru tipuri de ARNr: 5S; 5,8S, 18S și 28S care
intră în componența celor două subunități (mare și mică)
4.Ribozomii leagă ARNm și realizează sinteza proteinelor
5.Mai mulți ribozomi pot fi atașați simultan la o moleculă de ARNm
6.ARNr este regăsit în cantitate mare în citoplasmă reprezentând 90%
din totalitatea ARN-ului
ARN mic nuclear (ARNsn)
1.Reprezintă un grup heterogen de ARN de 60-360 nucleotide
2.Intră în constituția spliceozomului participând la convertirea pre-
ARNm în ARNm prin secționarea și îndepărtarea intronilor
3.Participă la procesarea altor clase de ARN
4.Regleză factorii de transcripție
 ARN mic nucleolar (ARNsno)
1.Reprezintă un grup heterogen de ARN de 60-360 nucleotide
2.Participă la biogeneza ARNr și ARNt
3.Participă la reglarea matisării alternative a unor gene
Micro ARN (ARNmi)
1.Este o moleculă de ARN de 21-22 nucleotide
2.Blochează translația sau produce degradarea ARNm prin fenomenul
de “interferență ARN”
ARN interferent mic (ARNsi)
1.Este o moleculă de ARN de 20-25 nucleotide
2.Este utilizat posttranscriptional
ARN necodant lung
1.Moleculă de ARN cu o lungime ce depășește 200 de nucleotide
2.Este implicat în reglarea expresiei genelor prin modificarea:
- cromatinei
- a biologiei telomerelor
- amprentare
- inactivarea cromozomului X
 Organizarea ADN în celulă
Materialul genetic este organizat diferit în interfază față de diviziunea
celulară.
În nucleu, în timpul interfazei, fiecare moleculă de ADN este asociată cu
proteine histonice, nonhistonice și molecule de ARN formând un
complex nucleo-proteic numit CROMATINĂ
La începutul diviziunii celulare fibrele de cromatină se spiralizează, se
condensează și formează CROMOZOMII
CROMATINA
Cromatina este structura vizibilă în nucleii interfazici fiind compusă
din ADN, ARN și proteine histonice și nehistonice.
Tipuri de cromatină
Se găsește sub 2 tipuri morfo-funcționale distincte:
a)Heterocromatină
b)Eucromatină
HETEROCROMATINA
CARACTERISTICI
Intens colorată
Relativ condensată, compactă
Genetic inactivă (puține gene sunt active)
Se replică tardiv
Înalt metilată
Alcătuită predominant din ADN repetitiv, bogat în perechi de baze A-T
și histone
Este de 2 tipuri:
Constitutivă :
se găsește la nivelul centromerelor și telomerelor
de obicei este formată din secvențe repetitive, noncodante
Facultativă
- variază, fiind prezentă în regiuni ale genomului care sunt exprimate
diferit în funcție de țesut și de momentul cronologic (Xinactiv)
EUCROMATINA
CARACTERISTICI
Colorată luminos
Mai puțin condensată
Se replică precoce în faza S
Este hipometilată
Este alcătuită predominant din ADN nerepetitiv, bogat în perechi de
bază G-C și proteine nehistonice
Are activitate transcripțională
Reprezintă partea activă genetic a cromatinei
ADN-ul trebuie să fie eucromatic pentru a fi activ, dar nu toată
eucromatina este activă genetic
Proteinele din cromatină
Proteine histonice

Proteine nehistonice (non-histonice)

Proteine histonice
Sunt proteine bazice cu molecule de dimensiuni mici, care au în
compoziția lor un conținut ridicat de lizină și arginină
Funcții importante în celulă:
Asigură stabilitatea moleculei de ADN
Sunt represori ai genelor
Sunt de 2 tipuri:
Histone nucleozomale – H2A, H2B, H3 și H4
Histone internucleozomale – H1
Proteine nehistonice
Sunt bogate în acizii glutamic și aspartic, de aceea au caracter acid
Se găsesc în cantități mici în cromozom, o moleculă la 3000 de
nucleozomi
Se sintetizează pe tot parcursul ciclului celular
Mediază cuplarea ADN-ului cu histonele (funcție)
Împachetarea ADN-ului și
structura moleculară a ctomatinei
Desfășurată molecula de ADN are o lungime de 2m
Pentru a putea fi cuprinsă în spațiul nuclear, molecula suferă procese
de împachetare, compactare, plicaturare.
½ cz = cromatidă
Primul nivel de împachetare
nucleozom
Are forma unui segment de cilindru cu diamentrul de 10 nm, iar
înălțimea de 5,5 nm
Nucleozomul este constituit din:
- Un miez octameric format din 4 perechi de proteine histonice (H2A,
H2B, H3, H4)
- Un segment ADN lung de 146 nucleotide înfășurat de 1 tur și ¾ ori în
jurul octamerului protejând miezul histonic
Nucleozomul este unitatea de repetare, formându-se un lanț “beads of
string”/ “șirag de mărgele” sau fibra de cromatină de 10 nm
Constituirea acestui lanț necesită ADN de legătură (linker) între doi
nucleozomi și histona H1.
ADN-ul linker conține 50-60 pb și este cel mai expus și cel mai sensibil la
acțiunea nucleazelor
Fibra de cromatină de 10 nm este unitatea care se repetă formându-se
un lanț și are o rată de împachetare de 7 și reprezintă 1/7 din lungimea
de AND
Al doilea nivel de împachetare
Solenoidul
Este o răsucire sub formă de solenoid a fibrei de 10 nm.
Sunt 6 nucleozomi per pas de spirală
Această structură este stabilizată de histona H1
Se formează fibra de 30 nm
Fibra de 30 nm reprezintă 1/42 din lungimea ADN-ului
Al treilea nivel de împachetare.Bucla
Fibra de 30 nm formează bucle (domenii) în jurul unui schelet proteic
celular rezultând o fibră de 300 nm (1/750 din lungimea ADN)
Buclele sunt “întinse” atunci când are loc transcripția
Buclele laterale împreună cu scheletul proteic se vor plicatura pentru a
realiza un nivel superior care apare ca fibra de 700 nm din cromatidă la
începutul profazei
Aglomerările de bucle sunt denumite cromomere. Pe măsură ce
cromozomul se condensează cromomerele vecine se unesc și formează
o structură mai mare, banda cromozomială condensată și colorată (G+).
Astfel pe cromozom vor alterna benzi condensate și colorate (G+) cu
benzi mai puțin condensate și colorate (G-)
În timpul metafazei condensarea este maximă și reprezintă 1/15000-
1/20000 din lungimea totală a ADN-ului
CROMOZOMII UMANI
Cromozomii reprezintă forma de organizare a materialului genetic în
timpul diviziunii celulare
Ca număr, structură și morfologie, cromozomii sunt caracteristici
fiecărei specii
La om, în celulele somatice (diploide), cei 46 cromozomi sunt dispuși în
23 perechi (două garnituri 2n=46)
Cromozomii unei perechi se numesc omologi, având aceeași mărime,
structură, distribuție de benzi, morfologie, poziție a centromerului,
conținut în gene, dar origini diferite: unul matern (provenit prin ovul),
celălalt patern (provenit prin spermatozoid)
În celulele somatice la om există 22 perechi de cromozomi autozomi și
o pereche de cromozomi sexuali (heterozomi sau gonozomi)
Celulele sexuale mature (gameții) sunt celule haploide fiecare deținând
23 de cromozomi (celulele haploide n=23 cromozomi)
Morfologia cromozomilor metafazici
Elemente structurale obligatorii:
1.Cromatide
2.Centromerul
3. Kinetocori
4.Telomere
Elemente structurale facultative (neobligatorii)
1.Constricții secundare
2.Sateliți
CROMATIDE
Fiecare cromozom prezintă două cromatide surori
Acestea sunt subunități longitudinale,identice genetic, conținând în
structură câte o moleculă de ADN
Lungimea lor pentru un cromozom metafazic este cuprinsă între 1,5 – 8
μm iar grosimea între 0,5 – 1 μm
Lungimea și forma relativă permit clasificarea cromozomilor
CENTROMERUL
(constricție primară)
Este locul de unire a celor două cromatide surori
Este compus din secvențe de ADN repetate în tandem de un număr
foarte mare de ori (ADN alfa satelit)
Datorită poziției constante, centromerul constituie unul din markerii
caracteristici pentru descrierea cromozomilor
Centromerul împarte cromozomul în două brațe:
brațul “p” - mai scurt, orientat în partea superioară față de un plan
imaginar ce trece prin centromer
brațul “q” - mai lung, situat în partea inferioară a planului de referință
În funcție de lungimea brațelor cromozomilor se poate calcula indicele
centromeric, definit prin raportul p/p+q. Este un criteriu de identificare a
perechilor de omologi.
După poziția centromerului s-au descris trei tipuri morfologice de
cromozomi în genomul uman:
Metacentrici, cu centromerul situat în regiunea mediană a
cromozomului și brațe egale (p=q)
Submetacentrici, cu centromerul situat submedian și brațe inegale (p<q)
Acrocentrici, cu centromerul situat în regiunea terminală a
cromozomului și brațe mult inegale (p<<q), aproape invizibile
KINETOCORII
Sunt formațiuni proteice complexe mici, rotund-ovalare,plasate la
nivelul centromerului (câte unul pentru fiecare cromatidă)
Au rol în atașarea cromatidelor la microtubulii fusului de diviziune și
menținerea legăturilor dintre cromatidele surori
TELOMERE
Reprezintă extremitățile terminale rotunjite ale cromatidelor
Conțin ADN înalt repetitiv, unități hexamerice (TTAGGG) repetate în
peste 2000 de copii, pe o lungime de aproximativ 15kb
Au rol în menținerea structurii cromozomilor, a individualității lor și
previn fuzionarea capetelor cromozomilor
Cu fiecare ciclu celular se pierd 50-150 pb din ADN-ul terminal de la
nivelul acestora, determinând implicarea lor în mecanismele care
intervin în durata de viață a fiecărei celule (apoptoză, moartea
programată a celulei)
Datorită telomerazei, activă numai în celulele germinale și în celulele
imortalizate, lungimea telomerelor este păstrată în cursul replicării ADN-
ului
Inactivarea telomerazei este fiziologică în celulele somatice și astfel
intervine scurtarea acestora până la senescența celulară
Reactivarea telomerazei este prezentă în peste 90% din cancere
CONSTRICȚII SECUNDARE
Sunt îngustări secundare ale cromatidelor observate numai la anumiți
cromozomi
La cromozomii acrocentrici, constricțiile secundare sunt localizate
terminal, în regiunea distală a brațelor scurte
La cromozomii acrocentrici, constricțiile secundare au rol de organizatori
nucleolari (conțin genele pentru ARNr din nucleol)
Constricțiile secundare proximale, mai aproape de centromer, se găsesc
pe brațele lungi la cromozomii 1,9,16
Sateliții
Sunt situați în porțiunea distală a brațului scurt la cromozomii
acrocentrici
Au formă rotundă sau ovală și conțin ADN înalt repetitiv
Mărimea lor poate varia
Mai mulți cromozomi acrocentrici (între 2 și 5) se pot atașa prin sateliți,
formând o asociație satelititară, posibil factor predispozant pentru
nondisjuncții cromozomiale în gametogeneză
Heteromorfismele
(polimorfismele) cromozomiale
Sunt variante morfologice normale, moștenite mendelian, markeri
citogenetici fără nici o semnificație patologică
Apar în cariotip la persoanele fenotipic normale și se datorează cantității
și statusului diferit de condensare al heterocromatinei sau modificărilor
în localizarea ADN-ului repetitiv
Acestea se pot observa prin colorații specifice pentru ADN obținându-se
o succesiune de zone intens colorate (benzi) și mai puțin colorate
(interbenzi)
Astfel de polimorfisme cromozomiale pot fi:
1.Elongarea regiunii subcentromerice a brațului q la cromozomii 1,9,16
2.Variații în lungime ale brațelor scurte la cromozomii acrocentrici
3.Variații de mărime și formă a sateliților, prezența sateliților dubli
4.Variații în lungimea brațelor q ale cromozomului Y
5.Variații ale benzilor heterocromatice și astfel, ale lungimii omologilor

MUTATIILE SI
REPARAREA LEZIUNILOR AND