Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria

tisulara
Universitatea de Medicină și Farmacie Gr. T. Popa
Facultatea de Bioinginerie Medicală

Master: Biotehnologii Medicale și Biomateriale Avansate

Sisteme specifice de culturi celulare

utilizate în ingineria tisulara

NUME STUDENT: NISFOEANU (DANAILA) ADRIANA IONELA

AN II, GRUPA 1
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

Cuprins

Cuprins ..........................................................................................................................2

Introducere ....................................................................................................................3

Celulele, elementul de baza al sistemelor utilizate în ingineria tisulară .......................4

Structuri destinate culturilor de celule pentru ingineria tisulară ..................................6

Sisteme în bioreactoare .............................................................................................7

Scaffold-urile ............................................................................................................7

Polimeri naturali și sintetici folosiți pentru scaffold-uri .........................................10

Tipuri de scaffold-uri ..............................................................................................11

Studii actuale privind sistemele de culturi celulare utilizate in ingineria tisulară ......12

Concluzii .....................................................................................................................16

Bibliografie .................................................................................................................17
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

Introducere

Ingineria tisulară reprezintă un domeniu multidisciplinar, care aparține medicinei

regenerative și care are ca scop promovarea calității vieții umane prin restabilirea, menținerea
sau ameliorarea funcției țesuturilor sau organelor. În acest scop, ingineria tisulară combină
tehnici biologice (realizarea de culture celulare și de țesuturi) cu tehnici inginerești (crearea de
matrici artificiale pentru regenerare tisulară, material artificiale pentru înlocuirea celor natural,
etc).
Medicina regenerativă a aparut la începutul anilor 1990, când a fost publicat primul
articol din domeniu. Terapiile prin inginerie tisulară reprezintă o trecere de la tehnologiile
medicale tradiționale la tratamentul personificat pentru fiecare pacient. Ingineria tisulară umană
se bazează pe mai multe componente importante. Componenta centrală o reprezintă celulele,
care pot fi autologe (de la același pacient), alogene (de la o alta persoana) sau xenogene (celule
animale). Celulele pot fi celule stem sau celule care au atins deja un anumit grad de diferențiere.
Aplicabilitatea ingineriei tisulare este atât una terapeutica (țesutul crește în corpul
pacientului sau în afara lui, de unde este ulterior transplantat), cît și diagnostic (țesutul este
crescut in vitro și utilizat pentru testarea metabolismului celular în prezența unor substanțe, în
vederea stabilirii toxicității și biocompatibilității lor).
Scopul ingineriei tisulare este restabilirea funcţiei prin distribuirea elementelor vii
care devin integrate în corpul pacientului.
Baza ingineriei tisulare este constituita din biomateriale. Acestea pot include
biomateriale noi, care pot influența fizic sau chimic, organizarea, creșterea și diferențierea
celulelor în procesul de formare a țesutului dorit şi biomolecule care includ factori de creștere,
factori de diferențiere și alte proteine cheie. Biomaterialele sunt prevăzute pentru organizarea
creșterii și diferențierii celulelor în scopul formării unui țesut functional. La biomateriale și
biomolecule se adaugă și celulele, elementul viu, funcțional, care fac până la urmă, obiectul
acestui domeniu. Sistemele utilizate în ingineria tisulară țin cont de toate aceste trei elemente
correlate cu scopul și destinația utilizării lor. [1]
Domeniul include și aspect de design ingineresc, care include expansiunea celulelor
pe structure bidimensionale, creșterea țesuturilor cu structure tridimensionale, bioreactoare,
stocarea celulelor și țesuturilor și distribuirea lor. Trebuie luat în considerare și aspectul
biomecanic al problemei, care include determinarea proprietățior țesuturilor ce trebuie înlocuite,
identificarea unor proprietăți minime pe care trebuie sa le dețină țesutul ingineresc, identificarea
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

semnalelor mecanice care influenţează ţesuturile ingineriei tisulare, eficacitatea şi siguranţa

acestor ţesuturi. Componenta informatică pentru susţinerea ingineriei tisulare realizează analiza
secvenţelor de gene şi proteine, expresia genică, expresia proteinelor, interacțiunile, analiza
cantitativă a celulelor şi ţesuturilor, modelarea tisulară şi celulară, manufactura digitală a
ţesuturilor, sisteme automatizate de asigurare a calităţii, interfeţelor.
Având în vedere cele trei componente enumerate mai sus se disting trei ramuri
importante ale acestui domeniu:
1. Regenerarea tisulară bazată pe cellule (terapie celulară, care presupune
transplantarea de cellule noi în scopul înlocuirii celulelor distruse dintr-un țesut)
2. Regenerarea tisulară bazată pe matrici artificiale (folosirea de matrici artificale
biodegradabile pentru a orienta creșterea celulară)
3. Regenerarea tisulară bazată pe molecule bioactive (factori de creștere, cytokine,
etc)
Scopul acestui proiect îl reprezintă prezentarea componentelor sistemelor utilizate în
ingineria tisulară, în contextul ultimelor cercetări din domeniu.

Celulele, elementul de baza al sistemelor utilizate în ingineria

tisulară
Celulele vii sunt necesare pentru a fabrica noi înlocuitori de țesuturi, din acest motiv
e necesară studierea lor în două situații normale: dezvoltarea lor în morfogeneză și vindecarea
în mod natural a unei răni. În aceste situații celulele recrează structurile funcționale pe baza
informațiilor genetice și a semnalelor din mediul extracelular și intracelular.
Din punct de vedere istoric, cultură de țesut a apărut din ideea că fragmente mici de
tesut pot fi menținute in afara corpului într-un mediu adecvat, in care celulele ar supraviețui.
Harrison (1907) a fost primul care a arăta că celulele nu numai ar putea supraviețui, dar că
acestea ar putea îndeplini funcții. Câțiva ani mai târziu, cultură de tesut a deviat în cultura de
celule, și cultura de organe, unde păstrarea structurii histologice a fost văzuta ca indicativ de
păstrarea a funcției in vivo. Cultura de celule are avantajul că este posibila cuantificarea – are
capacitatea și permite dezvoltarea de condițiile de cultură optimizate, inițial pentru proliferarea
celulelor, dar în cele din urmă pentru expresia functinala a aceastora.
Ca o resursă, cultura de celule a contribuit istoric nu doar pentru studii fundamentale
ale genotipurilor și fenotipurilor cat și alte procese celulare, dar și la obținerea de produse
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

biofarmaceutice. Cu substraturi sau scaffold-uri elaborate corect și capacitatea de a regla

microclimatul, cultura de celule a devenit o resursă de materiale credibila pentru reconstructia
tesuturilor.
Funcţionalitatea unui țesut obținut prin inginerie tisulară poate fi structurală (oase,
cartilaj, piele), metabolică (ficat, pancreas) sau ambele. Celulele pot fi utilizate singure sau pot fi
folosite in vivo alaturi de biomateriale și/sau biomolecule. În momentul selectării componentelor
celulare ce vor fi utilizate pentru un bioprodus este importantă identificarea celulelor adecvate
(fibroblaste, condrocite, celule stem mezenchimale, etc.) precum și izolarea lor dintr-o sursă
primară.
La nivel tisular, celule sunt organizate într-o formă tridimensională şi sunt
înconjurate de o serie de componente (colagen, elastină, acid hialuronic, proteoglicani,
glicozaminoglicani, glicoproteine etc.) ale matricii extracelulare secretată de acestea. De
asemenea, matricea extracelulară reprezintă mediul propice pentru creşterea şi diferenţierea
celulelor cu funcţii diferite (expresie genică specifică fiecărui tip de ţesut). Fără stimularea
mediului extracelular nu este primit semnalul pentru proliferarea și diferențierea celulară. De
aceea, în ingineria tisulară este necesară simularea mediului extracelular prin folosirea de celule
specifice, matrice suport şi molecule semnal (de exemplu factori de creştere) care se regăsesc în
matricea extracelulară corespunzătoare ţesutului care se doreşte a fi reparat. În timp ce matricea
suport favorizează adeziunea, migrarea şi organizarea celulară, moleculele semnal influenţează
şi direcţionează fenotipul şi metabolismul celular.
Celulele diferenţiate (celule nervoase, hepatice etc.) sunt utilizate frecvent la
însămânţarea matricilor suport, însă celulele stem adulte au câştigat popularitate rapid datorită
proprietăţilor biologice remarcabile, precum potenţialul de a se diferenţia în diferite tipuri de
celule. Atunci când celulele stem sunt folosite în co-culturi, acestea pot să inducă repararea
tisulară. Prin urmare, terapia cu celule stem a devenit o metodă de tratament promiţătoare care
foloseşte atât celule stem autologe cât şi alogene pentru regenerarea ţesuturilor şi organelor
lezate sau deteriorate de traumatisme prin refacerea micromediului local şi organizarea
histostructurală.
Deşi celule stem adulte au o capacitate mai scăzută de a se diferenţia decât celulele
stem embrionare şi cele pluripotente induse (IPS), utilizarea lor nu este împiedicată de aspectele
etice asociate aplicării celulelor stem embrionare în medicină sau de costurile de producţie
ridicate necesare izolării celulelor stem pluripotente induse. Din momentul identificării celulelor
stem în stroma măduvei osoase (BMSCs) care a avut loc acum 42 de ani şi până în prezent,
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

BMSCs au devenit un standard în medicină regenerativă datorită potenţialului ridicat de a se

diferenţia şi a morbidităţii scăzute în timpul recoltării.
Din cauza numărului scăzut de celule stem care pot fi izolate din stroma măduvei
osoase, la care se adaugă şi procedeul invaziv dureros de recoltare prin aspirare, s-au investigat
şi alte surse de celule stem adulte, ajungându-se la concluzia că celule obţinute din ţesutul
adipos (ASC) ar avea potenţial de diferenţiere şi capacitate regenerativă similare cu cele ale
BMSCs. Prin folosirea tehnicilor de prelevare și izolare minim invazive se obțin amestecuri
omogene de celule mixte denumit fracţie stromala vasculară care conţine pe lângă celule stem
adipoase şi celule endoteliale, hematopoietice şi stromale. Celule stem adipoase induc
angiogeneza, secretă factori de creştere, reglează procesul inflamator şi se pot diferenţia în
diferite tipuri de celule, proprietăţi care le recomandă pentru utilizarea în regenerarea tisulară.
De asemenea, ele sunt stabile din punct de vedere genetic în culturi pe termen lung şi au efect
imunomodulator.

Structuri destinate culturilor de celule pentru ingineria

tisulară
Noţiunea de cultură celulară se referă la situaţia în care fragmentul de ţesut este
disociat în elementele celulare componente, care pot prolifera în condiţii fizico-biochimice
speciale prestabilite, prin aderarea la un substrat de plastic sau sticlă sau în suspensie în mediul
de cultură. Pe de altă parte, prin cultura tisulară a unor fragmente mici se urmărește explantul.
Menţinerea fragmentelor mici la o interfaţă lichid-solid prin ataşarea tisulară la un substrat de
plastic sau de sticlă permite creşterea celulelor pe substrat, precum şi migrarea şi proliferarea
celulară ulterioară.
Toate aceste structuri sunt adaptate tipului de celule utilizat (fibroblaste, condrocite,
celule stem mezenchimale), cât și tipului de țesut care trebuie înlocuit.
Masele de celule obținute prin culturile de celule și țesuturi trebuie menținute în
viață, atât in vitro, cât și in vivo. Proiectarea de sisteme pentru a realiza acest lucru, atat in “flow
bioreactoars” in vitro cat și în vivo prin strategii de întreținere a masei de celule, reprezinta o
provocare enormă. În prezent sunt studiate și dezvoltate diverse asemenea sisteme și
biomateriale. Aceste biomateriale pot fi permanente sau biodegradabil. Ele pot fi materiale
naturale, materiale sintetice sau materiale hibride. Sunt dezvoltate pentru a fi compatibile cu
sistemele vii sau cu celule vii, atât in vitro cât și in vivo. Caracteristicile de proiectare sunt
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

provocări majore care țin de mai mulți factori.. Sistemele pot fi închise, semipermeabilă, sau
deschise.

Sisteme în bioreactoare
Un pas important în ingineria tisulară il constituie caracterizarea mediilor celulare
native țesuturilor pe care e necesar să le obținem. Un mediu adecvat poate remodela celulele,
țesuturile imature, pentru a se putea integra într-un tot funcțional cu celulele vecine și restul
organismului. Aceste medii au fost reproduse experimental în bioreactoare. Se disting două
tipuri de bioreactoare:
1. bioreactoare pentru ingineria tisulara care presupun o înțelegere cantitativă a
mediilor native cat si a caracteristicilor structurale ale țesutului. Ele sunt concepute pentru a
reglementa cu precizie micromediul celular, pentru a facilita construirea in uniformitate și
viabilitatea celulară a ansamblului. Cerințele cheie a acestor reactoare includ eficiență în
scaffoldul 3D, îmbunătățirea transferului de masă, schimbul de gaze adecvat la mediul de
cultură,alimentarea regulata a mediului uzat, controlul temperaturii /controlul pH-ului și a
stimulilor fiziologici.
2. bioreactoare ce au ca scop optimizarea variabilelor de proces înainte de aplicațiile
de inginerie tisulara reale. Acestea sunt utilizate în principal în scopuri de screening și sunt
deosebit de avantajoase pentru economia de celule necesare, precum și pentru investigarea
intervalele fiziologice, parametrilor și efectele lor sinergice. Ele sunt proiectate pentru a fi
modulare, miniscaled, și multiparametrice. Organizarea spațială 3D de celule din aceste
reactoare nu este critică, iar ele de obicei nu sunt celule sau țesuturi specifice.
De exemplu, sistemele pot fi utilizate pentru a investiga efectele nivelului de oxigen
sau tensiuni de forfecare pe supraviețuirea, proliferarea, sau interacțiunile de celule.
Avantajele utilizării bioreactoarelor:
- metodă universală,
- echipament automatizat,
- reducerea timpului de creștere (de la 45 la 15 zile)
- productivitate crescută (+500%).

Scaffold-urile
Scaffold-urile tridimensionale (3D) servesc drept substrat temporar pentru
sprijinirea și îndrumarea formarii de țesut de la diferite stări in vitro si in regenerarea țesutului in
vivo. Ele reprezintă de fapt structuri din materiale naturale sau artificiale pe care este crescut
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

țesutul în scopul de a mima procesele biologice – când se folosesc in vitro - sau pentru a înlocui
un țesut lezat sau distrus - in vivo. Deoarece celulele vii și țesuturile sunt sisteme extrem de
complexe, o temă centrală în proiectarea construcții este de a înțelege modul în care structurile
de scaffold-uri, proprietățile și funcțiile sunt corelate. Un concept cheie in ingineria tisulară este
utilizarea material pe bază de scaffold-uri 3D poroase pentru a oferi sprijin fizice și un mediu ce
permite facilitare dezvoltării țesutului. De la mijlocul anilor 1980, sistemele 3D au evoluat
pentru a servi funcției complexe de ghidare a comportamentului celular în diferite aplicații ale
ingineriei tisulare. Scaffold-ul poate fi însămânțat cu celule stem embrionare sau celulele stem
adulte, celule progenitoare, mature, diferențiate sau co-culturi de celule pentru a induce formarea
de țesut în vitro și in vivo. Pot fi, de asemenea, implantate direct in vivo cu capacități de a livra
biomolecule solubile / insolubile și repere temporale / spațiale pentru a ghida funcția de
regenerare în țesuturi și organe defecte. În timp ce funcțiile specifice variază în funcție de tipul
de țesut și necesității clinice, scaffold-urile pot coordona evenimente biologice la nivelurile
tisular, molecular, celular, variind de la nanometri la centimetri.
Din punctul de vedere al proprietăților materialelor, transport în comun, mecanica,
conductivitate electrică, suprafața chimica, și topologie mediază comportamentul celulelor de la
scări nano, micro la macroscopice. Aceste proprietăți sunt adesea corelate cu compozițiile
chimice ale scaffold-urilor.
Comparativ cu sistemele de culturi bi-dimensionale (2D)culturi monostrat,
construcții 3D impun cerințe mai stricte pentru eficienta transportului în masă a celulelor pentru
a obține uniformitatea țesutului și pentru a evita moartea celulelor pe scara larga in interiorul
schelei. Nutrienții, oxigenul, și molecule de reglementare trebuie să fie eficient transportate de la
mediul de cultură la suprafețele de țesut (masa externa de transfer) și apoi prin țesut a celulelor
(masa internă de transfer). În mod similar, metaboliții și CO2 sunt eliminate din celulele prin
matricea de țesut la suprafețele și apoi la mediu. Ratele de transfer de masă externe depind în
primul rând de condițiile hidrodinamice din bioreactor, în schimb, ratele interne pot depinde de
difuzie și convecție și în mod semnificativ de structura scaffold-ului.
Pe scurt, caracteristicile pe care trebuie să le aibă un scaffold polimeric ideal sunt: (1)
o arhitectura tridimensională cu un volum dorit, forma și rezistență mecanică (D.M.
Hutmacher et al., 2000), (2) o structură poroasa, cu porii bine interconectați pentru a permite o
însămânţare mai bună a celulelor, (3) o compoziție chimică astfel încât suprafața și produșii de
degradare sa fie biocompatibili pentru a provoca minimum de raspunsuri imune sau inflamatorii
(4) rata de degradare să ofere sprijin suficient până la creșterea completă a țesutului.
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

Pana în prezent au fost dezvoltate multe tehnici de prelucrare şi fabricare de

scaffolduri polimerice naturale și sintetice. Deși materialele naturale sunt mult mai potrivite în
furnizarea de diferite funcții biologice, scaffoldurile polimerice sintetice sunt favorizate,
deoarece pot fi fabricate dintr-o gamă largă de polimeri biodegradabili cu prelucrabilitate ușoară,
degradare controlată și susceptibilitate pentru modificări conform cerinţelor cercetării (Peter et
al., 1998). Pentru a acționa ca un suport fizic, scaffoldurile pot fi proiectate pentru a furniza
anumite funcții biologice şi pentru a induce activ regenerarea ţesuturilor. Ele trebuie să realizeze
una sau toate funcțiile următoare: (1)Să contribuie la interacţiunea celule-biomaterial, adeziunea
celulară și depunerea ECM, (2)Să permită transportul suficient de gaze, nutrienţi şi factori ce
permit supravieţuirea celulară, proliferarea şi diferenţierea, (3)Să fie biodegradabile cu o viteză
controlabilă care aproximează rata de regenerare a ţesuturilor, (4)Să determine un grad minim de
inflamaţie sau toxicitate în vivo
Biomaterialele destinate pentru aplicaţiile biomedicale au sarcina de a dezvolta
materiale artificiale care pot fi utilizate pentru repararea sau restaurarea funcţiilor ţesutului ssu
organului traumatizat din corpul uman. După o fază timpurie de selecţie a biomaterialelor în
funcţie de disponibilitate, încercările de proiectare s-au bazat în primul rând pe obţinerea
performanţei structurale/mecanice sau de redare a inerţiei, fiind astfel nerecunoscut ca un corp
străin de către sistemul imunitar.
In 1994, Freed s.a. a formulat 6 criterii de proiectare pentru polimeri biodegradabili
care ar trebui indeplinite in ingineria tisulara: (1) suprafata ar trebui sa permita adeziunea si
cresterea celulara; (2) dupa implantarea „in vivo” a polimerului si a produselor sale de degradare
nu ar trebui sa produca inflamatie si toxicitate; (3) polimerul ar trebui sa fie reproductibil in 3
structuri dimensionale; (4) porozitate mare pentru reducerea dificultatilor la difuziune si
cresterea suprafetei si un spatiu adecvat pentru regenerarea matricei extracelulare; (5) resorbtia
grefei dupa indeplinirea scopului sau (materialele straine prezinta intotdeauna risc de
inflamatie); (6) gradul de degradare a grefei trebuie sa corespunda gradului de regenerare a
tesutului de interes.
Biopolimerii, cum ar fi colagenul, elastină, fibroină, draglină, fibronectina, fibrină,
amidonul, celuloză bacteriană, dextranii, mananii, alginaţii, pectinele, chitină, chitosanul,
glicozaminoglicanii etc., şi-au găsit o multitudine de aplicaţii biomimetice în domeniul medical
(inginerie tisulară, implantologie, medicină regenerativă, fire de sutură, bureţi, filme,
biomateriale poroase, substituenţi plasmatici, purtători de medicament cu eliberare controlată şi
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

preparate de uz farmaceutic) datorită asemănării lor cu matricile extracelulare și ceilalți

biopolimeri din organismul uman.

Polimeri naturali și sintetici folosiți pentru scaffold-uri

Scafold-urile pot avea forme şi compoziţii diferite (spumă, fibre, reţele, geluri), pot
fi obţinute dintr-o gamă largă de materiale, sunt biodegradabile şi reprezintă o aplicaţie majoră a
polimerilor în ingineria tisulară. La fabricarea lor se folosesc cu precadere urmatoarele
materiale:
- Polimeri sintetici biodegradabili: poli acid L-lactic (PLLA), poli acidD,L- lactic
(PDLLA), poli acid glicolic (PGA), poli acid lactic-co-glicolic(PLGA), poli
hidroxi butirati, poliε-caprolactona, polidioxanona, polianhidride, polifosfazene,
polipeptide, etc
- Polimeri naturali biodegradabili: celuloză, chitină, chitosan, dextran, colagen,
gelatină, fibrină, fibrinogen, cazeină, etc.
Polimerii naturali sunt primele biomateriale utilizate clinic. Ca urmare a
proprietăţilor bioactive, materialele naturale au interacţiuni mai bune cu celulele, lucru care
îmbunătăţeşte performanţa celulelor în mediul biologic. Polimerii naturali pot fi calasificati în:
proteine (colagen, gelatină, fibrogen, elastină, keratina, actina şi miozină), polizaharide
(celuloză, amiloză, dextran, chitină şi glicozaminoglicani) său polinucleotide(ADN, ARN).
Orientarea biomaterialelor sintetice poate facilita restaurarea structurii şi funcţiei
ţesutului deteriorat sau bolnav. Polimerii sintetici sunt foarte utili în domeniul biomedical,
deoarece proprietăţile lor (de exemplu porozitatea, timpul de degradare şi
caracteristicilemecanice) pot fi adaptate pentru specificitatea aplicaţiilor. Mulţi polimeri sintetici
prezintă proprietăţi fizico-chimice şi mecanice comparabile cu cele ale ţesuturilor biologice.
Polimerii sintetici reprezintă cel mai mare grup de polimeri biodegradabili, iar aceştia pot fi
fabricaţi în condiţii controlate. Aceştia prezintă în general, proprietăţi mecanice şi fizice
previzibile şi reproductibile, cum ar fi rezistenţa la tracţiune, modulul de elasticitate şi viteza de
degradare. Copolimerii PLA (acid polilactic), PGA(acid poliglicolic), PLGA sunt printre
polimerii sintetici cel mai frecvent utilizaţi în ingineria tisulară. PHA (Polihidroxialcanatii)
aparţin unei clase de poliesteri microbieni şi sunt luaţi în considerare din ce în ce mai mult
pentru aplicaţiile ingineriei tisulare. Ceramicile bioactive, cum ar fi HA (hidroxiapatita), TCP
(fosfatul tricalcic) şi anumite compoziţii sticle fosfatice, silicatice (sticle bioactive) şi sticle
ceramice (cum ar fi apatita- Wolastonit (CaSiO3)) reacţionează cu fluidele fiziologice şi prin
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

ermediul activităţii celulare formează legături benefice în cazul ţesuturilor dure, uneori chiar şi
în cazul ţesuturilor moi. Cu toate acestea, biocompatibilitatea şi biodegradabilitatea sunt de
multe ori insuficiente, limitând utilizarea lor potenţială în domeniul clinic. Aceste neajunsuri pot
fi depăşite prin amestecul de
polimeri naturali şi sintetici, sau prin folosirea unor materiale compozite, ce îmbunătăţesc
proprietăţile schelelor, permiţând o degradare controlată şi îmbunătăţirea biocompatibilitatii în
aplicaţiile ingineriei tisulare.

Tipuri de scaffold-uri
TIPURI DE CARACTERISTICI UTILIZĂRI
SCAFFOLDURI
Scaffold-uri poroase -porozități mari - creşterea ţesutului gazdă,
-rețele de pori interconectate -regenerarea oaselor
PLA (acid polilactic), -permit interacțiunea celule- - vascularizarea organelor
PGA(acid poliglicolic), PLGA mediu
(acid polilactic -elimină grupurile de celule
-co-glicolic), PCL foarte mari
(policaprolactona), PBT -permit transportul nutrienților
(tereftalat de polibutilenă) spre centru
-structurile poroase pot fi
orientate
-pot fi fabricate cu o
dimensiune specifică a porilor,
porozitate, raportul suprafata-
volum şi cristalinitate
Scaffold-uri de hidrogeluri -biocompatibilitatea, -vindecarea cartilajelor,
-biodegradabilitatea controlată -regenerarea oaselor
colagen, gelatină, fibrină, -interacţiunea celulară -hidrogeluri cu factori de
alginat şi chitosan PLA (acid intrinsecă creștere
polilactic), copolimerii - similaritate structurală a -la înlocuirea țesuturilor
derivaţi PPF (sulfură de componenţelor conjunctive
polifenilen), derivaţi ai PEG macromoleculare de bază din
(polietilenglicol) şi PVA organism
(alcool polivinilic)
Scaffold-uri fibroase -Pe bază de nanofibre - ingineria tisulară musculo-
- Raportul crescut suprafata- Scheletala
colagen, gelatină, chitosan, volum al nanofibrelor cu - ţesuturi neuronale
fibră de mătase, PLA structură poroasă favorizeaza
(polilactidă), PU (poliuretan), adeziunea celulară,
PCL(policaprolactona), PLGA proliferarea, migrarea şi
(Poli (L-lactidă-co-glicolidă)), diferenţierea
PLLA-CL (Poli (L-lactidă-co-
glicolidă))
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

Studii actuale privind sistemele de culturi celulare utilizate in

ingineria tisulară
În ultimul an au fost dezvoltate mai multe materiale și tehnici de obținere a
materialelor ce intră în alcătuirea sistemelor de culturi celulare destinate ingineriei tisulare. În
continuare voi prezenta câteva dintre aceste studii care arată tendința generală în domeniu.
Chen Q. și colaboratorii au dezvoltat un dispozitiv care recrează mini-ficat 3D, în
scopul testării medicamentelor pentru toxicitate hepatică. [3]. Sistemul produce milioane de
picături care conțin microțesuturi realizate din două tipuri diferite de celule hepatice organizate
pentru a mima țesutul hepatic real. Aceste sisteme pornesc de la platforme de dimensiunea
buricului degetului proiectate să susțină tipuri multiple de celule hepatice într-un mediu 3D.
Canalele minuscule din platformă transportă nutrienți la celule. Deoarece acestea prezentau
neajunsuri, cercetătorii conduși de David Weitz, Ph.D., Professor of Physics and Applied
Physics at Harvard University, au creat un chip microfluidiccare poate genera rapid și precis
microțesuturi funcționale hepatice umane în interiorul unor picături. Sistemul poate genera până
la o mie de picaturi/sec care pot fi utilizate pentru analiza toxicității unui număr mare de
medicamente în diferite doze și combinații. Chipul microfluidic al lui Weitz e o platformă cu un
sistem de canale concentrice interconectate foarte apropiate, de diametrul unui fir de păr. Într-o
primă fază este aplicată o soluție salină pe bază de hepatocite care curge prin canale până când
se intersectează cu o soluție tip gel de fibroblaste. Datorită proprietăților fizice ale celor două
msoluții și fizicii fluidelor care circulă prin spații înguste fibroblastele aderă la marginile
canalelor, pe când hepatocitele curg prin centru. Amestecul se intersectează cu o soluție de ulei
care se comportă ca o ruptură și cauzează desprinderea picăturii. Picătura cade intr-o soluție
mediu acidă care determină așezarea stratului exterior gelatinos, reținând celulele în poziția
respectivă. Rezultă o picătură cu miez apos umplut cu hepatocite și un înveliș gelatinos de
fibroblaste.
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

Fig. 1. Microțesuturile hepatice realizate de Chen

Cercetătorii de la National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering
(NIBIB), SUA au realizat un nou tip de fragment de țesut având la bază mătasea. Chipsurile de
țesut sunt colecții de celule care mimează anatomia și fiziologia unui țesut făcând mai eficientă
testarea medicamentelor în laborator. Pentru a realiza acesta in vitro celulele au nevoie de
structura 3D, în acest caz reprezentată de scaffold-uri pe bază polydimethylsiloxane (PDMS), un
polimer pe bază de silicon ce conține camere microfluidice reprezentând vase de sânge sau
tractul respirator. Pentru a combate neajunsurile acestui material nebiodegradabil, s-a recurs la
matase. Prin amestecarea matasei intr-un gel și turnarea în formă s-a obținut un bloc rectangular
de hidrogel cu o rețea tridimensională de canale. Datorită condițiilor de reticulare acesta poate
îngloba celule și enzime. Mătasea a mai fost folosită anterior pentru modele de țesut cerebral și
măduvă osoasă , ca metodă de a păstra anticorpii și vaccinurile stabile la temperatura camerei.
[4] Mătasea mai apare într-un studiu din 2015 care îl are printre autori pe Kaplan, privind
dezvoltarea și integrarea unui scaffold dublu pentru articulațiile deteriorate. O parte pe bază de
mătase ca suport pentru cartilaj, alta ca scaffold pentru os, făcută din ceramică. [5] Fiecare fază
promovează popularea cu celule stem mezenchimale umane și diferențierea lor în tipul potrivit
de celule. Porii mici din segmentul din mătase duc la diferențierea în celule de cartilaj, pe când
porii mari din materialul ceramic se diferențiază în celule osoase. Interfața dintre cele două părți
permite migrarea celulelor și interacțiunea dintre faze.
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

Fig. 2. Scaffoldul bifazic pentru repararea articulației [6]

Paul Lu, Ph.D., și Mark Tuszynski, MD, PhD, alături de echipa lor de la University
of California - San Diego Center for Neural Repair, au realizat un experiment bazat pe studiile
anterioare utilizând celule stem umane pentru a reconstrui o porțiune afectată din măduva
spinării la un șobolan. Celulele stem au fost obținute din fibroblaste primare transduse cu vectori
retrovirali, apoi cultivate în prezența unor inhibitori pentru a induce celulele stem neurale și
FACTS purificate folosind CD184+, CD15+, CD44-, și CD271-. Acestea au fost cultivate pe
niște plăci de poly-ornitină acoperite cu laminină, cu DMEM/F12 suplimentat cu N2, B27 și
factori de creștere pentru fibroblaste primare. Celulele stem neurale au fost introduse într-o
matrice de fibrină îmbibată cu un amestec de factori de creștere, care a fost grefată într-o zonă
deteriorată a măduvei spinării. După trei luni s-a observat că din celulele stem s-au dezvoltat
neuroni cu axoni care se întindeau în ambele direcții pe lungimea măduvei spinării. Deci s-a
obținut o cultură in vivo, pe un biomaterial îmbibat cu factori de creștere. [7]

Fig 3. Sistemul de regenerare a maduvei spinării [8]

Cercetătorii au experimentat diverse scaffold-uri cu aplicații neurologice, realizate
din diverși polimeri și fibre, de densitate diferită. Ei au creat o rețea de fibre polimerice dese pe
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

bază de tyrosine-derived polycarbonate pDTEc, pe care să adere bine celulele stem. Au fost
populate cu celule stem umane pluripotente izolate din fibroblaste, apoi prin introducerea
proteinei NeuroD1 în celule au fost programate să se diferențieze în celule nervoase. Aceste
mini-scaffolduri trebuiau să aibă porii suficient de mari pentru a fi populate cu celule și suficient
de mici pentru a produce diferențierea. După ce au fost injectate într-o zonă lezată a creierului,
aceste mini scaffold-uri au manifestat activitate electrică specifică neuronilor funcționali. [9]
National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB), a publicat în
iunie 2016 issue of Science Translational Medicine un articol în care descrie realizarea unui
scaffold din os de vacă decelularizat, matrice pe care s-au cultivat celule stem din grasimea unui
porc (beneficiarul), crescute apoi într-un bioreactor pentru trei săptămâni. Acest sistem (grefa) a
fost implantată la porc, în locul unei bucăți de maxilar excizată. Timp de 6 săptămâni cât a durat
monitorizarea s-a observat o integrare anatomo-fiziologică a sistemului populat cu celule în osul
maxilar al porcului. Ulterior s-a observat că organismul porcului s-a comportat ca și cum grefa
reprezenta propriul os, realizând reînnoirea celulară naturală. Succesul a fost atribuit unor factori
cheie: un scaffold bine realizat, celulele potrivite, condiții optime pentru cultura de celule și
sincronizarea exactă. [10]
Sistemele de cultură 3D culture oferă noi oportunități pentru menținerea fertilității.
Astfel, Lonnie Shea, Professor of Chemical and Biological Engineering at Northwestern
University, și Teresa Woodruff, Thomas J. Watkins Professor of Obstetrics and Gynecology and
Professor of Biochemistry, Molecular Biology and Cell Biology at Northwestern University, au
colaborat pentru dezvoltarea unui sistem de cultură 3D pentru maturarea foliculilor ovarieni
proaspeți și criogenați. Sistemele 3D se bazează pe o matrice de hidrogel alginat proiectată
pentru a imita mediul din ovarul nativ. Hidrogelul menține arhitectura foliculară ți interacțiunea
dintre celulele foliculare. Prin adăugarea de factori de creștere și hormoni acețti foliculi au fost
maturizaâi in vitro. [11]
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

Concluzii
 Ingineria tisulară este un domeniu multidisciplinar care vizează
producerea de noi sisteme care să restabilească funcţionalitatea organelor şi ţesuturilor cu
deficienţe sau deteriorate de boli sau traumatisme combinând principii şi teorii inginereşti cu
cele ale ştiinţelor biomedicale.
 Cea mai importantă utilizare a ingineriei tisulare este în medicina
regenerativă.
 Sistemele utilizate în ingineria tisulară au la bază cultura de celule,
structuri sintetice sau matrici decelularizate cu rol în susținerea, creșterea, modelarea creșterii și
diferențierii atât in vitro cât și in vivo și biomolecule semnal.
 Aceste sisteme sunt utilizate in medicina regenerativă ca substituent
pentru tesutul cutanat, osos, miocard, țesutul nervos sau hepatic.
 În elaborarea sistemelor se ține cont de cerințele organului/țesutului de
destinație, caracteristicile și nevoile celulelor, timpul de populare, materialele utilizate.
 În toate cazurile, materialele utilizate sunt polimeri naturali, sintetici sau
micști, biocompatibili și biodegradabili, iar structurile obâinute imită anatomic sau funcțional
structura de destinație.
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

Bibliografie
1. biofizica-umfcd.ro/people/ap/curs_IMC/8_Inginerie_tisulara.pdf Sisteme
specifice de culturi celulare utilizate in ingineria tisulara (04.01.2017)
2. Verma P, Verma V, Concepts of Tissue Engineering, în Animal Biotechnology:
Models in Discovery and Translation, editată de Ashish Verma şi Anchal Singh, 2014, pp.233-
245
3. Chen Q, Utech S, Chen D, Prodanovic R, Lin JM4, Weitz DA.) Controlled
assembly of heterotypic cells in a core-shell scaffold: organ in a droplet. (Lab Chip. 2016 Apr
21;16(8):1346-9.
4. Zhao S, Chen Y, Partlow BP, Golding AS, Tseng P, Coburn J, Applegate MB,
Moreau JE, Omenetto FG, Kaplan DL, Bio-functionalized silk hydrogel microfluidic systems..
Biomaterials. 2016 Joule)
5. Li JJ, Kim K, Roohani-Esfahani SI, Guo J, Kaplan DL, Zreiqat H. J Mater Chem
B, A biphasic scaffold based on silk and bioactive ceramic with stratified properties for
osteochondral tissue regeneration Mater Biol Med. 2015 Jul 14;3(26):5361-5376.
6. https://www.nibib.nih.gov/news-events/newsroom/silk-and-ceramics-offer-hope-
long-term-repair-joint-injuries
7. Lu P, Wang Y, Graham L, McHale K, Gao M, Wu D, Brock J, Blesch A,
Rosenzweig ES, Havton LA, Zheng B, Conner JM, Marsala M, Tuszynski MH. Long-distance
growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 2012 Sep
14;150(6):1264-73
8. Lu P, Woodruff G, Wang Y, Graham L, Hunt M, Wu D, Boehle E, Ahmad R,
Poplawski G, Brock J, Goldstein LS, Tuszynski MH, Long-distance axonal growth from human
induced pluripotent stem cells after spinal cord injury. Neuron. 2014 Aug 20;83(4):789-96)
9. Aaron L. Carlson, Neal K. Bennett, Nicola L. Francis, Apoorva Halikere,
Stephen Clarke, Jennifer C. Moore, Ronald P. Hart, Kenneth Paradiso, Marius Wernig, Joachim
Kohn, Zhiping P. Pang, Generation and Transplantation of Reprogrammed Human Neurons in
the Brain Using 3D Microtopographic Scaffolds. Prabhas V. Moghe. Nat Comms. 2016 March
17
10. Bhumiratana S, Bernhard JC, Alfi DM, Yeager K, Eton RE, Bova J, Shah F,
Gimble JM, Lopez MJ, Eisig SB, Vunjak-Novakovic G., Tissue-engineered autologous grafts
for facial bone reconstruction. Sci Transl Med. 2016 Jun 15.
 Sisteme specifice de culturi celulare utilizate în ingineria
tisulara

11. Xu M1, Banc A, Woodruff TK, Shea LD., Secondary follicle growth and oocyte
maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual
follicles., Biotechnol Bioeng. 2009 Jun 1;103(2):378-86. doi: 10.1002/bit.22250.
12. West-Farrell ER, Xu M, Gomberg MA, Chow YH, Woodruff TK, Shea LD. The
mouse follicle microenvironment regulates antrum formation and steroid production: alterations
in gene expression profiles. Biol Reprod. 2009 March;80(3):432-9. Epub 2008 Nov 12.
13. Ali Yasin Sonay, et al. 2D Gold Nanoparticle Structures Engineered Through
DNA Tiles for Delivery and Therapy. Nano Biomed. Eng. 2012, 4(1), 17-22.
14. Xu M, Banc A, Woodruff TK, Shea LD. Secondary follicle growth and oocyte
maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual
follicles. Biotechnol Bioeng. 2009 June 1;103(2):378-86.
15. Lindroos B, Suuronen R, Miettinen S. The potential of adipose stem cells in
regenerative medicine. Stem Cell Rev. 7(2011):269-91
16. http://www.medicalstudent.ro/genetica/ingineria-tisulara-si-terapia-cu-celule-
stem.html(04.01.2017)
17. https://www.nibib.nih.gov/science-education/science-topics/tissue-engineering-
and-regenerative-medicine(04.01.2017)
18. www.uvvg.ro/site/docs/studii/doctorat/biologie_rezumate/..(04.01.2017)