Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mureş
LP9

Genul Neisseria
Produs patologic:

Neisseria gonorrhoeae
- secreţie uretrală, secreţie glande Bartholini, secreţie vaginală, secreţie prostatică
o la femei se recoltează în timpul sau la sfârşitul ciclului menstrual
- secreţie faringiană
- secreţie conjunctivală
- urină
Neisseria meningitidis
- secreţie faringiană
- sânge
- LCR

Rezistenţa: foarte sensibili la temperatura camerei, la uscăciune ⇒ recoltarea şi

însămânţarea se fac la patul bolnavului!!!

1. Examenul microscopic:
- coci Gram(-) sub formă de boabă de cafea, dispuşi diplo
- în infecţii acute ⇒ se găsesc intracelular
- în infecţii cronice ⇒ se găsesc intra şi extracelular

- coci gram (-), dispuşi diplo

- sunt capsulaţi

2. Izolarea: (sunt germeni foarte pretenţioşi)

- se însămânţează imediat după recoltare
- se încălzeşte mediul la 370C
- mediile de cultură utilizate: Geloză-chocolat, PEIZER-STEFFEN, THAIER-MARTIN
- Incubarea se face cu CO2 obligatoriu 10% 24-48 ore la 370C.

2. Identificarea:
CMT
CC- col “S” friabile, asemănătoare perlelor.

Încadrarea în genul Neisseria: Testul oxidazei ⇒ oxidazo(+)=Neisseria

Încadrarea în specie:
- Testul de umflare a capsulei ⇒ (+)⇒ N meningitidis ⇒ se stabileşte şi serogrupul
acesteia
-8-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP9

- Fermentarea zaharurilor:
Gonococ Meningococ Neisserii saprofite
GLUCOZĂ + + +
MALTOZĂ - + +
ZAHAROZĂ - - +

3. Antibiograma se face, deşi marea majoritate este sensibilă la Penicilină.

Diagnostic rapid: bazat pe reacţii Ag-Ac

– se pun în evidenţă Ag meningococice direct din LCR
- Reacţii de precipitare inelară
- Reacţii de aglutinare.

-9-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP10

Genul Haemophilus
Produs patologic
• secreţie nazo-faringiană - de la poarta de intrare
• puroi – în otite, sinuzite
• spută – în pneumonii
• LCR – în meningită
• sânge – în septicemie

Recoltare şi transport
• ! în meningită – recoltarea LCR
o la patul bolnavului
o transport rapid la 37oC, este interzisă refrigerarea

Examen direct
• macroscopic
o LCR cu aspect purulent
• microscopic
o direct din pp. sau după centrifugare pentru concentrarea germenilor
o frotiu colorat Gram sau cu albastru de metilen

celule inflamatorii

cocobacili G-, capsulaţi. În culturi vechi îşi pierd capsula

izolaţi,în grămezi sau lanţuri scurte, intra/extraleucocitar
Cultivare
• germen pretenţios
• necesită incubare în CO2 10%, atmosferă umedă, 37OC
• necesită factori de creştere
o mediu Chocolat
o ! S. aureus produce factor de creştere V

Identificare
• c.m.t.
• c.c.
o colonii S sau M
o asemănătoare cu picăturile de rouă
o coloniile sunt prezente în jurul coloniilor de S. aureus (satelitism)
• c. biochimice
o indol pozitive (majoritatea)
o fermentează inconstant zaharurile
o în prezent se folosesc teste API
-1-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP10

• pe baza creşterii în jurul discurilor cu factori X, V, X+V

Creştere în jurul factorilor
Specie
X V X+V
Haemophilus aegyptius - - +
Haemophilus aphrophilus v/- - +
Haemophilus ducreyi + - +
Haemophilus haemolyticus - - +
Haemophilus influenzae - - +
Haemophilus parahaemolyticus - + +
Haemophilus parainfluenzae - + +

• identificare antigenică
o identificarea Ag capsular K

reacţii de umflare a capsulei

RIF, ELISA, latexaglutinare
• identificarea AN
o se folosesc sonde nucleotidice produse comercial

Diagnostic serologic
• folosit pentru verificarea răspunsului imun după vaccinare
• ELISA, RIA

Antibiograma
• obligatorie
• se face pe medii speciale (Haemophilus test medium - HTM)

-2-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP12

Diagnosticul de laborator al sifilisului

Treponema pallidum

Produse patologice:
- serozitate din şancrul sifilitic (stadiul I.)
- sânge (ex. serologic)

1. Examen direct microscopic

- preparat nativ – examinare la microscop cu fond întunecat – forme spiralate mobile
(rotaţie, flexie)
- preparate colorate
o coloraţie Giemsa
o coloraţie negativă (Burri)
o impregnare argentică (Fontana-Tribondeau)
- Morfologie: forme spiralate, spire regulate, capete drepte, dimensiuni: 6-16 /0,25µm

2. Izolare prin metode biologice

- treponemele patogene nu pot fi cultivate pe medii arificiale
- inoculare intratesticulară la iepure – orhită sifilitică

3. Diagnostic indirect – serologic

1. Reacţii serologice clasice

- evidenţierea anticorpilor antilipoidici
- antigen folosit: cardiolipina

reacţia de floculare (VDRL)

latexaglutinare (RPR)

reacţia de fixare a complementului (RFC)
- pot apare reacţii fals pozitive
- pentru confirmare, diagnosticul se completează cu reacţii moderne (specifice)

2. Reacţii serologice moderne

- evidenţiază anticorpii antiproteici
- antigene folosite – antigene treponemice specifice de gen şi de specie
o Reacţii cu specificitate de gen:
• RFC
• CIEF
o Reacţii cu specificitate de specie:
• FTA – Abs (Fluorescent Treponemal Antibody Absorbtion Test)
• TPHA (reacţie de hemaglutinare pasivă)
• TIT (testul se imobilizare a treponemelor)
• ELISA

-1-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP12

Diagnosticul de laborator al leptospirozei

Leptospira interrogans
Leptospira biflexa

Produse patologice
- prima săptămână de boală:
o sânge (pentru evidenţierea leptospirei)
- din a doua săptămână:
o urină (recoltată după alcalinizare)
o LCR
o sânge – pentru serologie

1. Examen direct microscopic

- preparat nativ – examinare la microscop cu fond întunecat – forme spiralate mobile
- preparate colorate
o coloraţie Giemsa
o coloraţie negativă (Burri)
o impregnare argentică (Fontana-Tribondeau)
Morfologie:
- forme spiralate, spire regulate, dese şi mici, cu capetele încurbate
- dimensiuni: 6-40 /0,25µm

2. Izolare
- pe medii de cultură
o prin însămânţare pe mediul Korthoff (cu ser de iepure)
o incubare: 28-30°C, până la 60 zile
o control: din 5 în 5 zile, prin preparat nativ examinat la microscopul cu fond
întunecat

- pe animale de laborator
o cobai, hamster auriu, iepure

3. Diagnostic serologic
- Reacţia de aglutinare – liză (RAL)
o antigenul folosit: culturi vii de leptospira
o diluţii succesive de ser (Ac?)
o preparat nativ – examinare la microscop cu fond întunecat
- RFC, IF, Precipitare în gel – Mancini, CIEF, ELISA, RIA

-2-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP12

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de

Borrelia burgdorferi
Produs patologic
- sânge – pentru serologie
- LCR
- căpuşa infectantă

1. Examen microscopic direct

- detectarea microscopică a spirochetelolor în sângele uman nu a putut fi realizată
- diagnosticul direct a putut fi realizat totuşi prin evidenţierea microorganismelor în
secţiuni tisulare, prin impregnare argentică.
Morfologie:
- forme spiralate, spire neregulate, deformabile în cursul mişcării, cu capetele
drepte, dimensiuni: 20-30 /1µm

2. Izolare
- s-au obţinut colonii pe mediul Kelly modificat, la temperatura de 28-30°C, în
microaerofilie

3. Diagnostic serologic
- se evidenţiază anticorpii din sânge şi din LCR prin imunofluorescenţă şi reacţii
ELISA, deorece dau reacţii încrucişate cu Treponema pallidum, se efectuează în
paralel şi reacţia TPHA.

-3-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP12

Diagnosticul de laborator al tuberculozei

Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium bovis

Produsul patologic
- în tuberculoza pulmonară – spută, aspirat bronşic, lichid pleural, spălătură gastrică
- în tuberculoza renală – urina (toată cantitatea de urină emisă dimineaţa)
- în tuberculoza genitală – secreţie vaginală, cervicală, spermă, secreţie prostatică
- în tuberculoza articulară, osoasă – lichid sinovial, puroi
- în tuberculoza ganglionară – material din puncţie ganglionară, puroi
- în meningita tuberculoasă – LCR

1. Examen direct
- frotiu colorat Ziehl-Neelsen – bacili lungi şi subţiri, uşor încurbaţi, roşii (acido-
alcolorezistenţi), fondul preparatului fiind albastru

2. Izolare
- pe mediul Lowenstein-Jensen
- incubare la 37°C, până la 90 de zile

3. Identificare
- caractere morfotinctoriale (vezi examenul direct)
o factorul cord
- caractere de cultură
o tipul uman are o creştere eugonică, favorizată de prezenţa glicerinei

creşte în 2-3 săptămâni

colonii de tip R, neregulate, uscate, conopidiforme, ca firmiturile de
pâine

coloniile se detaşează uşor de pe mediu şi se emulsionează greu în ser
fiziologic

în mediu lichid formează la suprafaţă un văl gros ce se întinde mai
repede
o tipul bovin are o creştere disgonică

creşte mai lent, într-o lună

colonii de tip S, mici, netede

coloniile se detaşează greu de pe mediu şi se emulsionează uşor în ser
fiziologic

în mediu lichid formează la suprafaţă un văl subţire, friabil, cu
dezvoltare lentă

- inoculare la animale de experienţă – cobaiul

-4-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP12

4. Antibiograma
- se efectuează pe mediul Lowenstein în care au fost incluse tuberculostatice

5. Diagnostic indirect
- Intradermoreacţia Mantoux
o se inoculează intradermic tuberculină purificată (PPD, 2 unităţi)
o este o IDR alergică
o dacă persoana nu a venit în contact cu germenele (nu a fost bolnav, nu a fost vaccinat),
atunci la locul inoculării nu apare nici o reacţie
o dacă persoana a mai venit în contact cu germenele (a fost sau este bolnav, a fost
vaccinat), atunci la locul inoculării se declanşează o reacţie alergică tardivă (dată de
implicarea imunităţii celulare), urmată de apariţia unui eritem şi a unei induraţii locale
o reacţia se interpretează în funcţie de mărimea şi intensitatea induraţiei

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de germeni din

genul Mycoplasma

M. hominis
M. pneumoniae
M. genitalium, M. orale, M. salivarium

Produsul patologic
- periaj endobronsic, lavaj bronho-alveolar
- grataj al mucoaselor
- urină
- aspirat gastric (nou-născuţi)
- secreţie vaginală
- sânge (dg. serologic)

1. Examen direct
- în produs patologic se pot căuta antigenele bacteriene prin tehnici imunologice:
imunofluorescenţă directă, imunoprecipitare, reacţii imunoenzimatice

2. Cultivarea
- dificilă (timp 5-21 zile) - necesită medii bogate în colesterol, extract de levură,
precursori pentru sinteza de acizi nucleici
- creste lent, în atmosferă microaerofilă
- Mycoplasma hominis - creste pe medii speciale cu arginină, în 1-4 zile

3. Identificare
- Caractere morfotinctoriale
o sunt bacterii foarte mici, cu dimensiuni de 300 nm motiv pentru care nu pot fi
evidenţiate la microscopul optic.
o nu au perete bacterian, lipsa peretelui bacterian le conferă o foarte mare
plasticitate si polimorfism
-5-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP12

o apar ca forme filamentoase, bacilare, cocoide.

- Caractere de cultură
o coloniile apar în câteva zile, sunt foarte mici, vizibile cu lupa
o coloniile au aspect de „ou prăjit”.
- Caractere biochimice
o fermentarea glucozei
o hidroliza ureei si argininei
- Identificare antigenică
o se detectează anticorpii specifici prin

imunofluorescenţă,

ELISA

Imunoblot
o prezenţa IgM specifice sau cresterea titrului de anticorpi în seruri pereche
recoltate la 15 zile interval sunt martorii unei infecţii recente.

În infecţiile cauzate de micoplasmele genitale diagnosticul este exclusiv bacteriologic

si presupune izolarea pe medii.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de germeni din

genul Chlamydia

Chlamydia trachomatis
Chlamydophyla psittaci
Chlamydophyla pneumoniae

- bacterii mici, 0,2 µm, cocoide, paraziţi intracelulari obligatorii cu perete rigid,
multilaminat, asemănător ca structură cu cel al bacteriilor Gram negative.

Chlamydia trachomatis
Produsul patologic
- raclajul blând al mucoaselor pentru a recolta celule
- se examinează:
o produs endouretral, din endocolul uterin (recoltor special – burete/perie)
o raclat conjunctival
o de la nou născut se recoltează secreţia nasofaringiană
o de la cazurile de linfogranulomatoză veneriană se examinează aspiratul
ganglionar si puroiul din fistulă.

1. Examen direct
- se pot aplica tehnici de imunofluorescenţă directă care utilizează anticorpi
monoclonali anti-Chlamydia trachomatis, marcaţi, pentru evidenţierea corpusculilor
elementari.

-6-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP12

2. Cultivare
- izolarea se poate face pe culturi celulare (Mac Coy, HeLa.) sau ou de găină embrionat
- în celulele infectate se formează incluzii citoplasmatice, înconjurate de o matrice
bogată în glicogen - din acest motiv, incluziile chlamydiene pot fi evidenţiate prin
colorare cu iod (Lugol).
- coloraţia Giemsa, mai frecvent utilizată permite diferenţierea incluziilor tinere
alcătuite din corpi reticulaţi care se colorează în albastru si a incluziilor mature în care
predomină corpii elementari care se colorează în roşu.

3. Identificare
- cele mai sensibile metode de diagnostic sunt cele de biologie moleculară:
o hibridizare
o PCR.

4. Diagnosticul serologic
o evidenţierea anticorpilor formaţi faţă de antigenele cu specificitate de gen,
specie şi tip prin RFC, IF, ELISA, Western blot
o prezenţa anticorpilor de tip IgM sau seroconversia este semn de infecţie recentă
o în infecţiile genitale se caută anticorpi de tip IgA a căror prezenţă denotă o
infecţie activă

Chlamydophila psittaci
Produs patologic
- pentru diagnosticul psitacozei/ornitozei
o spută
o tampon nasofaringian
o ţesut pulmonar
o sânge – diagnostic serologic

1. Examen direct
- evidenţierea acizilor nucleici prin PCR

2. Diagnostic serologic
- se determină prezenţa anticorpilor prin IF

Chlamydophila pneumoniae
Produs patologic:
- spută, lavaj bronho-alveolar
- sânge - serologie
Detectarea acizilor nucleici prin PCR - diagnostic rapid şi specific.
Izolarea este dificilă, nu se practică în diagnosticul de rutină.
Diagnosticul se bazează pe serologie, evidenţierea anticorpilor prin IF indirectă sau ELISA.
Seroconversia apare la 3 săptămâni de la debutul bolii.

-7-