TRANSFERUL DE GENE IN

CELULELE ANIMALE
Avantajele clonării în celule animale

• Celulele mamaliene sunt cele mai utilizate gazde pentru transferul

de ADN de interes
• Permit producerea de proteine recombinate, inclusiv proteine
umane, care prezintă prelucrările post-translaționale normale
• In prezent există tehnologii bine puse la punct de cultivare a
celulelor mamaliene în sisteme optimizate în vederea sintetizării
unor compuși extrem de utili mai ales pentru terapie: anticorpi,
hormoni, factori de creștere, citokine sau vaccinuri.
• Există o serie de vectori de clonare/exprimare eficienți atât pentru
celule mamaliene cât și pentru alte tiprui de celule animale, de ex.
celule de insecte (sistemul de exprimare de la baculovirusuri)
• Cercetările de până acum au avut drept țintă nu numai transferul de
gene în celule aflate în cultură in vitro ci și în celule in vivo, sistem a
cărui aplicație principală se referă la terapia genică (introducerea de
ADN în celulele unui organism în vederea tratării unei boli).
 Metode de transfer în celule animale
• Pentru transferul de gene în celulele animale sunt utilizate în
principal celulele somatice din care, în condiții normale nu pot
fi regenerate organisme transgenice.
• Transformarea celulelor germinale la un organism animal
necesită transferul genelor în celule pluripotente sau
totipotente, așa cum este cazul celulei ou, a embrionilor
timpurii, a celulelor germinale izolate sau a gameților. In mod
excepțional, transformarea liniei germinale se poate realiza fie
prin transferul de gene în celule din culturi in vitro, derivate de
la celule pluripotente, așa cum este cazul celulelor stem
embrionare de la șoarece (celule de tip „ES”), fie prin
transferul nucleului unor celule somatice în ovule enucleate.
– Celulele stem au fost descoperite în 1950, în măduva osoasă
– În 1970 au fost descoperite celulele stem embrionare la șoarece
– În 1998 au fost evidențiate și izolate celulele stem embrionare la om
– După 2000 – teste privind convertirea in vitro o celulelor stem în diferite
categorii celulare de interes
Celulele stem
– Există în anumite țesuturi
alături de celulele specializate
– Nu sunt diferențiate și se pot
divide nelimitat formând alte
celule stem
– Se pot diferenția în funcție de
anumite condiții de mediu
Celule stem pot fi:
– Totipotente – se formează după primele
diviziuni ale celulei ou (stadiul de 8 celule) și pot
regenera un organism întreg
– Stem pluripotente = celule stem embrionare –
pot forma orice tip celular
– Stem multipotente – celule adulte capabile de a
produce mai multe tipuri de celule diferențiate
– Stem unipotente – pot forma un singur tip de
celule (ex.spermatogoniile formează doar
spermatozoizi)
Celule stem pluripotente
In prezent sunt disponibile numeroase linii celulare
mamaliene ce pot fi folosite în studii de genetică
moleculară, majoritatea putând fi obținute, de exemplu,
de la American Type Culture Collection (ATCC) ce
deține peste 4000 linii celulare de la mai mult de 150
specii diferite: MDCK (din rinichi de câine,1958) CHO
(hamster; epiteliu ovarian;1957); CV-1/COS (maimuță;
rinichi; 1964); HeLa (om; carcinom cervical;1951)
LNCaP (om; tumoră de prostată; 1977) MCF7 (om;
tumoră mamară;1973).
• Linia de celule HeLa este un tip de linie
celulară umană ”nemuritoare” utilizată în
scopul cercetării științifice.
• Provine din celule tumorale cervicale
prelevate la 8 febr. 1951 de la o pacientă pe
nume Henrietta Lacks (care a murit de
cancer în oct.1951)
• Reprezintă prima linie celulară umană
obținută și menținută cu succes in vitro care a
fost ulterior utilizată în numeroase studii de
interes medical
- Fiind celule tumorale, celulele HeLa se pot divide de un
număr nelimitat de ori, în condiții de laborator, atâta timp cât
sunt asigurate condițiile optime de mediu
- In prezent există numeroase linii de celule HeLa dar toate
sunt descendente din linia celulară inițiată în anul 1951
 Utilizare
• Celulele HeLa au fost utilizate de către Jonas Salk pentru
testarea primului vaccin antipoliomielită în anii 1950
• Celulele Hela au reprezentat subiectul a peste 60.000 lucrări
stiintifice până în anul 20009
• Celulele HeLa au fost folosite pentru studii legate de modul în
care virusuri animale (de ex. Parvovirusul de la câini sau
pisici) infectează celulele umane
• Celulele HeLa au fost utilizate pentru studii legate de
exprimarea unor gene de la papilomavirus E2 precum și de
inducerea apoptozei în celulele tumorale ca urmare a
infectării cu anumite virusuri , cercetări cu impact în
dezvoltarea unor tratamente antitumorale în cazul tumorilor
rezistente la radioteratie și chimioterapie
• Au fost utilizate în studii legate de impactul unor hormoni
steroizi (estradiol, estrogen) și a receptorilor pentru estrogeni
în fenomenul de proliferare tumorală
 Utilizare
• Celulele HeLa au fost folosite în studii legate de
efectul unor compuși chimici, naturali sau de
sinteză, asupra proliferării tumorale în vederea
realizării unor noi produse cu efect antitumoral
• Celulele HeLa au fost utilizate în scopul definirii
unor markeri tumorali și în stabilirea unor metode
de diagnosticare
• Celulele HeLa proliferează anormal de rapid, chiar
comparativ cu alte tipuri de celule tumorale. Ele
posedă un sistem telomerazic activ în timpul
diviziunii celulare, care previne scurtarea
telomerelor, celulele nefiind supuse îmbătrânirii
(senescenței) și nici apoptozei.
• La începutul anului 2013, structura genomului celulelor Hela a
fost comunicată de către un grup de cercetători germani
coordonați de Lars Steinmetz.
• Genomul celulelor Hela, la fel ca și cel al altor celule
tumorale, prezintă o serie de particularități legate, în primul
rând, de erori reparate anormal și de prezența uneia sau a
mai multor copii suplimentare a unor cromosomi.
• Echipa condusă de Steinmetz a confirmat că celulele HeLa
conțin o versiune suplimentară a majorității cromosomilor, cu
până la cinci copii în cazul unora dintre cromozomi. La
numeroase gene s-a observat fenomenul de duplicație,
rezultând 4-6 copii în loc de două cât este normal. De
asemenea, segmente de dimensiuni mari din cromosomul 11
precum și din alți cromosomi prezintă rearanjamente, ceea ce
alterează drastic exprimarea genelor.
• Datorită duplicațiilor, peste 2000 de gene din genomul acestor
celule sunt exprimate la niveluri cu mult mai ridicate decât în
cazul celulelor umane normale
 Metode de transfer a genelor
Transferul de gene în celulele animale se poate realiza pe
patru căi:
- transfer direct al ADN prin metoda transfecției fizice;
- transfecția mediată chimic prin care celulele preiau ADN
prin endocitoză;
- introducerea ADN de interes împachetat în interiorul unui
virus (transducție);
- introducerea ADN de interes aflat în interiorul unei bacterii
cu ajutorul vectorilor de tip navetă („shuttle”).
Două dintre metode implică mecanisme biologice (utilizarea
virusurilor sau a bacteriilor ca agenți de „livrare” a ADN de
interes) în timp ce celelalte două nu implică agenți biologici,
iar pentru a le deosebi de procesul de infecție (virală sau
bacteriană), termenul folosit pentru a le desemna este cel de
transfecție.
Reprezentarea schematică a modalităților de introducere a ADN de interes în
interiorul unei celule animale:
1. transfecția fizică
2. transfecția mediată chimic prin care celulele preiau ADN prin endocitoză
3. introducerea ADN de interes împachetat în interiorul unui virus
(transducție)
4. introducerea ADN de interes aflat în interiorul unei bacterii
Cel mai frecvent, pentru transferul direct al ADN în celulele
animale se utilizează:
- metoda microinjectării
- electrotransformarea
- metoda biolistică
- utilizarea lipozomilor drept cărăuşi ai materialului genetic de
transferat (lipozomii reprezintă structuri veziculare, formate
din molecule lipidice de tip fosfatidilcolină, sfingomieline,
fosfatidil-etanolamine, prin agitarea sau ultrasonicarea
soluţiilor respective)
- incubarea celulelor + ADN în dextran (polimer de natură
glucidică la care au fost cuplate anumite grupări chimice
active (DEAE).
- precipitarea ADN cu cationi bivalenţi (Ca2+, Mg2+) care
determină o pătrundere mai rapidă a acestuia în celule
Gene marker de selecție pentru celulele animale (gene
care codifică sinteza unui produs ce permite celulelor
transformate să supraviețuiască pe un mediu selectiv):
– gena pentru aminoglicozid-fosfotransferaza (aph) (agentul de
selecţie este antibioticul G418 care inhibă sinteza
proteinelor);
– gena pentru dihidrofolat-reductaza (dhr), care conferă
rezistenţa la metotrexat;
– gena pentru higromicin-fosfotransferaza (hpt), care determină
rezistenţa la higromicina B;
– gena pentru timidin-kinaza (implicată în sinteza timidin-
trifosfaților = TTP), care determină rezistenţa la aminopterin
(un agent inhibitor al sintezei purinei) etc.
Incorporarea stabilă a genelor exogene în genomul celulelor
supuse transfecţiei este un fenomen extrem de rar (0,1%-
1%), exprimarea acestora se poate menţine câteva zile
după transfer, după care dispare. Acest fenomen a primit
denumirea de "exprimare temporară (tranzitorie)", el putând
fi utilizat pentru a evidenţia eficienţa transferului (nu şi a
integrării genei respective).
GENE MARKER DE REFERINȚĂ („reporter genes”) (gene
care codifică un anumit produs ce poate fi detectat ușor,
calitativ și cantitativ, folosind metode colorimetrice,
fluorometrice sau teste chemiluminiscente etc):

Gena lacZ de la E.coli codifică sinteza enzimei β-

galactozidaza care hidrolizează β-D-galatopiranozidele de
tipul lactozei sau a unor analogi. Activitatea enzimei β-
galactozidaza poate fi determinată in vitro spectrofotometric
utilizând un substrat cromogen (ONPG = O-nitrofenil-β-D-
galactopiranozid care formează, sub acțiunea enzimei un
compus de culoare galbenă) sau histochimic prin utilizarea
substratului cromogen X-gal care determină, sub acțiunea
enzimei, apariția unui compus de culoare albastră).
Dezvantajul acestei gene raportor este că activitatea genei
exogene poate fi mascată de activitatea unei gene endogene
pe care o conțin numeroase tipuri de celule mamaliene.
Gena lux ce codifică enzima luciferaza
identificată inițial la licurici (Photinus pyralis) care
catalizează oxidarea luciferinei într-o reacție ce
necesită oxigen, ATP și ioni de magneziu: în
prezența substratului în exces are loc emiterea de
lumină iar intensitatea semnalului poate fi
determinată cu ajutorul unui luminometru.
Sistemul luciferazic este mult mai sensibil decât
cel reprezentat de gena lacZ, putând fi aplicat la
numeroase gazde animale.
Gena gfp codifică sinteza proteinei GFP („green
fluorescence protein” = proteina cu fluorescență verde)
identificată mai întâi la meduza Aequoria victoria, iar
începând cu anul 1994 a început să fie utilizată ca
marker de selecție pentru celulele animale (la
Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, linii
celulare mamaliene). Modificarea genei s-a realizat
astfel că proteinele derivate manifestă o fluorescență
diferită față de cea inițială: CFP = „cyan fluorescent
protein” (fluorescență albastră), YFP = „yellow
fluorescent protein” (fluorescență galbenă).
 Vectori de clonare pentru celulele
animale
Vectorii de clonare pentru celulele animale trebuie să conţină,
în principiu, patru tipuri de componente:
– secvenţe derivate din plasmide bacteriene care să le permită
multiplicarea şi selecţia în celule bacteriene gazdă (E.coli);
– elemente genetice eucariote care să controleze iniţierea transcrierii:
secvenţa promotor, de terminare şi, eventual, secvenţe activator
("enhancer");
– secvenţe de poliadenilare a ARNm (în cazul în care nu toţi vectorii
conţin introni care să asigure prelucrarea ARNm precursor);
– gene marker ce permit selecţia celulelor animale ce conţin vectorul
recombinat.
Primii vectori de clonare pentru celula
animală au derivat de la virusul SV40
(virusul simian 40 sau virusul vacuolizant,
care determină transformarea tumorală a
celulelor infectate).
Genomul virusului SV40: o moleculă de
ADNdc circular ce conţine mai multe gene:
- gena T (codifică sinteza antigenului T
şi asigură capacitatea transformantă a
virusului);
- gena t codifică pentru sinteza unui
antigen minor (t);
- gena VP1 (codifică sinteza proteinei
principale din structura învelişului viral);
- genele VP2 şi VP3 (codifică sinteza
proteinelor minore din structura învelişului
viral).
După infecţie, genomul viral se
integrează în genomul celulei gazdă,
determinând transformarea tumorală a
acesteia.
Multiplicarea SV40 în diferite gazde mamaliene (șoarece, maimuță, om)
Vectorii de clonare derivaţi de
la acest virus s-au obţinut
prin înlocuirea unor gene
virale (inclusiv a celor de
tumorigeneză) cu gene
străine (dimensiunea ADN
străin fiind de maximum 2300
pb), rezultând un virus
defectiv, incapabil de
multiplicare şi formarea unui
virus matur. Dacă infecţia cu
virus defectiv se face
simultan cu o altă unitate de
replicare, care conţine genele
ce-i lipsesc virusului (virus
ajutător = „helper”), are loc
formarea de particule virale
recombinante. În general,
vectorii derivaţi de la SV40
au originea replicării virale,
regiunea implicată în
"splicing" şi poliadenilare,
precum şi genele pentru
ARNm timpuriu.
2. Vectori specifici pentru celulele animale derivaţi de la retrovirusuri.
Acestea sunt virusuri cu genom ARN care infectează celulele
mamaliene în care, după infecţie şi după reverstranscrierea ARN
viral la o moleculă de ADN complementară genomului viral (ADNc),
se integrează în genomul celulei gazdă, devenind provirus.
Provirusul determină producerea de ARN viral, transcrierea
începând de la nivelul unui promotor puternic, localizat în afara
regiunii codificatoare din genomul viral, la nivelul unor secvenţe
terminale lungi repetate (LTR = “long terminal repeats”). ARN
sintetizat funcţionează atât ca ARNm, utilizat pentru sinteza
proteinelor virale, cât şi ca ARN viral genomic. Genomul viral mai
conţine, pe lângă cele două LTR situate la extremităţile genomului
viral, o secvenţă necesară încapsidării (Ψ), precum şi trei gene ce
codifică o serie de proteine virale: gag (codifică sinteza proteinelor
din miezul intern al virusului); pol (codifică sinteza mai multor
enzime virale, inclusiv a reverstranscriptazei); env (codifică sinteza
proteinelor din învelişul viral).
Reprezentarea schematică a unui
vector retroviral şi a modului său
de utilizare pentru clonare.

LTR = secvenţe marginale repetate;

bla = genă marker de selecție
pentru E.coli;
oriE = originea replicării în E.coli;
neo = marker de selecție pentru
celulele animale transfectate;
promotor CMV = promotor puternic ce
asigură exprimarea genei clonate
(a insertului);
psi = secvențe retrovirale esențiale
Vector de clonare ce conține atât elemente
genetice derivate de la SV40 cat și de la un
lentivirus.
 Vectori de exprimare pentru celulele
mamaliene
Producerea de proteine heterologe de către celulele
mamaliene constituie una dintre direcţiile majore de
studiere a rolului fiziologic al unor proteine sau a
modificărilor post-translaţionale ale acestora.
Vectorii de exprimare trebuie să conțină elemente genetice
implicate în controlul exprimării genelor de interes:
- promotorul
- secvența de poliadenilare (poly A)
- secvența enhancer
- intron (pentru stabilizarea genei clonate și prelucrarea corectă
a ARNm corespunzător)
- markeri de selecție
- MCS
Promotorul constituie secvența fără de care transcrierea
eficientă nu se poate realiza. In prezent, cei mai utilizați
promotori pentru studiile de exprimare a genelor în culturi
celulare sau în animale transgenice pot fi grupați în mai
multe categorii, în funcție de modul de funcționare:
- promotori minimali (promotorul alcool dehidrogenazei de la
Drosophila, promotorul genei pentru timidin kinaza de la virusul
heres simplex)
- promotori constitutivi puternici (promotorul timpuriu de la
citomegalovirus, secvența enhancer/promotor de la virusul SV40),
promotori specifici pentru anumite tipuri de celule (promotorul
proteinei acide din lapte, promotorul tirozin kinazei specifice
limfocitelor)
- promotori reglabili (inductibili)(Secvența LTR enhancer/ promotor
de la virusul tumoral mamar de la șoarece, promotorul genei pentru
proteina de șoc termic de la Drosophila).
De exemplu, în laboratoarele Promega au fost obţinute trei categorii de
vectori de exprimare constitutivă a genelor clonate în celulele mamaliene:
seria de vectori pSI, seria pCI şi seria pCI-neo. Diferenţa majoră dintre
vectorii de tip pSI şi cei pCI constă în tipul de regiune enhancer/promotor
ce controlează exprimarea genei inserate.
Vectorul pGFP-C1 produs de laboratoarele Clontech este un vector de exprimare
de tip navetă (se multiplică şi funcţionează atât în E.coli cât şi în celule animale
(mamaliene). Vectorul conţine:
- gena de rezistenţă la kanamicină sub controlul a doi promotori: promotorul genei pentru rezistenţa
la ampicilină îi asigură exprimarea în celulele bacteriene (care devin rezistente la kanamicină), iar
promotorul SV40 îi asigură exprimarea în celulele eucariote;
- asigură exprimarea genelor străine clonate la nivelul MCS localizat la extremitatea 3’ genei gfp,
asigurând sintezei unei proteine de fuziune
- secvența polyA
- exprimarea genei gfp este controlată de un promotor derivat de la virusul CMV
Vectori de clonare pentru alte categorii de
celule animale

Domeniile de aplicare a tehnologiei ADN

recombinant s-au extins şi în cazul altor tipuri de
organisme animale care au putea fi utilizate drept
gazde pentru producerea de compuşi de interes.
Acesta este cazul celulelor de insecte la care s-au
înregistrat progrese importante în ceea ce priveşte
cultivarea „in vitro” şi obţinerea de vectori de
clonare specifici. Astfel, este cunoscut faptul că
celulele de insecte sunt sensibile la acţiunea unei
categorii speciale de virusuri ce au primit
denumirea de baculovirusuri.
Baculovirusurile au un genom ADN, circular de dimensiuni mari
(90-180 kb), la nivelul căruia au fost identificate mai multe gene
ce codifică funcțiile virale, inclusiv sinteza unui compus specific
ce se acumulează în celulele de insecte infectate (proteina
polihedrină). Exprimarea acestei gene este controlată de un
promotor puternic, care a fost utilizat pentru clonarea de gene de
interes în vectori derivați de la asemenea virusuri.
Cel mai studiat sistem este cel de la Autographa californica:
infecţia virală la insecte determină formarea unor incluziuni
celulare specifice, citoplasmatice sau nucleare, cu aspect
poliedric sau granular, de natură proteică (polihedrina).
Incluziunile celulare pot conţine unul sau mai mulţi virioni; ele sunt
liberate prin liza celulelor şi pot contamina frunzele plantelor cu
care se hrănesc larvele altor insecte. Incluziunile protejează
virionii de căldură şi de acţiunea altor agenţi chimici; atunci când
sunt ingerate de larve şi ajung în tubul digestiv al acestora, ele se
dizolvă şi eliberează virionii care infectează celulele intestinului
insectei.
Au fost obţinuţi „in vitro” vectori plasmidiali incapabili de a se
multiplica în celulele de insecte, dar care conţin secvenţele
repetitive ale genomului viral, precum şi elementele reglatoare ale
genei pentru polihedrină (promotorul şi secvenţa de terminare), la
nivelul cărora se introduc fragmentele de ADN de interes.
Baculovirusurile, ca și vectorii derivați
de la acestea, pot infecta atât
insectele cât și linii celulare
menținute in vitro (așa cum sunt
liniile Sf21 sau Sf9). Co-transfecţia
celulelor de insecte cu vectorul ce
conţine fragmentele de ADN de
studiat împreună cu ADN viral (de
baculovirus) de tip sălbatic
determină introducerea în genomul
baculovirusului, prin recombinare (pe
baza omologiei secvenţelor
terminale şi a celor reglatoare din
vector şi din virus) a ADN de interes,
înlocuindu-se în acest fel gena
pentru polihedrină.
Baculovirusurile recombinate astfel
realizate pot fi utilizate atât pentru
obţinerea unor cantităţi mari de
proteine în celulele eucariote cât şi
pentru controlul invaziilor de insecte
Prin utilizarea unor vectori de exprimare derivați de la baculovirusuri, utilizând
ca marker gena gfp, în diferite laboratoare s-a reușit introducerea stabilă a unor
gene în specii variate de insecte. Acesta este cazul la Bombyx mori (viermele
de mătase) la care s-a reușit transferul și exprimarea genei gfp atât în larve cât
și la nivelul coconilor (gogoșilor de mătase)