LP 16. Identificarea stafilococilor. Hemocultura în diagnosticul infecţiei.

Obiective:

1. Cunoașterea etapelor de identificare a stafilococilor.

2. Cunoașterea definitiei si indicatiilor hemoculturii.

3. Cunoașterea speciilor bacteriene izolate frecvent din hemocultură.

4. Cunoașterea particularităţilor hemoculturii, momentul, numărul şi volumul prelevărilor, incubarea şi

urmărirea hemoculturilor, interpretarea rezultatelor.

1. Identificarea stafilococilor.
Coci gram pozitivi

Testul catalazei

(+) (-)

Genul Staphylococcus Genul Streptococcus

Testul coagulazei

(+) (-)

Stafilococi coagulază pozitivi (cel mai frecvent S. aureus) Stafilococi coagulază negativi

Testarea sensibilităţii la Novobiocină

R ( < 16 mm) S ( > 16mm)

S. saprophyticus un alt stafilococ
coagulazo-negativ
(spre ex., S. epidermidis)

Caractere microscopice: coci gram pozitivi, dispuşi izolat, în perechi, scurte lanţuri, predominant în
grămezi, imobili, nesporulaţi.
1
Caractere de cultivare: colonii S, rotunde, bombate, pigmentate diferit (portocaliu, galben, alb).

- pe geloză sânge pot forma colonii hemolitice,

- cresc pe medii cu sare (ex. agar Chapman), ceea ce permite izolarea din produse patologice contaminate
(exsudat nazal, materii fecale)

Testul catalazei

Principiu: Catalaza este o hemoproteină care descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen.
Interpretare:
 pozitiv: apariţia bulelor de gaz până la efervescenţă la contactul dintre cultura bacteriana si H2O2
 negativ: absenţa bulelor

Testul coagulazei

Principiu: peste 96% din tulpinile de S aureus coagulează plasma prin:

-activarea unui factor plasmatic similar trombinei: coagulaza liberă
-acţiunea directă asupra fibrinogenului: coagulaza legată de peretele celular.

Interpretare:
 pentru testul pe lamă pentru coagulaza legată :
pozitiv: aparitia de mici coaguli în 15-20 sec.
negativ: absenţa reactiei în 2-3 minute (necesită confirmare)
 pentru testul în tub pentru coagulaza liberă:
pozitiv: coagulare , indiferent de gradul ei ( în masă, văl de fibrină)
negativ: absenţa cheagului

Test de latex aglutinare pentru identificarea S. aureus prin depistarea: clumping factor (coagulaza
legată), proteina A, polizaharide capsulare.

Control pozitiv: Staphylococcus aureus ATCC®25923.

Control negativ: Staphylococcus epidermidis ATCC®12228.

2
 Fig. 1: Identificarea stafilococilor prin latex aglutinare
Legenda; 1. aglutinare prezentă (S. aureus), 2. aglutinare absentă (stafilococ coagulază-negativ)
(https://www.fishersci.co.uk/shop/products/staphytect-plus-latex-agglutination-test/p-6758539)

Lizotiparea S. aureus:

Principiu: are la bază fenomenele de lizogenie şi de specificitate a receptorilor faţă de anumiţi

bacteriofagi.

Utilitate- în studiile epidemiologice

Genotiparea S.aureus – prin tehnici de biologie moleculară

Analiza prin spectrometrie de masă - MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization -
Time of Flight / Ionizarea prin desorpţie din matrice asistată Laser) –permite diferentierea complexelor
clonale ale S. aureus - util in studii epidemiologice

2. Hemocultura

Hemocultura = însămânţarea şi incubarea într-un mediu de cultură adecvat a unei probe de sânge,
în scopul izolării şi identificării bacteriilor pe care le conţine.

Indicaţiile hemoculturii:
- bacteriemii cu mai multe posibile etiologii
- endocardită infecţioasă
- sindrom sugestiv pentru o infecţie sistemică cu bacterii strict patogene: salmonele tifoidice,
Leptospira, Brucella
- sindrom febril de origine neprecizată
- stări febrile după cateterism venos prelungit, dializă peritoneală, etc.

Specii bacteriene izolate frecvent şi cu semnificaţie clinică din hemocultură:

Staphylococcus aureus
Bacili gram-negativi fermentativi (Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp.)
Streptococi α hemolitici (streptococi viridans)
Streptococi β-hemolitici de grup A, B, C, G
Pneumococi
Enterococi
Haemophilus influenzae tip b
Pseudomonas aeruginosa
Bacterii anaerobe

Particularităţile hemoculturii:

- numărul mic de bacterii prezente în sânge (efectul bactericid al sângelui) → ce volum de sânge trebuie
să recoltăm?
3
- descărcările bacteriene în sânge sunt intermitente → câte probe trebuie să recoltăm? când şi cum ?

Tehnica hemoculturii:

a. prelevarea hemoculturii:

o medii de cultură:

o medii lichide cu valoare nutritivă mare, adecvate pentru creşterea unei game largi de
bacterii si fungi
o pentru anaerobi: flacoane cu atmosferă anaerobă
o medii pentru sistemele automate de urmărire a hemoculturilor
o volumul prelevărilor

o la adult - 20 ml per prelevare

o nou-născuţi, sugari şi copii mici – 1-3 ml (concentraţia bacteriilor în sânge este mai mare
decât la adult)
o numărul prelevărilor

o în bacteriemii continue (ex. endocardita) – 2 prelevări

o în bacteriemii intermitente – 3 prelevări în 24 ore, în caz de urgenţă la interval de 30-60
minute
o momentul prelevării

o înaintea instituirii antibioticoterapiei

o cât mai aproape de debutul bolii
o în momentul apariţiei frisoanelor sau în cursul evoluţiei ascendente a curbei febrile
o în bacteriemii continue (endocardita infecţioasă) – oricând în cursul zilei
o tehnica prelevării

 cele 2-3 prelevări trebuie făcute din vene diferite şi de fiecare dată în cel puţin 2 flacoane diferite
 decontaminarea zonei de puncţie, prin stergerea prin miscari circulare, folosind tampoane cu alcool
70°, ulterior tampoane cu betadina sau clorhexidina si, la final, uscare timp de 30 secunde.
 pregătirea flacoanelor cu medii de cultură – medii preîncălzite la 37ºC ; dezinfecţia membranei de
cauciuc
 recoltăm 10 ml de sange/flacon, minimum 5 ml.
 agitarea blândă a flaconului
 transportul cât mai rapid la laborator

b. incubarea hemoculturilor şi urmărirea lor

o urmărire timp de 7 zile cu examinare macroscopică, microscopică şi prin subcultivare

o endocardite infecţioase, pacienţi trataţi cu antibiotice, suspectarea unor microorganisme pretenţioase
nutritiv – urmărire timp de 14-21 de zile
o examenul macroscopic - de 2 ori pe zi în primele 3 zile, apoi zilnic, cu aprecierea semnelor creşterii:

o prezenţa coloniilor sau a unui depozit pe stratul de hematii

o tulburarea mediului
o hemoliza
4
 o coagularea mediului
o prezenţa bulelor de gaz

o examenul microscopic - frotiuri Gram efectuate din flacoane.

o subcultivarea

 hemocultură cu creştere evidentă – subcultivare pe medii adecvate bacteriei observate la examenul

microscopic, în atmosferă adecvată în funcţie de flaconul în care a apărut creşterea.
 se pot efectua teste de identificare pe cultură primară şi antibiogramă pe cultură primară, ce va trebui
confirmată prin antibiograma standardizată a subculturii.
o identificarea bacteriei izolate

o testarea sensibilităţii la antibiotice

c. interpretarea rezultatelor → argumentarea semnificaţiei clinice a bacteriei izolate:

o argumentele bacteriologului:

 izolarea aceleiaşi bacterii în mai multe flacoane ale unui set de hemocultură sau în hemoculturi
repetate din sedii venoase diferite  semnificaţie clinică
 izolarea unor bacterii diferite din flacoanele hemoculturilor de la acelaşi pacient  contaminare
 izolarea a ≥ 2 specii bacteriene din aceeaşi hemocultură de cel puţin 2 ori în 24 ore  bacteriemie
polimicrobiană
o argumentele clinicianului
 vârsta şi statusul imun al pacientului
 particularităţile focarului septic primar

Bibliografie:

Buiuc D.: Microbiologie Medicală, ed. a VI-a, Editura “Gr. T. Popa” Iaşi, 2003, cap 8, pag 154-160, cap
40, pag 372-377