Protocol de lucru pentru determinarea concentratiei unei solutii

folosind spectrofotometrul

Materiale necesare:

 spectrofotometrul Helios ε
 solutia de referinta: apa distilata
 solutii de cercetat: solutii de acridin-orange (AO) de concentratii cunoscute si de concentratie
necunoscuta: 2‰, 4‰, 8‰, x‰ (AO este o substanta fluorescenta cu doua maxime de
absorbtie: 494 nm pt monomer si 465 nm pt dimer/ apare in cazul solutiilor concentrate)
 cuve pentru spectrofotometru
 linie
 marker
 hartie de filtru

Mod de lucru:

A. Efectuarea masuratorilor:

1. Se porneste spectrofotometrul (butonul "ON"); se asteapta 5 min inainte de a incepe

masuratorile, pana cand lampa aparatului se incalzeste si temperatura acesteia devine constanta.
2. Se selecteaza metoda de inregistrare: Absorbanta (A), de la butonul "Mode"
3. Se selecteaza lungimea de unda de la butoanele cu sageti (regiunea centrala a aparatului); se
va incepe cu lungimea de unda: 440nm.
4. Calibrarea spectrofotometrului:

 o cuva se umple cu apa distilata pana in dreptul liniei orizontale; se

noteaza pe cuva tipul de solutie pe care il contine
 se deschide capacul spectrofotometrului
 se introduce cuva cu apa distilata in spectrofotometru, astfel incat
peretii transparenti ai cuvei sa permita trecerea neperturbata a
luminii prin cuva cu solutie
 se inchide capacul spectrofotometrului
 se regleaza transmitanta automat prin apasarea butonului "Zero"
 se indeparteaza cuva cu apa distilata

5. Se noteaza pe cuve numele solutiilor ce vor fi analizate: solutiile 2‰, 4‰, 8‰, x‰ de AO si se
umplu cuvele cu solutiile de cercetat
6. Se introduc una cate una cuvele cu solutiile de AO (2‰, 4‰, 8‰, x‰) in spectrofotometru si
se citeste absorbanta pe ecranul spectrofotometrului pt fiecare solutie in parte
7. Valorile absorbantelor se noteaza intr-un tabel (coloane: absorbanta; linii: lungimea de unda).
Este posibil ca aceste valori sa fie inregistrate si pe hartie prin apasarea butonului "Print".
8. Se repeta etapele anterioare pentru o alta lungime de unda, deoarece se vor efectua
masuratori din 10 in 10 nm de la 440 – 540 nm.
9. Se reorganizeaza locul de lucru.
10. Se opreste spectrofotometrul, iar stecherul se scoate din priza.

ATENTIE! Incurcarea probelor sau a valorilor inregistrate se penalizeaza cu doua puncte!

B. Calcularea concentratiei necunoscute a solutiei de AO:

1. Se traseaza un grafic A = f(λ)

2. Se traseaza cele patru curbe pentru fiecare solutie de AO (2‰, 4‰, 8‰, x‰); Obs: toate cele
patru curbe se traseaza pe acelasi grafic
 3. Se selecteaza lungimea de unda corespunzatoare maximului de absorbtie pentru toate cele
patru solutii de AO

4. Se calculeaza concentratia necunoscuta a solutiei de AO - doua metode:

a) calcularea concentratiei folosind metoda grafica:

 se traseaza un grafic A = f(c) – cu valorile absorbantei pentru maximul de absorbtie al

solutiilor de AO
 se determina concentratia necunoscuta a solutiei de AO prin intrapolare

b) calcularea concentratiei prin metoda matematica (metoda celor mai mici patrate):

 se scrie ecuatia dreptei de regresie:

Y=a+bX

A = a + b cx

A = absorbanta; cx = concentratia necunoscuta

 se calculeaza parametrii a si b – cu ajutorul unui program pentru calcularea parametrilor

dreptei de regresie.
 se inlocuiesc in ecuatia dreptei de regresie valorile parametrilor a si b
 se calculeaza concentratia necunoscuta a solutiei de AO.

5. Se compara valoarea concentratiei obtinuta prin metoda grafica cu valoarea obtinuta prin
metoda matematica

6. Se emit una – doua concluzii.