Introducere în PCR

POLYMERASE CHAIN REACTION sau PCR este una din cele mai utilizate
tehnici în biologia moleculară. PCR reprezintă o metodă de amplificare in vitro a unei
secevenţe specifice de ADN. Numele acestei tehnici derivă de la una din componentele
de bază ale sale, ADN-polimeraza, utilizată pentru a amplifica un fragment de ADN prin
replicare enzimatică in vitro. Pe măsură ce PCR progresează, ADN-ul nou generat este
utilizat pe post de matriţă (template) pentru replicare, ceea ce duce la o reacţie în lanţ, în
care ADN-ul matriţă este amplificat exponenţial. Astfel, PCR permite amplificarea de
milioane de ori a unor secvente de ADN (gene) specifice. Tehnica PCR a fost introdusă
de Karry Mullis et al. în 1984 (premiul Nobel in 1993).

Dezoltarea tehnicii PCR a fost posibilă datorită următoarelor cauze:

1) Descoperirea ADN polimerazelor termorezistente.
2) Posibilitatea de a sintetiza oligonucleotide cu orice secvenţă dorită, la un preţ relativ
scazut.

Majoritatea metodelor PCR sunt aplicate pentru amplificarea unor secvenţe de maximum
10 kb, dar există şi tehnici (long PCR) care permit amplificarea unor secvenţe de până la
40 kb.

Tehnica PCR necesită următoarele componente:

1) O matriţă ADN (DNA template) care conţine regiunea ce urmează a fi

amplificată.
2) O ADN polimerază termostabilă (Taq polimeraza, Pfu polimeraza, etc.)
necesară pentru a sintetiza noile fragmente de ADN; temperatura optimă de
acţiune a acestor enzime este de regulă 70-72ºC.
3) dNTP (amestec echimolecular de cei patru deoxi-nucleozid trifosfaţi),
“cărămizile” necesare sintezei noilor fragmente de ADN.
4) Primerii ADN (oligonucleotide necesare iniţierii sintezei ADN, numite şi
amorse). Primerii sunt secvenţe de ADN monocatenar complementare cu
regiunile care flanchează secvenţa ce urmează a fi amplificată. Într-o reacţie tipică
de amplificare se utilizează doi primeri: direct (forward primer) şi revers
(reverse primer).
5) O soluţie tampon care să asigure enzimei un mediu corespunzător unei activităţi şi
stabilităţi optime.
6) PCR Thermocycler, un aparat care permite încălzirea şi răcirea rapidă a tuburilor
de reacţie.

PCR polimerazele folosite în prezent provin din câteva surse nu tocmai obişnuite.
Cea mai utilizata este Taq polimeraza obţinută din bacteria termofilă Thermus
aquaticus, izolată din gheizerele din Parcul Naţional Yellowstone (SUA). O altă
polimerază numită Vent polimeraza, a fost izolată din bacteria Thermococcus litoralis,
bacterie întâlnită în zonele termale de pe fundul oceanelor. Pfu polimeraza provine din
bacteria termofilă Pyrococcus furiosus, izolată pentru prima dată din sedimentele marine
de lângă vulcanii din Italia. Aceste enzime sunt stabile la temepraturi de peste 95ºC,
temperatură la care ADN-ul este complet denaturat.

Etapele PCR

Etapa 1. Proiectarea secvenţelor primer. Pentru a replica fragmente de ADN,

este necesară cunoaşterea secvenţelor care marginesc regiunea de interes (se obţin de
regulă din baze de date accesibile pe Internet).
Etapa 2. Izolarea ADN matriţă (template) ce include fragmentul care trebuie
amplificat. Ca matriţă poate fi utilizat ADN-ul total (genomic sau cromozomial), ADNc
(cDNA obţinut prin copierea mARN cu ajutorul unei revers-transcriptaze), sau chiar
clone specifice, fragmente de ADN, etc. Este necesară o cantitate foarte mica de ADN
matriţă, astfel încât pot fi analizate probe foarte mici (uneori sunt suficiente cateva
celule).
Etapa 3. Prepararea amestecului de reacţie. In această etapă, sunt adăugate
peste ADN-ul matriţă un exces de primeri (oligonucleotide), ADN polimeraza şi cei patru
deoxinucleozid- trifosfataţi.
Etapa 4. Denaturarea ADN-ului matriţă. Amestecul este incălzit la 94-95ºC
pentru a denatura ADN, care se separă în cele două catene complementare.
Etapa 5. Anelarea (annealing). Amestecul de ADN este răcit la 50-55ºC.
Aceasta permite primerilor sa se lege specific de secvenţele complentare de pe ADN-ul
matriţă: un primer pentru fiecare catena de ADN. Polimeraza detectează
oligonucleotidele anelate (hibridizate) şi le foloseşte ca primeri pentru a conveti ssADN
(single stranded DNA, monocatenar) în forma dublu catenara (dsDNA). Temperatura de
anelare depinde de Tm al primerilor.
Etapa 6. Elongarea. Se ridică temperatura la 70-72ºC, temperatura optimă pentru
polimerazele termo-rezistente. Temperaturi mai stringente permit doar reacţiile primerilor
ataşaţi corect (primerii nelegati foarte bine de situsuri mai putin complementare sunt
denaturati). Timpul de elongare se stabileşte în funcţie de lungimea fragmentului de
amplificat (1 min/1000 bp).
Etapa 7. După formarea dsADN, temperatura de reacţie este crescută din nou la
95ºC. ADN polimeraza este stopată, iar noul dsADN este denaturat.
Etapa 8. Se repetă procesul. Amestecul de reacţie este răcit la 50-55ºC,
permiţându-se legarea unui nou set de primeri şi reînceperea procesului de replicare a
ADN-ului de către polimerază. După al doilea ciclu de PCR, se obţin 4 copii de ADN.
Etapa 9. Se repetă ciclul de 20-25 de ori. În 20 de cicluri complete ADN se poate
amplifica teoretic de până la 1 milion de ori, considerând că fiecare ciclu are un
randamnet de 90%.
 Set de 8 amestecuri de reacţii PCR

Nu există un maxim al numarului de cicluri de replicare. Totuşi, la un număr

foarte mare de cicluri apare un numar considerabil de erori care pot fi generate prin
amplificarea unor secvenţe contaminante. De regulă se utilizează protocoale cu 20-30
cicluri de amplificare.

Schema amplificării unui fragment de ADN prin PCR

Reactanții PCR devin factori limitativi
Aparat PCR (PCR thermocycler)