PCR amplifică o regiune specifică a unei catene de ADN (ținta ADN).

Majoritatea metodelor PCR

amplifică fragmente de ADN între 0,1 și 10 kilograme de perechi de bază (kbp), deși unele tehnici
permit amplificarea fragmentelor de până la 40 kbp. [8] Cantitatea de produs amplificat este
determinată de substraturile disponibile în reacție, care devin limitate în timp ce reacția
progresează. [9]
Un set de bază PCR necesită mai multe componente și reactivi, [10] incluzând:

 un șablon ADN care conține regiunea țintă a ADN-ului pentru amplificare

 o polimerază ADN , o enzimă care polimerizează lanțurile ADN noi; rezistentă la căldură, Taq
polimeraza este deosebit de obișnuită, [11] deoarece este mult mai probabil să rămână intactă în
timpul procesului de denaturare a ADN la temperatură ridicată
 doi primeri de ADN care sunt complementari la capetele 3 ' (cele trei primare) ale fiecăruia dintre
firele sens și anti-sense ale țintei ADN (ADN polimeraza se poate lega și se poate alungi dintr-o
regiune dublu catenară a ADN-ului, fără primeri acolo nu este un situs de inițiere dublu-catenar
la care polimeraza se poate lega); [1]primii specifici care sunt complementari regiunii țintă a ADN-
ului sunt selectați în prealabil și sunt adesea făcuți la comandă într-un laborator sau achiziționați
de la furnizori comerciali din domeniul biochimic
 trifosfații deoxinucleozidici sau dNTP (uneori numiți "trifosfați deoxinucleotidici", nucleotide care
conțin grupări trifosfatice), blocurile de construcție din care ADN polimeraza sintetizează o nouă
porțiune ADN
 o soluție tampon care asigură un mediu chimic adecvat pentru activitatea optimă și stabilitatea
ADN polimerazei
 cationi bivalenți , în mod tipic ioni de magneziu (Mg) sau mangan (Mn); Mg2 + este cel mai des
întâlnit, dar Mn2 + poate fi folosit pentru mutagenizarea ADN mediatăde PCR , deoarece o
concentrație mai mare de Mn 2+ crește rata de eroare în timpul sintezei ADN [12]
 cationi monovalenți , în mod tipic ioni de potasiu (K)
Reacția se desfășoară în mod obișnuit într-un volum de 10-200 pl în tuburi mici de reacție (volume
0,2-0,5 ml) într-un ciclu termic . Ciclul termic încălzește și răcește tuburile de reacție pentru a atinge
temperaturile necesare în fiecare etapă a reacției

Procedură [ editați ]
În mod obișnuit, PCR constă într-o serie de 20-40 de schimbări de temperatură repetate, numite
cicluri, fiecare ciclu constând în mod obișnuit din două sau trei trepte de temperatură
discrete. Ciclismul este adesea precedat de o singură treaptă de temperatură la o temperatură
foarte ridicată (> 90 ° C )urmată de o menținere la sfarsit pentru extinderea produsului final sau
pentru o scurtă depozitare. Temperaturile utilizate și durata de timp în care sunt aplicate în fiecare
ciclu depind de o varietate de parametri, incluzând enzima folosită pentru sinteza ADN, concentrația
ionilor bivalenți și dNTP în reacție și temperatura de topire ( Tm ) a primerilor . [13] Etapele individuale
comune majorității metodelor PCR sunt următoarele:

 Inițializare : Această etapă este necesară numai pentru ADN polimerazele care necesită
activarea căldurii prin PCR de pornire la cald . [14] Se compune din încălzirea camerei de reacție
la o temperatură de 94-96 ° C (201-205 ° F) sau 98 ° C (208 ° F) dacă se utilizează polimeraze
extrem de termostabile, care este apoi menținută pentru 1- 10 minute.
 Denaturare : Această etapă este primul eveniment de ciclism obișnuit și constă în încălzirea
camerei de reacție la 94-98 ° C (201-208 ° F) timp de 20-30 secunde. Acest lucru
determină topirea sau denaturarea ADN a șablonului ADN dublu catenar prin ruperea legăturilor
de hidrogen dintre bazele complementare, producând două molecule ADN monocatenare.
 Reacție : în etapa următoare, temperatura de reacție este redusă la 50-65 ° C (122-149 ° F)
timp de 20-40 secunde, permițând recoacerea primerilor la fiecare dintre șabloanele ADN
 monovalent. Doi primeri diferiți sunt în mod obișnuit incluse în amestecul de reacție: unul pentru
fiecare dintre cele două complementare monocatenare care conțin regiunea țintă. Primerii sunt
însăși secvențe monocatenare, dar sunt mult mai scurte decât lungimea regiunii țintă,
completând numai secvențe foarte scurte la capătul 3 'al fiecărei catene.
Este esențial să se determine o temperatură adecvată pentru etapa de recoacere, deoarece
eficiența și specificitatea sunt puternic afectate de temperatura de recoacere. Această
temperatură trebuie să fie suficient de scăzută pentru a permite hibridizarea primerului la fir,
dar suficient de mare pentru ca hibridizarea să fie specifică, adică primerul trebuie să se
lege numai unei părți perfect complementare a firului, și nicăieri altundeva. Dacă
temperatura este prea mică, grundul se poate lega imperfect. Dacă este prea mare, grundul
poate să nu se leagă deloc. O temperatură tipică de recoacere este de aproximativ 3-5 ° C
sub Tm a primerilor utilizați. Legăturile stabile de hidrogen dintre bazele complementare se
formează numai atunci când secvența de primer se potrivește foarte mult cu secvența
șablonului. În timpul acestei etape, polimeraza se leagă la hibridul de tip primer-șablon și
începe formarea ADN-ului.

 Extindere / alungire : Temperatura din această etapă depinde de ADN polimeraza

utilizată; temperatura optimă a activității pentru polimeraza Taq este de aproximativ 75-80 °
C (167-176 ° F), [15] [16] deși o temperatură de 72 ° C (162 ° F) este frecvent utilizată cu
această enzimă. În această etapă, polimeraza ADN sintetizează o nouă catenă de ADN
complementară la șirul de șablon ADN prin adăugarea de dNTP-uri libere din amestecul de
reacție care sunt complementare la șablon în direcția 5'-la-3
', condensarea grupării 5'- fosfat din dNTP-urile cu gruparea 3'- hidroxi la capătul benzii de
ADN în curs de dezvoltare (alungire). Timpul exact necesar pentru alungire depinde atât de
polimeraza ADN utilizată, cât și de lungimea regiunii țintă a ADN-ului pentru amplificare. Ca
regulă generală, la temperatura optimă, cele mai multe polimeraze ADN polimerizează o
mie de baze pe minut. În condiții optime (adică dacă nu există limitări datorate limitării
substraturilor sau reactivilor), la fiecare etapă de extensie / alungire, numărul de secvențe
țintă ADN este dublat. Cu fiecare ciclu succesiv, firele originale de șablon plus toate firele
noi generate devin fire de șablon pentru următoarea rundă de alungire, ducând la
amplificarea exponențială (geometrică) a regiunii țintă specifice a ADN-ului.
Procesele de denaturare, recoacere și alungire constituie un singur ciclu. Sunt necesare mai
multe cicluri pentru a amplifica ținta ADN la milioane de exemplare. Formula folosită pentru
calcularea numărului de copii ADN formate după un număr dat de cicluri este 2 n ,
unde n este numărul de cicluri. Astfel, o reacție stabilită pentru 30 de cicluri are ca rezultat
copii de 30 , sau 1073741824, din regiunea originară cu ADN dublu catenar țintă.

 Elongație finală : Această etapă unică este opțională, dar este efectuată la o
temperatură de 70-74 ° C (intervalul de temperatură necesar activității optime a
majorității polimerazelor utilizate în PCR) timp de 5-15 minute după ultimul ciclu PCR
pentru a se asigura că orice ADN monocatenar rămas este complet alungit.
 Captare finală : Treapta finală răcește camera de reacție la 4-15 ° C (39-59 ° F) pentru
o perioadă nedeterminată și poate fi utilizată pentru stocarea pe termen scurt a
produselor PCR.

Etape [ edita ]
Ca și în cazul altor reacții chimice, viteza de reacție și eficiența PCR sunt afectate de factori
limitativi. Astfel, întregul proces PCR poate fi în continuare împărțit în trei etape pe baza progresului
reacției:
 Exploatarea amplificării : la fiecare ciclu, cantitatea de produs este dublată (presupunând o
eficiență de reacție de 100%). Reacția este foarte sensibilă: trebuie să existe numai cantități
minime de ADN. [17]
 Leveling out stage : Reacția încetinește deoarece ADN polimeraza pierde activitate și consumul
de reactivi, cum ar fi dNTP-urile și primerii, îi determină să devină limitativi.
 Platoul : Produsul nu se mai acumulează datorită epuizării reactivilor și a enzimei.

Aplicații medicale [ editați ]

După finalizarea secvențierii primului genom în anul 2000, Proiectul genomului uman , [27] PCR a fost
aplicat unui număr mare de proceduri medicale:

 Prima aplicație a PCR a fost utilizată pentru testarea genetică , unde a fost analizată o probă
de ADN pentru prezența mutațiilor genetice ale bolii . [4] Părinții potențiali pot fi testați pentru a
fi purtători genetici sau copiii lor pot fi testați pentru a fi afectați de o boală . Probele de ADN
pentru testarea prenatală pot fi obținute prin amniocenteză , prelevarea de vii de corieni sau
chiar prin analiza celulelor fetale rare care circulă în sângele mamei. Analiza PCR este, de
asemenea, esențială pentru diagnosticul genetic preimplantare , unde celulele individuale ale
unui embrion în curs de dezvoltare sunt testate pentru mutații.
 PCR poate fi, de asemenea, utilizat ca parte a unui test sensibil pentru tipărirea țesuturilor ,
vital pentru transplantul de organe . Începând cu 2008, există chiar o propunere de înlocuire a
testelor tradiționale pe bază de anticorpi pentru tipul de sânge cu teste pe bază de PCR. [28]
 Multe forme de cancer implică modificări la oncogene . Prin utilizarea testelor bazate pe PCR
pentru a studia aceste mutații, regimurile terapeutice pot fi uneori personalizate individual pentru
un pacient.PCR permite diagnosticarea precoce a bolilor maligne , cum ar
fi leucemia și limfoamele , care este în prezent cel mai dezvoltat în cercetarea cancerului și este
deja folosit în mod obișnuit. Testele PCR pot fi efectuate direct pe probe de ADN genomic
pentru a detecta celulele maligne specifice translocării la o sensibilitate care este de cel puțin 10
000 ori mai mare decât cea a altor metode. [29] PCR este foarte util în domeniul medical,
deoarece permite izolarea și amplificarea supresoarelor tumorale. De exemplu, PCR cantitative
poate fi utilizat pentru a cuantifica și analiza celulele singulare, precum și pentru a recunoaște
confirmările și combinațiile de ADN, mRNA și proteine. [25]
.

Cereri de boală infecțioasă [ editați ]

PCR permite diagnosticarea rapidă și foarte specifică a bolilor infecțioase, inclusiv a celor cauzate
de bacterii sau viruși. [30] De asemenea, PCR permite identificarea microorganismelor care nu se
cultivă sau care cresc lent, cum ar fi micobacteriile , bacteriile anaerobe sau virușii din
analizele culturilor de țesut și modelele animale . Baza pentru aplicațiile de diagnosticare PCR în
microbiologie este detectarea agenților infecțioși și discriminarea non-patogenă din tulpinile
patogene în virtutea unor gene specifice. [30] [31]
Caracterizarea și detectarea organismelor cu boli infecțioase au fost revoluționate prin PCR în
următoarele moduri:

 Virusul imunodeficienței umane (sau HIV ) este o țintă dificil de găsit și eradicat. Cele mai
vechi teste pentru infecție s-au bazat pe prezența anticorpilor la virusul care circulă în sânge. Cu
toate acestea, anticorpii nu apar până la mai multe săptămâni după infecție, anticorpii materni
maschează infecția unui nou-născut, iar agenții terapeutici pentru combaterea infecției nu
 afectează anticorpii. Au fost dezvoltate teste PCR care pot detecta cât mai puțin un genom viral
în ADN-ul a peste 50.000 de celule gazdă. [32] Infecțiile pot fi detectate mai devreme, sângele
donat poate fi testat direct pentru virus, iar nou-născuții pot fi imediat testați pentru infecție, iar
efectele tratamentelor antivirale pot fi cuantificate .
 Unele organisme de boală, cum ar fi cele pentru tuberculoză , sunt greu de prelevat de la
pacienți și lent să fie cultivate în laborator. Testele bazate pe testele PCR au permis detectarea
unui număr mic de organisme ale bolii (atât vii cât și morți), în probe convenabile. Analiza
genetică detaliată poate fi de asemenea utilizată pentru a detecta rezistența la antibiotice,
permițând o terapie imediată și eficientă.Efectele terapiei pot fi, de asemenea, evaluate imediat.
 Răspândirea organismului bolii prin intermediul populațiilor de
animale domestice sau sălbatice poate fi monitorizată prin teste PCR. În multe cazuri, apariția
unor noi subtipuri virulente poate fi detectată și monitorizată. Subtipurile unui organism care au
fost responsabile pentru epidemiile anterioare pot fi, de asemenea, determinate prin analiza
PCR.
 ADN viral poate fi detectat prin PCR. Primerii utilizați trebuie să fie specifici pentru secvențele
vizate în ADN-ul unui virus și PCR poate fi folosit pentru analize de diagnosticare sau
secvențierea ADN a genomului viral. Sensibilitatea ridicată a PCR permite detectarea virusului la
scurt timp după infecție și chiar înainte de declanșarea bolii. [30] O astfel de detectare precoce
poate oferi medicilor un timp semnificativ de plumb în tratament. Cantitatea de virus
(" încărcătura virală ") la un pacient poate fi, de asemenea, cuantificată prin tehnici de
cuantificare a ADN pe bază de PCR (a se vedea mai jos).
Aplicații legale [ editați ]
Dezvoltarea protocoalelor de amprentare genetică (sau ADN ) pe bază de PCR ( PCR ) a cunoscut
o largă aplicare în domeniul criminalistic :

 În forma sa cea mai discriminatorie, amprentele genetice pot discrimina în mod unic orice
persoană din întreaga populație a lumii . Eșantioane minuscule de ADN pot fi izolate de la locul
crimei și în comparație cu cele ale suspecților sau dintr-o bază de date ADN a dovezilor
anterioare sau condamnați. Versiuni mai simple ale acestor teste sunt adesea folosite pentru a
exclude rapid suspecții în timpul unei investigații penale. Dovezile provenite din infracțiuni de
vechime în ultimele decenii pot fi testate, confirmând sau exonerând persoanele condamnate
inițial.
 Examinarea ADN-ului legalizat a fost o modalitate eficientă de a identifica sau de a exonera
suspecții criminali din cauza analizei probelor descoperite la locul crimei. Genomul uman are
multe regiuni repetitive care pot fi găsite în secvențele genice sau în regiuni necodificate ale
genomului. În mod specific, până la 40% din ADN-ul uman este repetat. Există două categorii
distincte pentru aceste regiuni repetitive, care nu codifică genomul. Prima categorie se numește
repetiție tandemă cu numărul variabil (VNTR), care are o lungime de 10-100 de perechi de
baze, iar a doua categorie se numește repetări tandem scurte (STR) și acestea constau în
secțiuni repetate de 2-10 perechi de bază. PCR este folosit pentru a amplifica mai multe VNTR-
uri bine cunoscute și STR-uri folosind primeri care flanchează fiecare regiune
repetitivă. Mărimile fragmentelor obținute de la orice individ pentru fiecare dintre STR-uri vor
indica care alele sunt prezente. Prin analizarea mai multor STR-uri pentru un individ, se va găsi
un set de alele pentru fiecare persoană care ar putea fi statistic unic. [34] Cercetătorii au identificat
secvența completă a genomului uman. Această secvență poate fi accesată cu ușurință prin
intermediul site-ului NCBI și este utilizată în multe aplicații din viața reală. De exemplu, FBI a
elaborat un set de situri marker ADN folosite pentru identificare, acestea fiind numite baza de
date ADN-ul combinat ADN Index (CODIS). [34] Utilizarea acestei baze de date permite analiza
statistică pentru a determina probabilitatea ca o mostră de ADN să se potrivească. PCR este un
instrument puternic și semnificativ de analiză pentru a fi folosit pentru tastarea ADN-ului
criminalistic, deoarece cercetătorii au nevoie doar de o cantitate foarte mică de ADN țintă care
 să fie folosită pentru analiză. De exemplu, un singur păr uman cu folicul de păr atașat are ADN
suficient pentru a efectua analiza. În mod similar, câteva spermă, mostre de piele de sub unghii
sau o cantitate mică de sânge pot furniza ADN suficient pentru analize concludente. [34]
 Formele mai puțin discriminatorii de amprentare a ADN-ului pot ajuta la testarea paternității
ADN-ului , unde un individ se potrivește cu rudele apropiate. ADN-ul din rămășițele umane
neidentificate poate fi testat și comparat cu cel din părinți, frați sau copii posibili. Teste similare
pot fi folosite pentru a confirma părinții biologici ai unui copil adoptat (sau răpit). Tatăl biologic
actual al unui nou-născut poate fi, de asemenea, confirmat (sau exclus).
Aplicații de cercetare [ editați ]
PCR a fost aplicat în multe domenii de cercetare în domeniul geneticii moleculare:

 PCR permite producerea rapidă de fragmente scurte de ADN, chiar dacă nu este cunoscută mai
mult de secvența celor doi primeri. Această capacitate a PCR amplifică multe metode, cum ar fi
generarea de sonde de hibridizare pentru hibridizarea Southern sau Northern blot . PCR
furnizează aceste tehnici cu cantități mari de ADN pur, uneori ca un singur fir, ceea ce permite
analiza chiar și din cantități foarte mici de materie primă.
 Sarcina secvențierii ADN poate fi, de asemenea, asistată de PCR. Segmente cunoscute de
ADN pot fi ușor produse de la un pacient cu o mutație genetică a bolii. Modificările tehnicii de
amplificare pot extrage segmente dintr-un genom complet necunoscut sau pot genera doar o
singură ramură a unei zone de interes.
 PCR are numeroase aplicații la procesul mai tradițional de clonare a ADN-ului . Poate extrage
segmente pentru introducerea într-un vector dintr-un genom mai mare, care poate fi disponibil
numai în cantități mici. Folosind un singur set de "primeri vectori", poate de asemenea să
analizeze sau să extragă fragmente care au fost deja inserate în vectori. Unele modificări la
protocolul PCR pot genera mutații (generale sau direcționate către situs) ale unui fragment
inserat.
 Secțiunile cu etichetă secvențială sunt un proces în care PCR este folosit ca indicator care
indică faptul că un anumit segment al unui genom este prezent într-o anumită clonă. Proiectul
genomului uman a găsit această aplicație vitală pentru cartografierea clonelor cosmice pe care
le-au secvențat și pentru coordonarea rezultatelor din diferite laboratoare.
 O aplicație interesantă a PCR este analiza filogenetică a ADN-ului din surse antice , cum ar fi
cea găsită în oasele recuperate ale neandertalilor sau din țesuturile înghețate ale mamuților . În
unele cazuri, ADN-ul puternic degradat din aceste surse ar putea fi reasamblat în primele etape
de amplificare.
 O aplicație comună a PCR este studiul modelelor de exprimare a genei . Țesuturile (sau chiar
celule individuale) pot fi analizate în diferite etape pentru a vedea care gene au devenit active
sau care au fost oprite. Această aplicație poate utiliza, de asemenea, PCR cantitativ pentru a
cuantifica nivelurile reale de exprimare
 Abilitatea PCR de a amplifica simultan mai multe loci de la sperma individuală [35] a îmbunătățit
mult sarcina tradițională a cartografierii genetice prin studierea încrucișărilor
cromozomiale după meioze .Evenimentele incrucisate rare între locurile foarte apropiate au fost
observate direct prin analiza a mii de spermă individuală. În mod similar, pot fi analizate ștergeri,
inserții, translocații sau inversiuni neobișnuite, toate fără a trebui să așteptați (sau să plătiți)
procesele lungi și laborioase de fertilizare, embriogeneză etc.

Avantaje [ edit ]
PCR are o serie de avantaje. Este destul de simplu de înțeles și de utilizat și produce rezultate
rapide. Tehnica este extrem de sensibilă cu potențialul de a produce milioane până la miliarde de
copii ale unui produs specific pentru secvențiere, clonare și analiză. qRT-PCR are aceleași avantaje
ca PCR, cu un avantaj suplimentar al cuantificării produsului sintetizat. Prin urmare, are utilizările
sale pentru a analiza modificările nivelurilor de exprimare a genelor în tumori, microbi sau alte stări
de boală. [36]

Limitări [ editați ]
O limitare majoră a PCR este aceea că informația prealabilă despre secvența țintă este necesară
pentru a genera primeri care să permită amplificarea sa selectivă. [37] Aceasta înseamnă că, în mod
obișnuit, utilizatorii de PCR trebuie să cunoască secvența precisă (secvențe) în amonte de regiunea
țintă pe fiecare dintre cele două șabloane monocatenare, pentru a se asigura că ADN-polimeraza se
leagă în mod adecvat de hibrizii de șablon primar și ulterior generează întreaga regiune țintă în
timpul sintezei ADN.
Ca toate enzimele, ADN-polimerazele sunt de asemenea predispuse la erori, care la rândul lor
cauzează mutații în fragmentele PCR care sunt generate. [38]