Receptori  Plasmidelor membranare

 Esenta vietii (fenomene biotice) consa in capacitatea structurilor vii de a oxida gradat diferite
substante, utilizand mare parte din energia chimica astfel eliberata pentru desfasurarea anumitor
reactii chimice ce consuma energie (endergonice). Ansamblul acestor procese de nivel molecular se
numeste metabolism și sta la baza vietii, asigurand conditiile energetice pentru fenomenele
antientropice de pastrare și dezvoltare a structurilor proprii.

              Celula este unitatea fundamentala a materiei vii. La nivel celular se manifesta toate
proprietatile generale, fundamentale ale materiei vii: metabolism, excitabilitate, miscare, reproducere,
asigurate fiind in mod diferentiat prin specializari ale organitelor celulare.

              Componenta principala a membranei celulare este plasmalema, un bistrat fosfolipidic in care

se gasesc proteine periferice și integrate, la care se adauga glicocalixul (cu compozitie predominant
glicoproteica) la exterior și citoscheletul submembranar și reticul endoplasmic superficial la interior.
Citoplasma este compartimentata printr-un sistem de membrane fosfolipidice intracelulare.

              Plasmalema delimiteaza celula, asigurand schimburi controlate de substanta și informatie cu

mediul extracelular. Ea prezinta structuri specializate pentru diverse aspecte functionale: transferul
substantelor hidrofile (pori, canale, transportori), recunoasterea semnalelor biochimice (receptori),
legatura cu celulele invecinate (jonctiuni stranse și comunicante), miscarea celulei / lichidului
extracelular (cili și flageli).

              Permeabilitatea sa selectiva sta la baza diferentelor de compozitie ionica intre mediul intra-
și extracelular, ce explica existența potentialului electric membranar de repaus. Variatiile de potential
electric membranar au o importanța speciala in semnalizarea la nivel celular.

              Transportul transmembranar se realizeaza ca macro- și microtransfer. Dupa sens,

macrotransferul poate fi endocitoza și exocitoza. Microtransferul poate fi pasiv sau activ, dupa cum se
realizeaza in sensul sau impotriva gradientului electrochimic transmembranar.

              Transportul pasiv este de fapt un proces de difuzie prin membrane. In general rata de difuzie
printr-o membrana este direct proportionala cu temperatura absoluta, gradientul de concentratie și
coeficientul de permeabilitate, determinat la randul sau de coeficientul de partiție intre membrane și
mediu. Substantele lipofile difuzeaza usor prin bistratul fosfolipidic, iar cele hidrofile utilizeaza diverse
cai hidrofile. In sensul scaderii ratei de transfer și al cresterii selectivitatii, precum și pe baza
diferentelor structurale, caile hidrofile pot fi clasificate in pori, canale și transportori. Porii și canalele
sunt structuri proteice care delimiteaza cai apoase transmembranare. Canalele prezinta bariere de
permeabilitate și de selectivitate, unele din ele operate chimic sau electric. Difuzia transmembranara
pe cai preferentiale specifice se numeste facilitate, in opozitie cu difuzia simpla. Difuzia apei prin
membrane se numeste osmoza.

              In cazul transportorilor, transferul de substanta presupune legarea acesteia de proteina

transportoare pe o fața a membranei, o anume modificare conformationala a acesteia (flip – flop, ping
– pong, situsuri succesive de legare), și eliberarea substantei transportate pe cealalta fața a
membranei. Dupa numarul de specii moleculare transferate pentru un ciclu transportor, exista
unitransport și cotransport. Acesta din urma se numeste sinport daca transferul este in acelasi sens și
antiport daca sensul transferului este opus. Transportul activ se realizeaza evident numai de catre
transportori proteici și poate fi primar sau secundar, dupa cum proteina transportoare prezinta sau nu
activitate ATP-azica proprie.

              Transportul activ secundar este intotdeauna cotransport, una din substante fiind
transportata activ pe baza gradientului pentru o alta. Consumul de energie este indirect, realizandu-se
la nivelul unui transportor activ primar ce mentine gradientul mentionat, necesar pentru functionarea
celui secundar.

Stimulii fizici din mediu determina la nivel plasmalemal modificari de conductanta ionica, cu
variatii consecutive ale potentialului electric transmembranar.

 Daca depolarizarea atinge pragul pentru deschiderea unor anume populații de canale ionice
voltaj – dependente se declanseaza potentialul de actiune (PA), ce se propaga in toata membrana.

              Stimulii chimici sunt reprezentati de diverse substante din spatiul extracelular, cu actiune
mai mult sau mai putin specifica. Exista substante bioactive care trec prin membrana și se leaga de
proteine receptor din citosol, complexul rezultat actionand ulterior la nivel plasmalemal, asupra
fluiditatii membranare. Complexul agonist-receptor realizeaza mai departe transmiterea semnalului pe
diverse cai. Unii receptori au in structura lor sau sub controlul direct, canale ionice numite receptor –
operate.

              Aceasta categorie de canale include si pe cele controlate indirect, prin intermediul proteinelor
G sau mesageri secunzi.

              Desfasurarea reactiilor anabolice și a altor procese celulare consumatoare de energie

necesita disponibilitatea acesteia intr-o forma direct utilizabila, ușor controlabila și in cantitate
suficienta. Aceste criterii sunt indeplinite de energia chimica din asa-numitele legaturi fosfat
macroergice (esterice fosfat-fosfat sau fosfat-substrat), din diversi compusi cum sunt creatin-fosfatul
și nucleotidele, dar cel mai important compus din aceasta clasa este de departe adenozin – trifosfatul
(ATP). Reactiile chimice ce se desfașoara cu consum de energie metabolica (sub forma principala de
ATP) sunt catalizate direct de enzime cu activitate ATP-azica sau cuplate indirect cu hidroliza ATP, care
furnizeaza astfel energia necesara.

              Sinteza ATP se realizeaza prin anumite reactii din catabolismul nutrimentelor, cuplate cu
fosforilarea ADP, care poate necesita sau nu prezența oxigenului. De aici distinctia aerob/ anaerob sau
fosforilare de substrat / oxidative. Cea  mai mare parte a productiei de ATP se realizeaza la nivel
mitocondrial, dar contributia acestui proces difera in functie de tipul celular (de fapt depinde mai ales
de numarul mitocondriilor și incarcarea lor enzimatica), precum și in functie de statusul metabolic și
de oxigenare al celulei.

             

              In prezenta lucrare se face referire la anumite clase și tipuri de transportori membranari,
avand in vedere structura lor 3D, rolul lor specializat ca liganzi de  ATP, necesar metabolismului atat la
om cat și la organisme inferioare de tip experimental.

              Se va urmari deasemeni și rolul lor la nivel  molecular și genetic cu implicatii in studii

medicale și aplicatii in diverse alte ramuri experimentale (microbiologie, imunobiologie, biochimie).

CAP.1 SUPRAFAMILIA TRANSPORTORILOR ABC DIN GRUPELE DE LIGANZI AI ATP-

ULUI

Transportul specific al moleculelor prin membranele cu bistrat fosfolipidic reprezinta o functie

esentiala a tuturor organismelor vii, si un numar  variat de transportori specifici au evoluat in vederea
indeplinirii acestei functii.

Cea mai mare familie de gene transportoare este cea a suprafamiliei de transportori ABC,
specializati in legarea ATP-ului.
 Aceste proteine strabat o larga  varietate de substraturi, implicate fiind in fluxul de
polizaharide, aminoacizi, ioni de metale, peptide si proteine, precum si un numar mare de componente
hidrofobe si metaboliti, extra- si intracelular.

Genele ABC sunt esentiale in numeroase procese intracelulare, iar mutatiile ce pot interveni la
nivelul lor cauzeaza, sau sunt implicate, in nenumarate anomalii genetice umane incluzand fibroza
chistica, boli neurologice, anemie, diverse reactii la administrarea de medicamente.

Secventierea si caracterizarea genomului la eucariote a permis identificarea completa a tuturor

genelor ABC  in genomurile de la Saccharomyces cerevisae, Drosophila sp.  si C. elegans.  S-au
identificat 48 de gene ABC la om, au fost ulterior divizate in 7 subclase distincte in functie de
organizarea domeniilor si omologia aminacizilor. Multe dintre genele ABC au rolul de a mentine un
echilibru lipidic in transportul acizilor grasi, a sterolilor in organism, in acest scop se fac cercetari
asupra genelor ABC, din genomul uman, in ce priveste stabilirea unui rol precis in mostenirea,
transmiterea ereditara a bolilor, si in intelegerea topologiei acestor gene la nivel membranar.

Proteinele ABC-liganzi ai ATP-ului, folosesc energia in vederea transportului diverselor

molecule atat la nivelul membranei plasmatice, cat si la nivelul membranelor intracelulare ale
reticulului endoplasmic (RE), peroxizomilor si mitocondriilor.

Structura principala de la care se pleaca in diferentierea subclaselor de transpotori ABC este

reprezentata de 2 domenii de legatura a ATP-ului, NBF (nucleotide binding folds), domenii de
nucleotide cu structuri de legatura, si 2 domenii transmembranare (TM), continand 6 membrane
condensate, α – helicate.

                TMsFig.1. Structura Transportor

                               Nucleotidele (NBF) contin 3 domenii de conservare: domeniile Walker A si Walker

B, intalnite in toate proteinele – leganzi de ATP, si o semnatura: motivul C, localizat deasupra
domeniului Walker B.

Domeniul C este specific transportorilor ABC si ii distinge de alte proteine de legatura a ATP-
ului.

Prototipul proteinei ABC contine deci 2 domenii NBF si 2 domenii TM, cu nucleotidele localizate
in citoplasma. Componentele hidrofobice sunt scoase din citoplasma dinspre patura interna a
membranei catre cea externa sau catre un acceptor de molecule.
  Genele ABC sunt profilate, fiind specializate cu functie de transportor deplin cu ambele tipuri
de domenii (2 NBF si 2 TM), sau sunt doar cu cate un domeniu din fiecare (1 NBF si 1 TM),
functionand doar cu jumatate din componente. Jumatatile de transportori sunt asamblati fie ca
homodimeri, fie ca heterodimeri pentru a forma un transportor functional. Genele care codifica
transportorii ABC, sunt dispersate in genom si arata un grad ridicat de secvente de aminoacizi
identificat la eucariote.

Analize filogenetice au permis ca suprafamilia de gene ABC sa fie impartita in 7 subfamilii, iar
6 dintre ele sunt intalnite atat in genomul mamiferelor cat si al Saccharomyces cerevisae.

Fig.2 Structura in spațiu a unui transportor ABC

1.1.  SUBCLASELE DE GENE ABC – Clasificare si generalitati

1.1.1 SUBCLASA ABCA (ABC1)

                   Subclasa ABCA este reprezentata de gene „portar” alcatuita din 12 transportori cu functie
deplina, separati in 2 subgrupe. Prima subgrupa cuprinde ABCA1-A4, A7, A12, A13, , include 7 gene
cu situsuri pe 6 cromozomi, iar a doua subgrupa, genele ABCA5-A6, A8-A10 organizate intr-o retea
cap-coada pe cromozomul 17q24.

                   In ce priveste expresivitatea pattern- ului  cromozomului 17, este reprimata

activitatea  ABCA5, iar ABCA10 exprimata in musculatura scheletica,  ABCA9  in inima, ABCA8 in ovar,
iar ABCA6 in ficat. Exista ipoteza ca aceste componente ale retelei de gene de pe cromozomul 17 ar fi
de fapt un grup distinct, fiind diferite dupa numarul intronilor, de 38 pe cromozomul 17   si de 50-51 la
restul genelor, dar primele nu se exprima, de exemplu la Drosophila  sp. sau Caenorhabditis elegans,
ci doar la soarece si om, fapt ce dovedeste aparitia lor dupa separarea vertebratelor de regnurile
inferioare.

                    Gena ABCA1 este implicata in controlul fluxului de colesterol, in boala numita Tanger,
prin membrana (PL – fosfolipidica), catre acceptorii plasmatici specifici, apolipoproteinele.

                    Expresia ei este indusa de steroli si de receptori nucleari hormonali, receptori oxisteroli

si receptori ai acizilor biliari, precum si heterodimer cu receptorii retinoizi.  Asigura deasemeni
homeostazia in continutul lipidic al membranei cu influente dramatice in plasticitatea si fluiditatea
membranei in sine, afectand mobilitatea laterala a  proteinelor de membrana precum si asocierea lor
cu domenii membranare cu structura lipidica specializata.  Gena ABCA4 s-a demonstrat ca fiind
exprimata in fotoreceptori si implicata direct in Sindromul Stargardt, un sindrom degenerativ recesiv
in copilarie, precum si in distrofii ale celulelor cu con fotoreceptoare, in degenerarea simtului vizual la
pacientii in varsta de peste 60 de ani, prin acumularea componentilor cu pigment retinoid,
asemanatoare cu boala Stargardt.

                   Gena ABCA5 este exprimata in pancreas, muschi, si testicule, insa nu se cunoaste inca
nici substratul si nici functia propriu-zisa a acestei gene.

                   Gena ABCA2 este exprimata in oligodendrocite din creier si de asemenea poate functiona
ca pompa de eflux pentru medicamentele tumorii ovariene; gena ABCA7 este exprimata in splina si
timus. Functionarea acestor gene, precum si a ABCA12 si ABCA13, nu este cunoscuta, desi se
presupune ca ar participa in homeostazia lipidelor celulare in diverse medii. 

                   1.1.2 SUBCLASA ABCB (MDR / TAP)

                   Subfamilia ABCB este alcatuita din 4 transportori cu functie deplina si alti 7 cu jumatate
de structura, constituind singura familie cu ambele tipuri de transportori.

                   Gena ABCB1 (MDR/PGY1) a fost descoperita ca o proteina supraexprimata in linii celulare

tumorale rezistente la medicamente. Celulele care prezinta aceasta proteina, arata o reactie de
rezistenta la administrarea de medicamente, manifestand rezistenta in transportul unei largi varietati
de componente hidrofobe de genul colchicinei, doxorubicinei, adriamicin, vinblastine, digoxin,
saquinivir, si paclitaxel.

                   Gena este exprimata in primul rand in ficat si in bariera sangvina cerebrala, si se

presupune ca este implicata in protectia celulelor de agenti toxici.

                   Secretia colesterolului, fosfolipidelor si a altor componente in bila, este critica pentru

functionarea normala a bilei, incluzand si excretia colesterolului si a altor steroli, precum si absorbtia
vitaminelor. Proteinele ABCB4 si B11 sunt amandoua localizate in ficat si participa la secretia de
fosfatil-colina si saruri biliare. Mutatii la nivelul acestor proteine, respectiv gene, duc la numeroase
forme de blocaj intrahepatic, autosomale, caracterizate prin blocaj si mai apoi colaps hepatic, acest
fapt reprezentand cauza principala a transplantului de ficat la pacienti copii.

                   Mutatii ale ABCB4 sunt responsabile si de blocajul la nivel hepatic in cazul sarcinii.

                   Procesul de recunoastere al antigenului din clasa 1 de histocompatibilitate genica implica

digestia celulara a proteinelor straine in peptide scurte, transportate apoi in RE unde formeaza
complexe cu clasa I de proteine exprimandu-se pe suprafata membranei celulare.

                   Genele ABCB2 si ABCB3 (TAP) sunt jumatati de transportori ce formeaza un heterodimer

pentru transportul acestor peptide in RE. Familii destul de rare cu mutatii ale acestor gene, prezinta
imunitate supresoare, lipsindu-le capacitatea de desfasurare a procesului de recunoastere
imunologica.

                   Jumatatile de transportori ramasi din familia ABCB se exprima in lizozomi (ABCB9), in

mitocondrii (ABCB6, B7, B8, si B10). Una dintre aceste gene (ABCB7) este localizata in cromozomul X,
iar mutatiile de la nivelul genei sunt responsabile de anemie sideroblastica si ataxie (XLSA/A). Gena
de la om ABCB9 poate suplini gena ortoloaga de la drojdie ABCB7, Atm1. Aceasta gena detine rolul de
a mentine homeostazia ionilor de metale si a proteinelor citosolice Fe/S in mitocondrii. 
                   1.1.3 SUBCLASA TRANSPORTORILOR ABCC ( CFTR)/(MRP)

CFTR= Cystic Fibrosis TM conductance Regulator (reglator transmembranar implicat in

conductanta fibrozei chistice)

MRP= Multidrug Resistance Protein (proteina rezistenta la administrarea medicamentelor)

                   Subfamilia transportorilor ABCC este reprezentata de 12 transportori completi, ce

indeplinesc functie de transport al ionilor, secretiilor toxice si in traducerea semnalului.

                   Fibroza chistica, supranumita si mucoviscidoza, este o anomalie ereditara caracterizata

prin disfunctii la nivelul fiziologiei glandelor cu secretie exocrina, fapt ce coincide cu pierderea functiei
transportorului CFTR.

                   Aceasta proteina este unica, in cadrul clasei de proteine ABC, deoarece contine un canal
reglator al fluxului de Cl (AMP). Boala este intalnita la populatiile caucaziene mult mai rar decat in
cadrul celorlalte rase umane. Pacientii cu 2 alele CFTR nefunctionale, dezvolta secretii neadecvate de
enzime pancreatice ducand la deficiente de ordin nutritional, infectii bacteriene manifestate la nivelul
plamanilor si obturarea vaselor deferente provocand sterilitate la barbati. In functie de prezenta sau
absenta alelelor CFTR, anomalii pot aparea sau nu, sau intr-un grad variat de infectiozitate.

         Fig. 3 Alcatuirea proteinei CFTR.     

                   Gena ABCC8 a fost identificata ca fiind locusul specific familiei persistente a hipoglicemiei
hiperinsulinice prezenta in stadiul infantil, o anomalie recesiva autosomala caracterizata prin secretia
neregulata a insulinei. Cercetari ulterioare au constatat ca gena ABCC8 este un receptor cu afinitate
mare pentru medicamentele de gen sulfonylurea.

                   Acest medicament este folosit pentru cresterea nivelului de secretie a insulinei la

pacientii cu diabet nondependenti de insulina injectabila. Medicamentul se leaga de proteina ABCC8 si
de cea apropiata ei ABCC9, cu reactia de inhibare a canalului de potasiu  KIR6. Un polimorfism al
genei ABCC8 a fost asociat cu raspunsul insulinic la pacientii din Mexic, si un raspuns al diabetului de
tip II, la pacientii francezi canadieni, dar nu s-a exprimat sub nici o forma la „cohortele” scandinavice.

                   Celelalte gene ABC sunt 9 gene legate, de rezistenta la administrarea de medicamente.

                   ABCC1, a fost identificat ca fiind o gena cu rezistenta la medicamente si s-a demonstrat

ca transporta conjugate glutationice a unor componente toxice. ABCC2 si C3, deasemeni transportori
de conjugate glutationice, precum si a unor anioni organici.

                   Asemanator cu ABCB1, transportorul ABCC1 confera rezistenta unei intregi varietati de

substraturi toxice, dar nu are vreo implicatie in crestere si dezvoltare, desi poate transporta
leukotriene C4, un factor chemotactic ce controleaza migratia celulelor dendritice din tesuturile
periferice in ganglionii limfatici.

                   ABCC2 este prezent in hepatocite , implicat in sindromul Dubin – Johnson, mediind

transportul de anioni organici.

                   ABCC6 este implicata in pseudoxanthoma elasticum, mutatii la nivelul acestei gene sunt
responsabile pentru disfunctii la nivelul conectivelor tisulare, boala manifestandu-se prin depozitarea
Ca in fibrele de elastina, rezultand hemoragii arteriale, sangerari la nivelul tractului gastrointestinal si
la nivelul retinei. Gena este exprimata in rinichi si ficat, iar la nivelul acestora se pare ca
pseudoxanthoma elasticum  nu poate fi localizata, ceea ce ar sugera faptul ca aceasta gena nu are
implicatii directe in boala respectiva si nici in transportul sau eliminarea metabolitilor toxici la care au
sensibilitate conectivele tisulare.

                   Proteinele ABCC4, C5, C11, sunt mai mici decat celelalte gene MRP – uri si leaga un
domeniu N-terminal, neimplicat in functia de transport.

          Genele ABCC4 si C5 confera rezistenta catorva nucleotide incluzand 9-(2-fosfonil-metoxietil),

adenina si analogi ai purinei, si poate fi implicata si in secretia de GMP.

                   1.1.4 SUBCLASA TRANSPORTORILOR ABCD – SUBFAMILIA

ADRENOLEUKODISTROFIEI (ALD)

Aceasta subfamilie contine 4 gene ce codifica jumatati de transportori exprimati

exclusiv  in peroxizomi.

                   Una dintre gene, ABCD1, este responsabila pentru forma X-linkata a ALD
(adrenoleukodistrofiei), o anomalie caracterizata prin deficiente neurodegenerative si adrenale,
tipologie initiata in copilaria tarzie.

        
Fig.4. Localizarea citogenetica a genei ABCD1 pe cromozomul Xq28 , pe bratul lung

                                      ALD este prezentata in asociere cu adrenomieloneuropatia, forma infantila a

ALD –ului precum si un set de forme adulte. In orice caz se pare ca nu exista o corelatie clara intre
fenotipul ALD-ului si genotipul locusului genei ABCD1.

                   Celulele de la pacientii cu ALD, sunt caracterizate printr-o acumulare de acizi grasi

saturati neramificati, iar rolul exact al genei ABCD1 inca nu a fost elucidat in acest proces.

                   Functiile celorlalte familii de gene ABCD la fel au fost incomplet descoperite, dar
similaritatile dintre secventele markate au sugerat implicarea lor in metabolismul acizilor grasi.

                   Genele  ABCD sunt subjugate complexului reglator de la nivel transcriptional, fiind strans

legat de celulele lipidice din metabolism, nu este surprinzator faptul ca impart cu subclasele ABCA si
ABCG senzitivitatea receptorului de proliferare a peroxizomilor si a familiei receptorilor nucleari,
specifica receptorului X retinoid.

                   1.1.5 SUBCLASA TRANSPORTORILOR ABCE – PROTEINA- LIGAND DE

OLIGOADENILAT (OABP)  SI ABCF (GCN20 – PROTEINE ABC NEMEMBRANARE)

                   Subfamiliile transportorilor ABCE si ABCF sunt alcatuite din gene ce prezinta domenii de
legare a ATP, strans legate de cele ale celorlalti transportori ABC, dar aceste gene nu codifica domenii
transmembranare (TM).

                   Familia ABCE cuprinde un singur membru, OABP, ABCE1.

                   Aceasta proteina indeplineste functia de a recunoaste oligoadenilatul produs in urma

infectiilor virale.

                   Genele ABCF au fiecare cate o pereche de domenii NBF, si cel mai bine caracterizat
membru al acestei familii este gena GCN20 de la S.  cerevisae.  GCN20 este implicata in activitatea
eIF-2 alpha kinazei. Un omolog uman, ABCF1 face parte din complexul ribozomal si poate indeplini
acelasi rol.

                   1.1.6 SUBCLASA TRANSPORTORILOR ABCG (WHITE) CU STRUCTURA

INJUMATATITA

                   Subfamilia transportorilor ABCG contine 6 jumatati de transportori ce au un domeniu NBF

la capatul amino-terminal si un singur domeniu TM la capatul carboxi-terminal: orientare
opusa  celorlalte gene ABC.  La Drosophila,locusul pentru gena White a fost prima gena cartata.
Proteina „white” formeaza un heterodimer cu alte 2 proteine ABCG inrudite: „brown” si „scarlet”,
pentru transportul guaninei si triptofanului in celulele ochiului musculitei. Aceste molecule sunt
precursorii pigmentilor ce dau culoarea ochilor la Drosophila.

                   Surprinzator exista doar 5 gene ABCG in genomul uman, spre deosebire de cele 15 la
Drosophila si 10 la drojdii.

                   ABCG1 este exprimata in macrofage si indusa de colesterol.

                   ABCG4 detine o expresivitate mare in creier.  Ar fi interesant de urmarit daca aceste

gene interactioneaza sau sunt inrudite cu ceva in functiile indeplinite.
                   Genele ABCG5 si ABCG8 sunt localizate cap-la-cap pe cromozomul uman 2p15-p16,
separate de o grupare de 200 bp. Aceste gene sunt mutate in aceeasi familie cu sitosterolemia, o
anomalie caracterizata prin transportul deficient al sterolilor si colesterolului din plante si peste.
Pacientii cu sitosterolemie dezvolta deficiente de secretie a sterolilor la nivel intestinal si hepatic.
Aceasta dovada genetica indica faptul ca cele doua jumatati de transportori formeaza un heterodimer
functional, dovada sustinuta de faptul ca cele doua gene sunt coordonate regulat de colesterol.

  Fig. 5. Identificarea unei gene ABCG5, implicata in

reglarea absorbtiei colesterolului, structura sterolica si pozitionarea mutatiilor prin punctuatia neagra
si a codonilor stop (cruciulite). 

                   Gena ABCG5 sufera mutatii indeosebi la populatia asiatica, iar cea ABCG8 la caucazieni.
Acest lucru sugereaza faptul ca aceste proteine pot forma atat heterodimeri cat si homodimeri pentru
a transporta o varietate de steroli (compesterol, stigmasterol, avenosterol, sitosterol, colesterol)
intalniti in digestie. Gena de la mamifere ABCG1 este deasemeni indusa de colesterol si implicata in
reglarea transportului de colesterol.

                   Gena ABCG2,  un transportor rezistent la actiunea medicamentelor, poate folosi

medicamente de gen anthraciclina in tratamentul anticancer, la fel si topotecan, mitoxantrone sau
doxorubicin ca substraturi.  Aceasta gena este amplificata sau rearanjata de translocatii cromozomale
in liniile celulare de rezistenta.

                  

Fig. 6. Structura 2D a unei gene ABCG

dupa secventierea primara a amino
acizilor si analiza hidropatica
 

                   Gena are expresivitate

mare intr-o subpopulatie de celule
stem hematopoietice, in celulele
sincitiotrofoblaste, sugerand faptul
ca pot fi pompe pentru fluxul de
metaboliti toxici de la proviziile
sangvine fetale la cele materne.
                   Gena ABCG3 a fost intalnita in studiu genetic doar la soarece si in alte genomuri de
rozatoare. Gena are expresivitate in splina si timus si detine un domeniu de legare a ATP-ului caruia ii
lipsesc cateva reziduuri conservate in domeniile Walker A si de Semnal.            

                    

                   1.2 STRUCTURA TRANSPORTORULUI BtuCD DIN SUPRAFAMILIA

TRANSPORTORILOR ABC, CU APLICATIE LA Escherichia  coli 

                                      Mult studiata deja bacterie Escherichia coli, Gram-negativa detine 2 membrane de

protectie (externa si interna), pe care nutrientii trebuie sa o traverseze pentru a ajunge la citoplasma
si pentru a hrani celula. Nutrienti mici sunt difuzati prin membrana externain periplasma prin porii de
apa filtranti ai proteinelor numite porine; in acelasi timp, transportorii activi ai membranei externe
preiau nutrientii prea mari pentru a se strecura prin porine. Odata aflati in periplasma, transportorii
specifici substratului, localizati in membrana interna, muta nutrientii in citoplasma.

                   O clasa de astfel de transportori ai membranei interne, cunoscuti sub denumirea de

transportori periplasmici de legare a proteinelor, apartin casetei ABC de transportori - leganzi ai ATP-
ului, suprafamilie ce cupleaza ATP-ul hidrolizat transportului activ.

                   Acesti transportori- proteina ABC, sunt activi la toate speciile, de la bacterie la om,
mediind atat fluxul cat si efluxul diverselor elemente de compozitie celulara.

                   O paleta de boli umane, cum ar fi fibroza chistica, au fost detectate ca mutatii la nivelul
genelor codificatoare a transportorilor ABC. Analiza structurala a transportorului BtuCD,
de la Escherichia  coli,  a demonstrat responsabilitatea acestuia de a transporta vitamina B12 in
citoplasma acestei bacterii.

                   Structura transportorului de vitamina B12  reprezinta

o structura dubla,  „completa” a unui transportor tipic ABC, constand in 2 domenii ce traverseaza
membrana sau subunitatile BtuC si 2 casete BtuD, leganzi ai ATP – ului.   Prima structura completa,
descrisa fost cea a MsbA, o proteina implicata in transportul lipidului A prin membrana interna a E.
coli  de pe partea de sinteza in citoplasma spre destinatia sa finala in membrana externa.

                   O analiza atenta la nivelul acestor 2 transportori demonstreaza diferente evidente: MsbA
contine 6 panglici α-helicate in regiunile transmembranare, in timp ce fiecare subunitate BtuCD
contine 10 helice transmembranare ce se impacheteaza intr-un model ce traverseaza prin diferite
unghiuri, avand un factor care antreneaza deplierea inainte de a ajunge pe partea opusa a
membranei.
                   Structura BtuCD  dezvaluie un canal de transfer  pozitionat intre subunitati suficient de
larg pentru patrunderea vitaminei B12. Canalul este inchis automat la suprafata citoplasmatica de
doua bucle citoplasmatice ce conecteaza α-helicele transmembranare.

                   Transportorii ABC ce muta nutrientii cu greutati moleculare mici prin membrana sunt
construiti special cu doar 10 sau 14 helice transmembranare, 12 reprezentand numarul canonic.
Acesta constatare arata faptul ca cele 20 de helice vazute la BtuCD sunt folosite pentru stabilizarea
unui canal central mai mare.

                   Suprafata de contact dintre caseta si regiunea transmembranara este asemanatoare la

MsbA si BtuCD. Hidroliza ATP-ului de catre transportorii ABC este inalt coordonata, dar cum cele doua
casete de legatura ABC interactioneaza, ramane un mister.

                   In prima subunitate a casetei

legand a ATP-ului, numita HisP, o subunitate
de permeaza histidinica de natura
bacteriana, cu situsuri de legare a
nucleotidelor, definite prin motivele Walker A
si B, rasucite fata de interfata dimerului
HisP.   

                   Ca o consecinta a acestei

rasuciri, legatura ATP-ului cu HisP este
expusa la suprafata, in contrast cu alte ATP-
aze unde ATP-ul este ingropat intr-un
buzunar.

                   Modelul propus de
cercetatori,ca amprenta (motiv de
semnatura) , Leu – Ser- Gly- Gly- Gln
(LSGGQ), specific transportorilor ABC,
fiecarei casete si subunitati, este un model opus altor casete de transportori cu legare de ATP.

                   In ce priveste acest motiv, BtuCD se aseamana structural cu Rad50 implicat in reglajul
ADN, si mai putin cu MsbA, iar activarea hidrolizei ATP-ului  poate fi asociata cu miscarea acestui
motiv LSGGQ ce intra in contact cu fosfatii ATP-lui.

                  
Fig.9. Model ce arata cum hidoliza ATP-ului, in casetele ATP, provoaca schimbari conformationale in
domeniile transmembranare asigurand transportul vitaminei B12 in citoplasma.

Sunt eliberati ADP si Pi (fosfat anorganic), in acest proces fiind nevoie de retragerea motivului
LSGGQ. Deoarece cele 2 casete de legare a ATP-ului sunt in stransa legatura cu cele 2 subunitati
transmembranare, poate fi imaginat faptul ca miscarea celor 2 casete una catre alta, ca raspuns la
legarea si hidrolizarea ATP-ului, s-ar putea traduce prin miscari de deschidere a portii dintre cele 2
subunitati transmembranare, permitand astfel vitaminei B12 sa intre in citoplasma prin canalul
central.

Ce previne iesirea vit.B12 inapoi in periplasma? S-a demonstrat ca proteina de legatura

periplasmica, maltoza, este cuplata pentru transportul acesteia in hidroliza ATP-ului.

A extrage un fragment din sistemul de transport al maltozei, interactiunile stranse de legare in

sistemul Btu ce se asteapta sa se dezvolte in timpul hidrolizei ATP-ului (intre proteina-ligand BtuF si
subunitatile BtuC, si intre subunitatile BtuD si moleculele ATP de pe interfata dimerului (Fig.9), pot
reduce afinitatea de legare a proteinei fata de vitamina B12 la deschiderea portii catre citoplasma.

Aceste schimbari simultane vor permite vit. B12 sa se disocieze si sa intre in citoplasma,
exceptand periplasma, care se afla temporar in blocaj datorita prezentei fizice a proteinei BtuF in
complexul transportor.

In concluzie, diversitatea structurala a regiunilor transmembranare, demonstrate in analize ale

structurii complete a transportorilor ABC, fiecare croit, specializat, pentru indeplinirea unei sarcini bine
determinate, subliniaza importanta experimentelor induse la nivelul acestor transportori ABC in
vederea obtinerii unei intelegeri depline a antrenarii hidrolizei ATP-ului pentru   participarea in diverse
procese.

1.3 STRUCTURI MsbA DE Escherichia coli SI Vibro cholera – OMOLOGI AI

TRANSPORTORILOR ABC CU REZISTENTA LA MEDICAMENTE

Rezistentala medicamente (MDR) este o problema medicala dezbatuta si reprezinta un

obstacol major in tratamentul unor boli si in dezvoltarea unor terapii eficiente. In tratamentul
cancerului, de exemplu, MDR a restrans eficienta chemoterapiei, rezultand o mai mare rata a
mortalitatii in randul pacientilor bolnavi de cancer.
 MDR poate creste prin efluxul unor molecule de medicamente la interventia transportorilor
localizati in membrana celulara. Unii dintre acestia, cum ar fi P-glicoproteina, poate transporta diverse
clase de molecule de medicamente amfipatice si de lipide.

Comparatia structurala dintre VC-MsbA si MsbA de la Escherichia coli, arata faptul ca acesti

transportori au in comun un ansamblu condensat de α – helice transmembranare, dar difera in
orientarea relativa a domeniilor lor de legare a nucleotidelor NBD.

Domeniul transmembranar al VC-MsbA este capturat intr-o conformatie inchisa iar structura
suporta un model de „atac de forta” al dinamicii transportorului unde NBD-urile opuse se suprapun
situsurilor de legare a ATP.

MbsA apartine unei vaste superfamilii de proteine caracterizate printr-o inalta putere de legare
a adenozintriphosphatului (ATP), aceea a casetei de transportori ABC.

MsbA transporta lipidul A, un component major al membranei externe bacteriene, fiind

singurul transportor ABC esential pentru viabilitatea celulei, transformand-o intr-o tinta cu potential
antibiotic.

Studii in-vitro au demonstrat ca MsbA este o ATPaza stimulata specific de catre lipidul A.
Mutatii la nivelul transportului au derivat in acumulari letale de lipid A in membrana interna a celulei.

VC-MsbA detine 68% din identitatea secventelor prezente la Eco-MsbA, sugerand faptul ca
ambele functioneaza dupa un mecanism comun.

In urma cristalografierii cu raze X, la o rezolutie de 3.8 Å, VC-MsbA are o conformatie de

dimer reprezentat prin fuziunea domeniului transmembranar cu un domeniu NBD, si la fel ca si la Eco-
MsbA prezinta si un al 3-lea domeniu intercelular (ICD).  Spre deosebire de Eco-MsbA, α-helicele
transmembranare sunt mai putin condensate si orientate cu 10- 30˚ fata de suprafata normala a
membranei.

B
 
C
 
A
 

Fig.1
1. (A)  Vizualizarea camerei de deschidere a dimerului MsbA, cu toate domeniile, (B) vizualizare din
mediul extracelular membranar, buclele implicate in deplasarea lipidului A (E.coli).(C) imaginea stereo
a modelului omolog  P-gp generat in baza structurii VC-MsbA.

http://www.biochemj.org/bj/376/0313/3760313.pdf
/http://molpharm.aspetjournals.org/cgi/content/full/67/2/365/FIG5
 TM
 

NBD
 

Fig. 12. A. Structura scheletica a MsbA la E.coli si V. cholera. B. Model de transport lipidic via MsbA 1.
proteina in conformatie deschisa, 2. recunoasterea substratului induce legarea nucleotidelor cu flipaza
spre partea opusa(conformatie inchisa), 3. hidroliza ATP-ului deschide TMD spre partea opusa si
elibereaza substratul, 4. ADP si Pi disociati restabilesc proteina in starea initiala.

Transportorii MDR-ABC sunt unici prin faptul ca extrag lipide sau molecule de medicamente
direct din membrana celulara si fie le rasucesc prin flipaza pe celalalt strat, fie le expulzeaza in mediul
extracelular.

Pentru indeplinirea acestei functii, MsbA trebuie sa recunoasca in prima faza o molecula de
lipid A, urmand extragerea din membrana intr-un micromediu ce favorizeaza mutarea acestuia pe
cealalta suprafata. „Camera flipazei „ formata la nivelul dimerului Eco-MsbA este regasita inca odata si
la nivelul structurii VC-MsbA, ca o confirmare a apartenentei acestui component in arhitectura tipica a
MsbA.
 In contrast cu structura de „conformatie deschisa” a Eco-MsbA,  NBD-urile de la VC-MsbA au o
rotatie considerabila desi impart acelasi punct de contact cu TMD-urile.

Un contact analog este observat la importorul vitaminei B12 si poate reprezenta o

caracteristica comuna a transportorilor ABC.

Structurile de VC-MsbA  si de Eco-MsbA demonstreaza ca NBDurile pot forma un spatiu larg

conformational in lipsa nucleotidei, asemanat in studiu cu proteina P-gp umana, arata ca subunitatea
TM6, care este practic unita cu NBD, are o miscare de rotire in timpul ciclului catalitic.

Structura VC-MsbA evidentiaza o alta viziune asupra exporterului ABC si mai departe
subliniaza ideea ca transportorii MDR-ABC sunt  masini moleculare ce scaneaza stratul intern al
membranei de substraturi, le accepta lateral intr-o incapere, si le scoate prin flipaza pe suprafata
externa a membranei sau pe „mileul” extracelular. Este o noua viziune in starea de inchidere descrisa
initial si vine cu o baza structurala pentru mecanismul asociat cu lipid/medicament de „flip-flop”.

Impreuna, structurile VC-MsbA si Eco-MsbA pot contribui la elucidarea bazei structural-

moleculare a transportului de medicamente de catre transportorii MDR-ABC, ce pot avea un impact
foarte important in dezvoltarea unor terapii folosite in tratarea cancerului si a bolilor infectioase.

1.4 STRUCTURA SI MECANISMUL DE TRANSPORT AL GLYCEROL-3-PHOSPHAT-ULUI

(Esherichia coli) - GlpT

          Superfamilia majora a facilitorilor reprezinta cel mai complex grup de transportori secundari ai
membranei celulare. GlpT, prezentat in acest subcapitol, faciliteaza transportul glicerol – 3- fosfatului
in citoplasma si a fosfatului anorganic in periplasma.

          Jumatatile amino si carboxi-terminale ale proteinei emit o pseudo bisimetrie.

          Cele 2 arginine prezente la nivelul porului central aflat in preajma periplasmei, comprima
situsul de legare la substrat.

          Se presupune ca GlpT opereaza cu un singur situs de legare, alternand mecanismul de

acces  printr-o rotatie de tip rocker-switch.

          Transportul membranar in celula este un proces biologic fundamental mediat de diverse

proteine de transport. Un tip foarte important de astfel de proteine sunt transportorii activi de
membrana, ce folosesc un gradient solubil pentru conducerea translocatiei in alte substraturi.

          Cei 1000 de membri ai suprafamiliei de transportori facilitanti, transporta ioni, zaharide,

medicamente, neurotransmitatori, nucleotide, aminoacizi, peptide si alte solutii hidrofile.

          Membrii acestei superfamilii sunt prezenti la nivelul celor 3 regnuri de organisme vii, si multi au
relevanta medicala sau farmacologica.

           La bacterii, aceste proteine functioneaza in principiu pentru preluarea nutrientilor, dar unele se
comporta ca pompe de eflux ce confera rezistenta la antibiotice.

          La E.coli, G3p serveste ca sursa de energie si de carbon, si ca precursor al biosintezei de

fosfolipide. GlpT este un sistem antiport de fosfat organic/ fosfat anorganic (P i ), cu rol in preluarea de
G3p, condus de gradientul P i . In sisteme reconstituite, acest transportor poate constitui mediator de
schimb Pi /Pi.
          GlpT se leaga la substrat in solutii de solvent, iar in urma reconstituirii sub forma de
proteolipozomi, mediaza G3P in schimbul de Pi .  

          Proteina este inrudita cu transportorul hexoza-6-fosfat (UhpT).

          Structura analizata in urma cristalografierii cu raze X, la o rezolutie de 3.3 Ǻ, sugereaza un

mecanism de translocatie la nivel de subtrat.

          Transportorul este alcatuit din 12 α-helice transmembranare cu densitati ce amintesc de cele

ale unor lanturi aromatice. Molecula de GlpT are forma unui templu Mayan, cu etaj si parter, ambele
rectangulare. Poate fi divizat in 2 domenii asemanatoare astfel incat jumatatea cu capat N-terminal sa
fie legata de cea cu capat C-terminal printr-o portiune pseudo bisimetrica perpendiculara pe un
plan.                          

                                                                                    
 

Fig.13. Structura 3D a moleculei de GlpT – transportoare de Glicerol- 3-Fosfat (G3P)/          

          O analiza de-a lungul membranei, arata aceasta portiune pseudo bisimetrica extinsa la nivelul
tuturor helicelor,  H1-H12, si la nivelul celor doua bucle (L1-L2,  L11-L12), cu legarea H1-H7, H2-H8 si
tot asa.

          Interfata domeniului este aproximativ perpendiculara pe axa lunga a moleculei, unde se afla
atat resturi proteice polare cat si apolare. Privind din interiorul suprafetei plane a membranei, de-a
lungul intefatei domeniului, se poate observa un por inchis pe una din fetele membranei si unul
deschis, pe cealalta fata.

          In functie de lungimea helicelor este indusa pozitia portiunii pliate;  H3, H6, H9, rezultand
faptul ca periplasma este plata, dar coboara pe alocuri. In contrast cateva helice transmembranare se
extind pe suprafata citoplasmatica a membranei.

          In ambele jumatati ale moleculei, helicele formeaza 2 impachetari a cate 3 helice fiecare; H1-
H5-H6 si H2-H3-H4 in domeniul cu capatul N-terminal, si H7-H11-H12 si H8-H9-H10 in domeniul
capatului C-terminal.

                                                                                                                  
Fig.14 . Jumatati simetrice ale proteinei GlpT transportoare de G3P, model structural 3D

          Aceste impachetari sunt inserate in membrana cu orientari opuse.

          Fata de porul central, GlpT,emite 8 helice periferice ce formeaza un zid rectangular, cu functie
de esafod pentru celelalte 4 helice centrale.

          4 dintre helicele centrale, H3 si H6 N-terminale si H9 si H12 in C-terminal, formeaza peretii

limitanti, ce contracta zidul,  in timp ce peretii deschisi ai zidului ce limiteaza aceasta fortareata, sunt
formati din helicele H2 si H11 in fata si H5 si H8 in spate.

          Pentru ca ultimele 4 helice au forma curbata, in forma unei „banane”,  fiecare pereche capata
forma incompleta, cu helicele intrand in contact in membrana dar fiind separate una de cealalta in
citosol.

          Pe partea citosolica a moleculei, cate 2 arginine, reprezentand semnatura proteinelor MFS,
definesc cele 2 capete ale buclelor L2-3 si L8-9, bucla citoplasmatica 10-11 contine 2 lizine.

          Se presupune ca aceste 2 resturi proteice cu sarcina electrostatica pozitiva, au rol in

pozitionarea si orientarea  helicelor transmembranare, la insertia proteinei in membrana, fapt observat
la proteina Glut.

            Mutatii intervenite la nivelul acestei proteine, prin schimbarea Arg de la capatul C-terminal cu
o grupare triptofan,  produce un sindrom deficitar de Glut.

          GlpT purifica in solventi ca un monomer legat la substrat in solutie. Este omolog UhpT de
la E.coli, unde s-a demonstrat ca nu doar purifica dar si functioneaza ca un monomer in membrana.

          Este posibil ca si GlpT sa functioneze tot ca un monomer la nivel membranar, de aceea calea de
translocație prin substrat in respectiva structura este porul central, aflat la interfata domeniilor N-
terminal si C-terminal.

          Deoarece porul se deschide doar la nivel citosolic, GlpT se afla in conformatie inchisa in absenta
substratului. Pe partea cealalta a proteinei se afla o bariera, formata de H1 si H7, spatiul dintre ele
fiind umplut cu 9 lanturi aromatice cu rol in inchiderea porului. Nu se mai formeaza cele 2 centuri
aromatice de la suprafata membranei, spre deosebire de celelalte proteine reziduale.

          Partea interna a porului masoara 10Ǻ cu 8Ǻ, are cateva lanturi laterale de aminoacizi ce
patrund in por. Suprafata electrostatica este incarcata pozitiv, indeosebi in capatul cel mai intern.

          Suprafata interna a „furnalului”, este in mare parte hidrofoba, inafara de extremitatile din
exterior, acest lucru sugerand faptul ca ionii si molecululele de apa nu adera la suprafata „furnalului”.

          Pentru ca legarea la substrat a moleculei GlpT este mediata de gruparea fosfat, are un
comportament dibazic la pH fiziologic, legarea la substrat in ce priveste GlpT se presupune ca s-ar
realiza datorita potentialului electrostatic pozitiv de suprafata.

          Singura arie aflata in centrul porului cu aceasta insusire, se afla la capatul cel mai apropiat
porului, in mijlocul membranei.

          GlpT opereaza cu un singur situs de legare, pe modelul unui mecanism de acces alternativ.
Fig. 15. Miscarea de tip rocker- switch specifica GlpT
 

Pentru ca atomii de O ai legaturii fosfatidice a substratului sa formeze legaturi de H la lungimi optime

(2.9 Ǻ) in acelasi timp cu gruparile guanidinice si argininice, aceste 2 tipuri de lanturi proteice trebuie
sa se miste cam cu 1.4Ǻ mai aproape una de cealalta.

          In concluzie, legarea la substrat se presupune ca avand rol de bariera energetica intre fetele
interna si externa ale conformatiei proteinei transportoare GlpT, facilitand conversia si permitand
gradientului de Pi  sa conduca transportul de glicerol-3-fosfat.                                               

                            

Fig.16. Legarea la substrat, harta electrono-densa

     

CAP.2. STRUCTURA DE BAZA A POMPEI DE EFLUX AcrB CU MULTIPLE CAPACITATI DE

LEGARE A MEDICAMENTELOR.

          Pompele de eflux implicate in transportul medicamentelor sunt responsabile de cauzarea

diverselor probleme aparute in chemoterapia in cancer si in tratamentul infectiilor bacteriene.

          Prin tehnica cristalografierii cu raze X, s-a obtinut o structura trimerica a pompei AcrB de la
Esherichia coli, cu 4 leganzi structurali diferiti.
          Structurile arata ca 3 molecule de liganzi se leaga simultan la o cavitate centrala de aprox.
5000 Ǻ3 , mai intai prin interactiuni hidrofobice, aromatice si prin interactiuni de tip van der Waals.
Fiecare ligand foloseste un set diferit de resturi proteice AcrB pentru legare.

          Moleculele de liganzi deseori interactioneaza una cu cealalta, stabilizand legatura.

          La bacterii, rezistenta la medicamente este deseori asociata cu transportorii de medicamente,

functionand in vederea eliberarii celulei de surplusul de medicamente.

          AcrB-ul E.coli, este un transportor energizat de forta proton-motoare, acest lucru arata

specificitatea stricta fata de subtrat dovedita in randul celor mai cunoscute pompe de eflux al
medicamentelor, recunoscand de la cele mai cunoscute si curent folosite tipuri de antibiotice, pana la
simpli solventi.

          Proprietatile acestei pompe au fost stabilite prin reconstituire, servind ca prototip al

transportorilor bacterieni de medicamente, folosite in studiul mecanismelor de transport cu specific
medicamentelor.

          Structura trimerica de liber-ligand, a fost determinata prin cristalografiere cu raze X in

laboratorul lui Yamaguchi, munca sa deschizand o abordare a detaliilor structurale si de captura a
transportorilor.

          Fiecare ligand se pare ca leaga in situsuri diferite in cavitatea centrala transmembranara a

trimerului, aratand si micile schimbari conformationale in proteina transportor la legarea in substrat.

  Structura liber-ligandului
AcrB arata ca este un homotrimer cu o greutate de aprox.

          Fiecare subunitate este alcatuita din 12 α-helice transmembranare si 3 domenii largi

periplasmice (fiecare de cate 300 de resturi proteice) situate intre helicele α1 si α2, respectiv intre α7
si α8.

          Analizele cu raze X au aratat ca cele 3 domenii periplasmice,  formeaza in centru o structura de

tip „furnal” si un por conector imprejmuit.

          Porul este deschis spre periplasma prin 3 vestibuli situati la interfata subunitatilor.  
          Acesti vestibuli se presupune ca permit accesul direct al medicamentelor prin periplasma,
precum si de pe suprafata externa a membranei citoplasmatice.

          Cele 3 domenii transmembranare ale promotorilor AcrB, formeaza o cavitate centrala cu un

diametru de 30 Ǻ, ce patrunde prin membrana citoplasmatica si se extinde in citoplasma.

          In purificarea tipului salbatic de AcrB, acesta a fost supus cristalizarii in prezenta a 4 agenti
diferiti structural; rodamina 6G (R6G), ethidium (Et), dequalinium (Dq) si ciproflaxacin (Cip).

          La concentratii mai mari de 100 µM, s-a realizat intr-un procent de 50 %, inhibarea reactiei de
excludere fosfolipidica, in urma cristalizarii AcrB.

          Structura cristalizata arata ca acesti liganzi se leaga in diverse locatii in cavitatea centrala,
fiecare folosind un subset diferit de resturi proteice, scazand cu succes rangul de potential al
interactiunilor proteina-medicament.

          Suprafata interna a partii superioare a cavitatii este inconjurata de resturi hidrofobe, incluzand
12 resturi bine conservate de fenilalanina (Phe 386, Phe388, Phe458, Phe459).

          Acesti promotori sunt implicati in legarea medicamentelor sugerand ca legarea este

determinata de interactiuni atat hidrofobe cat si aromatice π-π.

          Un alt lucru important ar fi legarea tuturor liganzilor mai ales in aria care s-ar afla in imediata
apropiere a suprafetei externe a substratului lipidic, daca, si asa se pare a fi, aceasta cavitate ar fi de
aceeasi origine cu bistratul.

         

              2.1 STRUCTURA COMPLEXULUI  R6G

          Acest complex contine o bucla intre helicele α3 si α4, si helicele α5 si α6, formand un domeniu
de legare in centrul cavitatii centrale cu orientare citoplasmatica.

          Cavitatea de legare este extensiva si ocupa cea mai mare parte a jumatatii superioare a
regiunii transmembranare. La R6G, situsul de legare al unei singure subunitati se afla la o distanta de
6Ǻ fata de ligand, si contine resturi de Phe 386, Ala385, Leu25, Val382, Lys29 si Phe386’ de la subunitatea
vecina (marcarea numarului prim reprezinta apartenenta restului la subunitatea vecina).

          AcrB este un homotrimer, iar fiecare molecula de R6G se leaga la aria ce corespunde granitei
dintre cele 2 subunitati vecine, aceste 3 situsuri identice sunt asezate fata in fata in cavitatea centrala.

     
 Fig. 18. A.Structura 3D a complexului R6G /legare
la substrat.

        

          Se asista reciproc si interactioneaza una cu cealalta, formand un buzunar unic, larg pentru
legarea a 3 molecule de medicamente.

          Lys29 , localizata in vestibulul fiecarei subunitati, pare sa isi indrepte lantul lateral spre grupul
estic al fiecarui substrat.

          Este de notat faptul ca toate celelalte resturi aflate la distante de 6Ǻ de ligand, sunt aminoacizi
hidrofobi, sugerand astfel importanta interactiunilor hidrofobe si, posibil a celor van der Waals in
legarea medicamentelor.

          Cele 3 molecule de liganzi par sa interactioneze reciproc in stabilizarea configuratiei finale.

          2.2. STRUCTURA COMPLEXULUI  ET

          In complexul AcrB-Et, Et (ethidium), se realizeaza legarea la un situs distinct, dar se pare ca se
revarsa peste situsul de legare a R6G.

          In comparatie cu legatura R6G,  Et se afla legat la 6Ǻ distanta deasupra situsului de legare a
R6G, situsul de legare a Et fiind situat mai aproape de vestibul decat cel al R6G.

          Resturile de aminoacizi din aria de 6Ǻ ai Et includ Phe 386 si Ala385  intr-o subunitate,  si Phe386’ din
subunitatea vecina.  Phe388 este usor mai indepartata  (7-8Ǻ), Et fiind mai apropiat de Phe386 (~4Ǻ).

          Gruparea de fenil a Et este legata deasupra Phe 386’, interactionand in apropiere cu acest rest. In
acest fel, molecula de Et este facuta ”sandwich” intre doua subunitati ale transportorului.

          Ca si la R6G, majoritatea acestor legaturi sunt hidrofobe.  In buzunarul de legare, carbonilul
oxigenului apartinand Phe386 , se afla in apropierea unei grupari amino a Et (la 3,6Ǻ), si poate contribui
la neutralizarea incarcaturii formale a substratului. Tripla legatura a moleculelor Et se afla la o distanta
de ~3,2Ǻ una fata de cealalta, indicand faptul ca acesti liganzi interactioneaza puternic la nivelul
cavitatii centrale.

          2.3. STRUCTURA LEGATURII Dq

          Moleculele cu tripla legare a Dq (dequalinium), ocupa o regiune extinsa a partii superioare a

buzunarului de legare. In cei 6Ǻ ai unei molecule Dq se afla 2 resturi de acizi, Asp 99 si Asp101 , si un
rest de Ile102 , in apropierea zonei superioare a varfului apartinand gruparii quinolinium.

          Asp99 este inalt conservat, acest lucru aratand importanta acestui rest in recunoasterea
medicamentelor cationice.
           Acest grup de quinolinium din varf, formeaza un
complex strans cu alte grupari de quinolinium  si in alte 2 molecule de medicament              

               Fig.18. C. Structura 3D al
complexului, legare la substrat.

          In contrast, partea inferioara a ligandului, cu alte doua grupari de quinolinium, nu se afla la
distanta normala de 6Ǻ fata de vreun rest din peretele cavitatii, dar se afla la ~6.3Ǻ departare de cele
2 resturi de Phe (Phe386 si Phe386’) ale subunitatilor vecine.

          Contactele dintre moleculele Dq sunt dominate, ca si cele din complexele R6G si Et, de
interactiuni hidrofobe, exceptand portiunea din varf dominata de prezenta gruparii de quinolinium
unde se desfasoara interactiuni cu potential electrostatic puternic.

          Deasemeni, interactiunile de tip medicament – medicament, se pare ca sunt foarte straanse in

cadrul acestui complex.

          2.4. STRUCTURA MOLECULEI CIP

          Ca si cu R6g, molecula Cip este legata intre 2 subunitati proteice. Resturile aflate la distanta de
6Ǻ a legaturii ciprofloxacin, includ Phe 458 , Phe459 , si Lys29 , Leu25 si Ala385’ de la subunitatea vecina. In
acest complex, majoritatea interactiunilor de legare sunt hidrofobe. Grupul ciclopropil apartinand
moleculei de medicament interactioneaza cu Phe 458si Phe459 . din subunitatea vecina, lanturile laterale
de Leu25’ si Lys29’, se afla in apropierea inelului de nitrogen al grupului de quinolon. Distanta de 5Ǻ
dintre grupul ɛ-amino al Lys si inelul de nitrogen sarac in electroni, sugereaza anumite contributii
bipolare.

          Interactiunile dintre gruparile carbonil-oxigen si resturile proteice ale Cip, interactioneaza cu

moleculele de apa ce pot aparea la un moment dat in transport.

D
 
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                                                                                           

Fig. 18. D. Structura 3D a complexului Cip/ legare la substrat.

          Moleculele de medicamente ce sunt legate la cavitatea centrala a transportorului AcrB, sunt

probabil impinse afara prin domeniile periplasmice ale pompei, prin tunelul TolC ( proteina dinafara
membranei ce impreuna cu proteina AcrA formeaza complexul AcrB), si apoi in mediul extracelular.
Cea mai directa cale de extragere poate fi prin porul central, format de helicele porului din domeniul
periplasmic cu resturi de la 102 la 115.

          Aceste resturi interactioneaza exact in centrul celor 3 subunitati, iar porul se inchide.

          Probabil fluxul de protoni ce urmeaza legarii, produce o schimbare conformationala destul de

importanta a AcrB-ului, ce conduce la deschiderea porului si pornirea mecanismului de tip-elevator al
expulzarii medicamentelor.

          Studii genetice recente, la nivelul domeniilor si al resturilor, apar importante in efluxul la nivelul
substratului mediat de pompa AcrB, precum si la nivelul altor astfel de pompe.

          Domeniul periplasmic este cel care detine un rol major in determinarea specificitatii de substrat
a acestor pompe.

          Structurile liganzilor arata ca diverse chimicale au abilitatea de a lega grupari polare

complementare si hidrofobe la cavitatea centrala a transportorului de eflux.

          CAP.3. STRUCTURI  DE TRANSPORTORI

              3.1. STRUCTURA DE BAZA A POMPEI DE EFLUX CU ROL IN REZISTENTA LA

MEDICAMENTE, EmrE , PREZENT LA Escherichia coli

          Transportorii implicati in rezistenta la medicamente, ce asigura efluxul acestora, sunt folositi in

tratarea bolilor infectioase, cu rolul de expulzare in mediul extracelular al componentelor citotoxice si
a medicamentelor.

          Un astfel de transportor este si EmrE, din familia transportorilor de mici dimensiuni,
componenti ai acestei familii fiind specializati in rezistenta la medicamente, utilizand gradienti de
protoni ca sursa de energie pentru conducerea translocatiei la nivel de substrat.

          La o rezolutie de 3.8Ǻ, EmrE, este un tetramer ce conține 2 heterodimeri

conformaționali,  legați printr-o axa perpendiculara imaginara, de simetrie, la membrana celulara.
 Fig.19. Structura 3D a pompei de eflux
EmrE. A. vedere de sus perpendiculara
pe planul membranei. B. Arhitectura in
cilindru a helicelor din plan
perpendicular pe planul membranei. C.
vedere in lungul membranei la o
densitate de 1.2Ǻ. D. vedere din lateral
in plan membranar. Cele 2 seturi de
grupari de helice, unul galben-
buzunarul de legare la substrat, și al
doilea, roșu, separat de buzunarul de
legare. /

          Pe baza dovezilor structurale și biochimice, este propus un mecanism prin care EmrE realizeaza
efluxul medicamentelor prin cuplarea schimbarilor conformaționale intre cei 2 heterodimeri cu gradient
de protoni.

          Structura este chiar simpla și compacta, de aceea poate servi ca model ideal in intelegerea
structurii tipice a unui antiportor proton – medicament, pentru alte sisteme de eflux al
medicamentelor.

          Superexpresivitatea EmrE, cauzeaza bacteriei E.coli, o rezistenta sporita la contactul cu

componente cationice, toxice și hidrofobe de gen bromura de ethidium, metil- viologen, tetraciclina și
tetrafenilfofonium, la antiseptice.

          EmrE este un antiportor de proton – medicament, dirijand indreptarea gradienților protonici

electrochimici, in direcția opusa, avand in jur de 60 de omologi atat la bacterii Gram – pozitive cat și
Gram - negative.

          Fiind cel mai mic transportor, EmrE, de la E.coli este o molecula mica de 12 kDa, avand 110
resturi de aminoacizi și 4 helice. Este o proteina hidrofoba, cu doar 8 resturi incarcate cu sarcini,
incluzand Glu – 8, necesar in activitatea de eflux al medicamentelor.

          In urma cristalografierii cu raze X, structura EmrE dezvaluie un tetramer compus din 2
heterodimeri conformaționali legați printr-o axa lunga perpendiculara de simetrie, la suprafața
membranei.

          Intr-un heterodimer, helicele α1, α2, α3, ale unei subunitați sunt aranjate aproape invers fața
de cele ale celuilalt monomer, formand o impachetare de 6 helice cu miez hidrofob.
          Poziția helicei α4 aparținand  unei subunitați este aproape paralela cu suprafața membranei, iar
o alta parte patrunde in planul membranei. Aceasta poziționare a α4 pe lateral, de-a lungul suprafeței
membranare, a fost observat și la nivelul altor membranei altor proteine, cum ar fi E si M de la
flavivirusuri.

          Cea mai interesanta parte a structurii, este reprezentata de orientarea inversata a

polipeptidelor ce intra in alcatuirea conformației heterodimerilor.

          Deși un fapt inca nedovedid, aranjamentul conformațional este datorat unor posibile fuzionarii
de gene, evenimente ce dau și alți transportori, de exemplu exportori de medicamente – metaboliți
din cadrul acestei familii de transportori, ale caror subunitați omoloage se crede ca s-ar inversa la
nivelul substratului.

          Aceasta fuziune este susținuta de structuri precum canalele de clor, aquaporine și vitamina
transportata de BtuCD din familia transportorilor ABC-MDR, ce prezinta subdomenii transmembranare
inversate, codificate de o singura polipeptida.

          In cazul EmrE, exista un potențial ce unește capatul C-terminal al α4, aparținand unui
monomer, cu capatul N-terminal a helicei α4, aparținand celuilalt monomer, intr-un dimer asimetric.

          Acest lucru poate explica cum subunitațile transmembranare sunt formate la transportorii
evoluați.

          Tetramerul este alcatuit din contacte ale α1 de la ambii heterodimeri, formand un unghi de 90̊.

          Aria ingropata este de aprox. 550Ǻ, conține molecula relativ mica a EmrE, și poate reflecta
starea conformației prinsa de forma acestui cristal.

          La acest nivel, o grupare de Glu14s de importanța funcționala și o serie de resturi proteice,
implicate impreuna in legarea protonilor.

          Gruparea de glutamat se pare ca are

rol decisiv in activarea mecanismului prin care
protonii sunt
          Forma in X a aranjamentului din α1s, și poziția restului glutaminic, realizeaza consistența
punctului pivot, studii ce au aratat ca Glu -14 este singurul rest din α1 ce poate fi legat la HgCl2 la
inlocuirea cu cisteina,  arata calea de translocație a medicamentelor, interfața dovedita in urma
studiilor biochimice.

          3.3.2 STRUCTURA TRANSPORTORULUI DEPENDENT DE Na +/Cl- IMPLICAT IN

TRANSPORTORUL DE NEUROTRANSMIȚATORI.

          Transportorii dependenți de Na +/Cl-, mediaza transmiterea sinaptica folosind gradienții

electrochimici in conducerea fluxului de neurotransmițatori, incluzand amine biogenice, de la sinapsa
la citoplasma neuronilor și a celulelor gliale.

          Acești transportori sunt țintele componentelor terapeutice, iar disfuncții la nivelul lor sunt
implicate in boli ale sistemului nervos. Structura de cristal studiata la Aquifex aeolicus, arata un
complex ce cuprinde și legarea la substrat a leucinei, și a 2 ioni de sodiu.

          Miezul proteinei cuprinde un set de 10 din 12 segmente transmembranare, cu segmentele 1-5

legate cu 6-10 printr-o axa perpendiculara de simetrie in plan membranar.

          Leucina și ionii de sodiu sunt legați la miezul proteic, la jumatatea distanței bistratului
membranar, intr-o ocluzie datorata apei. Ca situs de legare al leucinei LeuT Aa a proteolopozomilor
stimulata de valinomicina, aceasta funcționeaza și ca ligand al celor 2 ioni de sodiu , numiți Na1 și
Na2, legarea se face la nivelul regiunilor TM1 și TM6.

        Fig.26. Situsuri de legare ale LeuTAa respectiv a ionilor de sodiu.

          Situsurile de legare ale leucinei și a ionilor de sodiu sunt datorate decondensarii parțiale a
helicelor transmembranare, cu atomi din lanțurile principale și cu dipoli helicați, indeplinind roluri cheie
in legarea ionilor la substrat.
          Comunicarea dintre neuroni, este esențiala pentru transmiterea impulsului nervos prin sinapse
chimice, joncțiuni la nivelul carora semnalele electrice sunt eliberate de un neuron spre cel din
imediata apropiere, pe calea clasica a neurotransmiterii  mediatorilor de tip serotonina, norepinefrina,
dopamina, glicina și GABA (acid γ-aminobutiric).

          Sosirea unui potențial de acțiune la capatul terminal presinaptic, determina eliberarea acestor
proteine mici, ce pot activa cu o rapiditate de milisecunde deschiderea canalelor ionice, sau pot avea o
acțiune mai lenta data de receptorii cuplați ai proteinei G.

          Dupa activarea receptorilor, acești neurotransmițatori sunt eliberați in sinapsa, inițial specific,
prin inalta afinitate a transportorilor membranari, localizați la capatul terminal presinaptic, inconjurand
mai apoi și celulele gliale.

          Acest flux energetic are rol in reglajul electrochimic al concentrației ionice normale, dar și in
inlocuirea depozitelor veziculare presinaptice de neurotransmițatori, printr-o clasa separata de
purtatori veziculari.

          Simportorii dependenți de Na+/ Cl-, folosesc gradientul electrochimic de sodiu și clor in cataliza
supraincarcarii ce determina mișcarea termodinamica pe o arie larga a substratului, folosind și aminele
biogenice (serotonina, dopamina, norepinefrina), aminoacizi (GABA, glicina, prolina, taurina) și produși
ai osmozei (betaina, creatina).

          Disfuncții la nivelul acestui simportor, sunt implicate in depresii, boala Parkinson, intoleranța
ortostatica și epilepsie. De reținut ar fi faptul ca sunt ținta substanțelor ce creaza dependența:
cocaina, amfetamina, precum și a unor agenți terapeutici de genul anticonvulsivi și a unor inhibitori de
preluare selectiva a serotoninei.

          3.4 STRUCTURA TRANSPORTORULUI GLUTAMAT OMOLOG LA Pyrococcus horikoshii

          Transportorii glutamați sunt proteine integrate de membrana, ce intervin in  preluarea și

transportul concentrației de glutamat, din sinapse inspre spațiul intracelular, prin inlocuirea
gradienților ionici preexistenți.

          In centrul sistemului nervos, transportorii glutamați sunt esențiali pentru dezvoltarea și
funcționarea in condiții optime, fiind implicați in atacul cerebral, epilepsie și in alte boli
neurodegenerative.

          Trimerul transportorului are forma unui bol, cu un camp bazal incarcat cu solvenți, extins de-a
lungul bistratului membranar.

          Pe suprafața bazala sunt localizate 3 situsuri de legare independente, fiecare dintre acestea
susținut de 2 agrafe helicale, HP1 și HP2, intrate prin parțile laterale ale membranei.

          Transportul glutamatului este facilitat de mișcarea acestor 2 agrafe, ce permit accesul

alternativ prin bistratul membranei.

          Sinapsa chimica este punctul central al comunicarii dintre neuronii creierului uman, aceste
sinapse au rolul de a media transportul majoritații neurotransmiterilor excitatorii rapide, reprezentand
totodata și centrul de inițiere al proceselor de invațare și memorare.

          Disfuncții la nivelul acestor sinapse cauzeaza o serie de boli și leziuni ale sistemului nervos,
incluzand depresia, schizofrenia și atacul cerebral.
             Rapida eliminare a glutamatului din sinapsa este datorata  inaltei afinitați, transportorii
dependenți de sodiu fiind necesari in neurotransmitere și in prevenirea excitotoxicitații induse
de  surplusul glutamat.

          Cristalul transportorului glutamat de la Pyrococcus horikoshii are o identitate de 37%  identica

cu transportorul de aminoacizi excitator 2 (hEAAT2).

          Mecanismul tipic de transport al glutamatului este cel de acces alternativ, un situs de legare
intramembranar este flancat de 2 porții permițand accesul soluțiilor intra și extracelulare la nivelul
substratului.

          Proteina aflata la nivelul situsului de legare, ce asigura calea de transport este reprezentata de
promotorul GltphH7. Probabil cea mai interesanta trasatura a acestei proteine este reaprezentata de
bazinul acvatic ce permite legarea ionilor la substrat, aflat la jumatatea stratului membranar.

         

         

Fig.26. Structura proteinei GltphH7.a. reprezentarea trimerului, vedere extracelulara, b. vedere

citoplasmatica a deschiderilor dintre unitați, precum și cea dintre TM1 și TM6, c.vedere asupra
trimerului paralel cu planul membranar, d.suprafața secționata a trimerului la nivelul centrului
bazinului. / http://www.nature.com/nature/journal/v431/n7010/fig_tab/nature03018_F2.html

          Situsul de legare este situat la aprox. 5Ǻ sub bazin și este prins de varful agrafei HP2 (hairpin).

          Imediat sub buzunarul de legare se afla HP1, TM7 și partea C-terminala a TM8, și se presupune
ca HP1 formeaza poarta intracelulara deoarece mișcarea coordonata a HP1 cu a TM7 și a parții C-
terminale a TM8, ar deschide calea acvatica dinspre situsul de legare spre citoplasma.
          Structura GltphH7 reprezinta o stare de legare a transportorului cu ambele porți deschise. Deși
porțile HP1 și HP2  au o similaritate structurala, acestea se pare ca aparțin unor contexte proteice
diferite, drept urmare schimbarile conformaționale se interpun la deschiderea porților, precum și
indicatorii chimici implicați in deschiderea porților, se presupune ca dețin origine distincta.

          Fig.26. Arhitectura trimerului și mecanismul de transport. Transportorii glutamat au un bazin

acvatic larg unde se gasesc cele 3 situsuri de legare. A. HP2 are o conformație deschisa, B. starea de
legare a transportorului observat in structura proteinei.

          Pentru deschiderea porții intracelulare, HP1, se mișca vertical fața de citoplasma și lateral fața
de deschidere, de aceea se creaza o cale de transport prin substrat de-a lungul feței polare a TM8 și
redirecționeaza regiunea de atașare serica a HP1 accesibila doar citoplasmei.

          Cand poarta intracelulara este deschisa, HP2 se mișca spre centrul trimerului, ocupand spațiul
predestinat HP1, evitand astfel formarea unui por transmembranar.