TRANSFORMAREA GENETICA A CELULELOR BACTERIENE

 transformarea celulelor de E. coli DH5α cu vectorul pGFP se realizează pentru

observarea transferului proteinei cu fluorescenţă verde şi dobândirii rezistenţei la
antibiotice (kanamicină)
 transformarea celulelor de E. coli DH5α poate fi realizată cu molecule de ADN
recombinant (pUC18/19 + ADN cromosomal de B. subtilis B2) pentru observarea
transferului rezistenţei la antibiotice (ampicilină) şi restabilirea capacităţii de
metabolizare a lactozei (lac+)
 scopul experimentului este transformarea celulelor de Bacillus licheniformis B40 cu
genotip amy- cu ADN cromosomal izolat de la o tuilpină de Bacillus subtilis B2 cu
genotip amy+ .

Transformarea
Transformarea celulelorcelulelor de
de Escherichia coli
Bacillus licheniformis

- se utilizează
- se utilizează tulpina E.o coli
cultură bacteriană
DH5α mutantăde 18 h
(lac-)
obţinută în mediu lichid LB
care se cultivă 18 h la 37oC în mediu LB;la 37oC;
- se centrifughează
- se centrifughează 2 ml suspensie
2 ml suspensie bacteriană
bacteriană 5 5
minute
minute la 6.000 rpm la 6.000 rpm;

- celulele
- sedimentul se reiadepuse
într-unprin
1 mlcentrifugare se spală de 2-3
soluţie sterilă
rece de Tris HCl 10 mM (pH = 8) şi CaCl2 50 slab
ori cu apă distilată sterilă sau cu soluţii
Mm ionice (glicerol 10%, sorbitol, PEG, glucoză)
pentru15
- se incubează îndepărtarea urmelor
min. pe gheaţă, apoidecelulele
mediu;
sunt depuse prin centrifugare şi reluate învolum
- celulele se resuspendă într-un 200  del glicerol
(1 ml)
din aceeaşi astfel
soluţie încât
şi se concentraţia
incubează celulară
pe gheaţă timpsă fie
1x1010 celule/ml;
de 30 min., pentru obţinerea celulelor competente

- se10
- se adaugă realizează
l soluţieamestecul
de ADNpentru electroporare:
transformant

(pGFP sau pUC18/19 + ADN cromosomal+de
100 l celule electrocompetente 5 B.l ADN
transformant
subtilis B2) ce conţine
şi se continuă aproximativ
incubarea g ADN
pe gheaţă315
min. şi se supune unui puls electric;
 - amestecul se incălzeşte 2 min. la 42oC, apoi este - celulele transformate se reiau într-un 1 ml mediu
diluat până la 1 ml cu mediu LB proaspăt; LB şi se incubează 30 – 60 min. la 37 oC pentru
multiplicarea celulelor;

- suspensia se incubează 20 – 40 min. la 37oC - se fac diluţii zecimale 10-4 – 10-5 apoi se
pentru multiplicarea celulelor transformate; însămânţează 100 l pe mediu simplu – geloză
(martor) pentru determinarea numărului de celule
supravieţuitoare şi 100 l pe mediu selectiv –
din amestec se fac diluţii şi se însămânţează geloză cu amidon 1% şi se incubează 24 h la
câte 100 l pe plăci Petri cu mediu selectiv 37oC
(geloză cu kanamicină pentru evidenţierea
coloniilor rezistente la kanamicină şi
fluorescente sau mediu EMB cu 20 g/ml
ampicilină pentru evidenţierea coloniilor lac+
şi rezistente la ampicilină);

- plăcile însămânţate şi etalate se incubează

24 – 48 h la 37oC, după care se apreciază
eficienţa transformării.

Transformarea celulelor de Escherichia coli transferul de material genetic exogen într-o

gazdă corespunzătoare

se bazează pe anumite modificări ale învelişurilor celulare microbiene, care permit penetrarea
acestora de către macromolecule

natură = fenomenul este posibil datorită apariţiei unei staări fiziologice temporare numită stare
de competenţă, care se instalează într-o anumită etapă a ciclului de dezvoltare a bacteriilor

Bacillus subtilis

• starea de competenţă este maximă la începutul fazei staţionare şi durează şase ore

Escherichia coli
• starea de competeţă nu apare în mod natural, dar ea poate fi indusă in vitro prin tratamente
chimice şi fizice: soluţii ce conţin săruri (CaCl2, RbCl) şi şocuri termice (0oC – 42oC)

• in urma acestor tratamente, celulele de E. coli devin capabile să preia din mediu moleculele de
ADN exogen

• adsorbţia ADN transformant la celula receptor

• în prima fază reversibilă, apoi ireversibila

• pătrunderea ADN transformant în celula receptor

• integrarea ADN transformant în cromosomul celulei gazdă receptor şi exprimarea sa (obţinerea

celulelor transformate)

• ADN exogen cromosomal va participa la procese de recombinare genetică cu ADN al

cromosomului gazdei

• ADN exogen plasmidial poate participa la următoarele tipuri de procese: - două molecule
monocatenare vor hibridiza şi vor reforma molecula dublucatenară; - iniţierea sintezei replicative
a catenei complementare şi refacerea structurii dublucatenare.

• in absenţa recombinării, ADN exogen este degradat şi nu se exprimă

Pentru explicarea mecanismului de transport al ADN exogen în interiorul celulei bacteriene a

fost emisă ipoteza transformasomului

se consideră că după traversarea membranei plasmatice, ADN este preluat într-o veziculă
intracitoplasmatică numită transformasom, care transportă ADN până la nivelul nucleoidului
bacterian unde îl eliberează

 în cazul bacililor ADN transformant este convertit la forma monocatenară în cursul

transferului prin membrana plasmatică

 la E. coli (şi în general la bacteriile Gram negative), ADN transformant traversează

membrana plasmatică păstrându-şi forma dublucatenară - ADN devine monocatenar doar în
interiorul celulei, fiind protejat de nucleazele gazdei de către transformasom

 ADN exogen transformant pătruns în celulă poate fi integrat în cromosomul gazdei în urma
unui proces de recombinare pe bază de omologie

 in absenţa recombinării, ADN transformant este degradat

 procesul de transformare se poate realiza atât cu ADN cromosomal, cât şi cu ADN plasmidial

Transformarea celulelor de Bacillus licheniformis cu ADN heterolog prin electroporare

 bacilii pot fi transformaţi prin trei procedee: - transformarea celulelor competente -

transformarea protoplaştilor - electroporare (electrotransformare)

 modificarea genetică a microorganismelor în scopul obţinerii unor cantităţi mai mari de

enzime (proteaze, amilaze etc.) presupune transferul informaţiei genetice de interes în celule
acceptoare, care să permită selectarea tulpinilor transformate.

Transformarea celulelor competente

la bacili, transformarea se bazează pe existenţa unei stări fiziologice tranzitorii numită stare de
competenţă, care este asociată cu anumite modificări la nivelul membranei plasmatice ce
permit pătrunderea în interiorul celulelor a unor molecule de ADN exogen transformant

 starea de competenţă la bacili apare în cursul cultivării pe medii minimale, la sfarşitul fazei
exponenţaile şi începutul fazei staţionare

 deşi este relativ uşor de obţinut starea de competenţă, ea se utilizează mai rar deoarece
momentul apariţiei acestei stări variază în funcţie de tulpina cu care se lucrează

Transformarea protoplaştilor

presupune utilizarea unor celule lipsite de perete celular (protoplaşti), care sunt capabile să
accepte molecule de ADN exogen

 peretele celular este îndepărat prin tratament enzimatic cu lizozim – acţionează asupra
componentelor peptidoglicanului hidrolizând legăturile dintre acidul N-acetilmuramic şi N-
acetilglucozamină

 deoarece protoplaştii sunt protejaţi doar de membrana plasmatică, ei sunt foarte sensibili la
condiţiile de mediu

 pentru a preveni degradarea acestora, trebuie menţinuţi în medii izotonice sau hipertonice care
să conţină un stabilizator osmotic (în cazul bacililor acesta este sucroza în concentraţii mari 0,3 –
0,5 M)
 succesul experimentelor de transformare a protoplaştilor depinde nu numai de obţinerea şi
transformarea lor ci şi de posibilitatea regenerării peretelui cellular, astfel încât celulele
recombinate să poată fi menţinute şi utilizate în condiţii normale de mediu (fără stabilizator
osmotic)

Avantaje:

- se elimină bariera de specie – pot fi transferate molecule de ADN exogen provenite de la specii
neînrudite filogenetic

- pentru transformare pot fi folosite atât molecule de ADN cromosomal cât şi molecule de ADN
plasmidial

Dezavantaje:

- fragilitatea protoplaştilor

- sensibilitatea la variaţiile condiţiilor de mediu

ELECTROPORAREA

 a fost descoperită în urma studiilor efectuate asupra celulelor animale (hematii) supuse
acţiunii câmpurilor electrice

 constă în inducerea unei permeabilizări reversibile a celulelor procariote sau eucariote

prin utilizarea unui câmp electric

 in prezenţa unui câmp electric extern, componentele membranei celulare devin polarizate şi
membrana este traversată de un potenţial electric

 dacă diferenţa de potenţial depăşeşte o valoare prag, membrana se „rupe” în anumite zone
şi devine permeabilă pentru moleculele exogene

 dacă mărimea şi durata aplicării câmpului electric nu depăşesc o anumită valoare critică
limită, permeabilitatea este reversibilă, celula nefiind afectată

 electrotransformarea presupune introducerea de ADN cromosomal sau plasmidial într-o

celulă gazdă prin intermediul unui puls electric de tensiune înaltă

Factorii de care depind electroporarea sunt următorii:

 concentraţia ADN transformant (la bacterii eficienţa maximă de transformare este atinsă cu 1
– 5 g ADN/ml)
 dimensiunea moleculelor de ADN (moleculele mai mici au eficienţă mai mare de
transformare)

 conformaţia moleculară a ADN (ADN supraîncolăcit este mai eficient decât cel linear)

 Randamentul de transformare este influenţat de:

 stadiul de creştere al culturii bacteriene

 compoziţia mediului de cultură a culturii bacteriene

 aerarea şi temperatura la care este menţinută cultura bacteriană

avantaje

se pot folosi atât protoplaşti cât şi celule cu perete celular

- este o metodă rapidă şi eficientă

dezavantaje

- sensibilitatea protoplaştilor la tratamentul cu curent electric

- barierele de restricţie ale celulelor receptoare

- posibila prezenţă în mediul de electroporare a unor nucleaze nespecifice

TRANSFORMAREA GENETICA LA PLANTE

transformarea genetică la plante a devenit posibilă in vitro în urma descoperirii faptului că o

serie de bacterii din sol aparţinând genului Agrobacterium sunt capabile să determine
introducerea în genomul vegetal a unei secvenţe de ADN propriu

ADN-T se găseşte la nivelul unor plasmide (megaplasmide, mai mari de 100 kb) existente în
speciile de Agrobacterium tumefaciens (Ti) şi Agrobacterium rhizogenes (Ri)
plasmidele de la Agrobacterium tumefaciens se numesc Ti – „tumor inducing” pentru că
prezenţa ADN în celula vegetală este urmată de apariţia la nivelul plantelor infectate a unor
tumori

plasmidele de la Agrobacterium rhizogenes se numesc Ri – „root inducing” pentru că

plantele infectate formează o serie de rădăcini adventive la nivelul unor organe unde în mod
normal ele nu se formează (pe frunze, pe tulpină).

rădăcinile determinate de Ri au un geotropism negativ

plasmidele Ti - sunt molecule de ADN dublucatenar circular - se află în număr mic de

copii/celulă (1-2 copii/celulă) şi - au dimensiuni mai mari de 100 kb (150 – 200 kb)

la nivelul ADN-T se găsesc mai multe tipuri de gene:

onc (sau tum) – codifică hormoni vegetali (auxine şi citokinine) ce modifică metabolismul -
în celula vegetală transformată (ce conţine ADN-T) prezenţa genelor onc determină un aport
suplimentar de hormoni vegetali, deci o multiplicare anormală a celulelor respective şi formarea
de tumori

ops (opine sintetase) – gene ce asigură sinteza în celulele vegetale transformate a unor
aminoacizi anormali numiţi opine (nopalina - nos şi octopina - ocs) - aceste gene au promotor
şi secvenţă terminator proprii (bacteriene) pe care echipamentul enzimatic al celulei vegetale le
recunoaşte, ceea ce permite utilizarea acestor elemente reglatoare pentru clonarea sub controlul
unor gene de interes

in afara regiunii ADN-T - este mărginită de secvenţele marginale TL şi TR cu lungime de cate

25 pb esenţiale pentru procesul de transfer şi integrare al ADN-T în celula vegetală - se găseşte
operonul vir - genele structurale ale acestuia codifică proteine implicate în transferul
conjugativ al ADN-T din celula bacteriană în celula vegetală - in absenţa operonului vir,
transferul ADN-T în celula vegetală este imposibil
Mecanismul de infectie

presupune transformarea plantei infectate cu o parte a ADN plasmidial, ceea ce duce la apariția de tumori și
hrănirea celulelor bacteriene

1. bacteria infectează plantele rănite, care eliberează substanțe fenolice (acetosiringonă) care atrag bacteria
(chemotactism pozitiv)

2. bacteria se atașează la suprafața celulei vegetale, prin producerea de fibre de celuloză (Escobar și
Dandekar, 2003

3. prin intermediul a două sisteme semnal (VirA/VirG), bacteria produce ADN-T - acetosiringona activează
VirA – receptor de membrană care activează VirG - factor de transcriere

4. VirC și VirD (endonucleaze de restricție) taie fragmentul ADN-T monocatenar din plasmida Ti

5. proteinele VirE2 se leagă la fragmentul ADN-T, protejându-l de atacul nucleazelor

6. proteinele VirB2-VirB11 formează o structură tubulară prin care este transferat complexul ADN-T (ADN-
T+VirE2) din bacterie în celula vegetală - mecanismul exact al acestui proces nu este pe deplin cunoscut.

7. în interiorul celulei gazdă, complexul ADN-T este direcționat către nucleu (receptori ai celulei vegetale
facilitează integrarea acestuia în genom, posibil prin intermediul sistemului de reparare a ADN )

- dacă nu există o mare complementaritate între genomul plantei și ADN-T introdus, acesta se integrează
randomic în genomul celulei vegetale gazda

dimensiunile mari ale Ti şi Ri +

faptul că determină un fenotip anormal împiedică utilizarea lor ca atare pentru transferul unor gene
de interes în plante

pornind de la aceste plasmide au fost obţinuţi vectori de tip „navetă” ce conţin doar secvenţele
marginale (TL şi TR) din ADN-T

intre aceste secvenţe au fost introduse în mod controlat gene marker pentru selecţia celulelor transformate
precum şi situsuri de tip MCS la nivelul cărora să poată fi introduse gene de interes

dintre genele marker existente la nivelul ADN-T al vectorilor menţionăm:

npt II – neomicinfosfotransferaza ce determină rezistenţa la kanamicină;

cat – cloramfenicolaminotransferaza;

gus – β-glucuronidaza, permite utilizarea unui test histochimic de identificare a celulelor transformate –
substratul cromogen incolor este convertit la un compus de culoare albastră;

gfp – codifică o proteină cu fluorescenţă verde

 Introducerea unui vector de clonare în celulele vegetale

SCOP:

stabilirea metodologiei pentru introducerea în celulele vegetale a unor gene purtate de vectorul
pBI121; genele marker sunt npt II (pentru rezistenţă la la kanamicină) şi gus (pentru sinteza β-
glucuronidazei bacteriene)

exprimarea genelor marker în ţesutul vegetal prin examinarea rezistenţei la kanamicină a celulelor
vegetale transformate şi prin realizarea de teste histochimice (apariţia de spoturi sau zone albastre pe
fragmentele de ţesut transformat după incubarea acestora într-o soluţie ce conţine substrat cromogen

două etape:

-transferul vectorului de clonare în tulpini de A. tumefaciens

conjugare triparentală

metoda co-cultivării

-infectarea plantelor cu tulpina de A. tumefaciens ce conţine vectorul dorit

CONJUGARE TRIPARENTALĂ

vectorii de clonare utilizaţi pentru transferul de gene în celulele vegetale sunt menţinuţi, de obicei, în
diferite tulpini de E.coli, de unde sunt izolaţi atunci când este necesar

s-a dovedit că tulpinile de E. coli, chiar dacă poartă vectorul de clonare specific pentru celulele vegetale,
nu pot realiza transferul acestuia într-o gazdă nouă
este esenţial ca vectorul să se găsească într-o tulpină corespunzătoare de A. tumefaciens

metodologia de transformare a celulelor de A. tumefaciens este relativ complicată (îngheţ – dezgheţ sau
electroporarea), astfel că pentru introducerea unui vector de clonare dorit (cu sau fără genă de interes) se
preferă conjugarea

plasmida ce se transferă trebuie să poarte genele tra (pentru sinteza pililor şi medierea transferului) şi
genele mob (pentru declanşarea transferului ADN sub formă monocatenară) .

E. coli – contine vectorul pBI121 – contine ADN-T E. coli - tulpina helper pentru furnizarea genelor
mob si tra
A.tumefaciens – acceptor al vectorului - dezarmata – nu mai contine ADN-T, ci doar operonul vir

Clivarea ADN cu enzime de restricţie

Enzimele de restrictie:

sunt dezoxiribonucleaze – endonucleaze încadrate în clasa a III-a de enzime Hidrolaze, subclasa I Esteraze,
subsubclasa IV Fosfodiesteraze

catalizează scindarea hidrolitică a ADN în interiorul catenelor polinucleotidice

cu formare de oligodezoxiribonucleotide 5’-P sau 3’-OH

utilizate pentru obţinerea fragmentelor de ADN necesare clonării moleculare

recunosc scurte secvenţe nucleotidice specifice

si clivează ADN dublu catenar prin hidroliza legăturilor fosfodiesterice de pe fiecare catenă a acestuia

situsurile de clivare se află fie la nivelul secvenţelor de recunoaştere,

fie în apropierea lor

in urma hidrolizei ADN, ca urmare a acţiunii enzimelor de restricţie se formeaza mai multe
fragmente de ADN cu dimensiuni variate in fct.d numărul şi distanţa dintre situsurile de
clivare de pe molecula de ADN

o moleculă de ADN circulară clivare un număr de fragmente lineare egal cu numărul de

situsuri de recunoaştere

o molecula de ADN lineară clivare numărul de fragmente rezultate este mai mare cu
unu faţă de numărul situsurilor de recunoaştere

Secvenţele de recunoaştere

 tetra-, penta- sau hexanucleotidice

 cu structură palindromică
 in foarte multe cazuri, situsul de recunoaştere = situs de clivare
 poziţiile de clivare pot fi situate simetric sau asimetric în palindrom, în raport cu axul
de simetrie

digestia enzimatică a ADN genomic (sau plasmidial în anumite cazuri) poate fi fie totală, fie
parțială
totala - toate situsurile de recunoaștere pentru enzima de restricție folosită sunt clivate
partiala - sunt clivate, la întâmplare, doar o parte dintre respectivele situsuri, astfel că
fragmentele rezultate au dimensiuni mai mari comparativ cu cele rezultate prin digestie totală

Modul de clivare a ADN la nivelul situsurilor de restricţie:

variază în funcţie de enzimă

rezulta fie fragmente de ADN cu extremităţi monocatenare complementare ,fie
fragmente de ADN cu extremităţi drepte

Factori de influenta ai activitatii ER:

 enzimele pot fi inhibate de prezenţa unor contaminanţi ai probei de ADN

(proteine, fenol, cloroform, etanol, EDTA, SDS, concentraţii mari de săruri)
 pentru a putea funcţiona, enzimele de restricţie au nevoie de ioni de Mg2+
(prezenţi în tamponul de incubare specific)
 pH-ul optim de acţiune este de 7,5 – 7,6 iar temperatura optimă este 37oC (pentru
majoritatea enzimelor)
 enzimele pot fi inactivate prin menţinerea la temperatura camerei (trebuie păstrate
la congelator)