ELECTROFOREZA

Definiţie
Electroforeza reprezintă o tehnică de separare a proteinelor bazată pe migrarea acestora în
câmp electric.

Aceste metode nu sunt utilizate pentru a purifica mari cantităţi de proteine deoarece
există metode alternative mai simple iar metodele electroforetice afectează structura şi
funcţia proteinelor.
Electroforeza este utilă ca metodă analitică.
Avantajul major este acela că proteinele pot fi vizualizate şi separate în acelaşi timp,
permiţând estimarea rapidă a numărului de proteine dintr-un amestec sau gradul de
puritate al unui preparat proteic specific.
Electroforeza permite, de asemenea, determinarea proprietăţilor fundamentale ale
proteinelor cum ar fi punctul izoelectric sau greutatea moleculară.

Generalităţi
Migrarea electroforetică a unei molecule în orice tip de mediu are loc în direcţia
electrodului cu încărcare electrică de sens opus încărcării nete a moleculei. Astfel,
moleculele încărcate negativ vor migra spre electrodul pozitiv; cationii vor migra spre
catod (-) iar anionii spre anod (+). Mediul de migrare trebuie să fie tamponat la un pH
care determină o direcţie şi o rată de migrare specifice. Mobilitatea proteinelor creşte cu
cât pH-ul este mai îndepărtat de punctul izoelectric (pI), crescând astfel încărcarea netă.
Cu toate acestea, rezoluţia de separare bazată pe diferenţele de încărcare netă este mai
bună dacă diferenţa de încărcare este redusă sau se apropie de zero la pI.

Electroforeza se desfăşoară fie pe hârtie sau pe geluri. Gelurile pot fi de agaroză sau
poliacrilamidă.

Electroforeza pe gel de poliacrilamidă

Gelul de poliacrilamidă acţionează ca o sită moleculară, încetinind mişcarea proteinelor
proporţional cu raportul masă moleculară / încărcare electrică. Migrarea poate fi afectată
şi de forma moleculelor. În concluzie, migrarea unei proteine în gel este o funcţie de
dimensiune şi formă.
 Electroforeză verticală pe gel de poliacrilamidă Identificarea proteinelor după colorarea
(schemă). Proteinele migrează în gel la aplicarea unui proteinelor din gel cu albastru Coomassie.
câmp electric. Gelul inhibă dezvoltarea curenţilor de Fiecare bandă din gel reprezintă o proteină
convecţie datoraţi gradienţilor mici de temperatură sau diferită. Proteinele mai mici se deplasează în
migrările induse de alte cauze decât câmpul electric. gel mai rapid decât cele mari. Acest exemplu
ilustrează separarea unei enzime. Prima
coloană prezintă migrarea proteinelor din
extractul celular nepurificat. Celelalte coloane,
de la stânga la dreapta reprezintă proteinele
migrate după fiecare pas. Pe ultima coloană se
observă migrarea celor 4 subunităţi ale
enzimei.

Pentru a migra proteinele în gel este nevoie de extragerea lor din context. Cele mai
comune metode electroforetice de determinare a purităţii şi masei moleculare utilizează
pentru extracţie un detergent, numit SDS (sodium-dodecil-sulfat). Acesta se cuplează la
proteine în cantităţi relativ proporţionale cu greutatea moleculară a proteinei, adică 1
moleculă SDS la fiecare 2 reziduuri de aminoacizi. SDS determină o încărcare negativă
netă, făcând nesemnificativă încărcarea intrinsecă a proteinei şi oferind tuturor
proteinelor din amestec un raport masă/încărcare similar. Astfel, electroforeza în prezenţa
SDS ţine cont aproape în exclusivitate de masa moleculară, polipeptidele mici migrând
mai repede.
După electroforeză, vizualizarea proteinelor se face prin adăugarea unui colorant (cel mai
folosit albastru Coomassie) care se leagă la proteine, fără a colora gelul.
Prin această metodă, cercetătorul poate monitoriza progresiunea unui proces de purificare
proteică cum ar fi fracţionarea celulară. Compararea poziţiilor benzilor de migrare cu
geluri standard face facilă identificarea unor proteine cu greutate moleculară
necunoscută.
DE MEMORAT
pI – punctul izoelectric – punctul izoelectric este pHul la care încărcarea netă totală a
unei molecule amfotere devine zero. Punctul izoelectric depinde de tăria ionică a
solventului, de speciile contraionice şi de concentraţia de solviţi în timp ce punctul
izoionic este punctul izoelectric în absenţa contraionilor şi la concentraţii scăzute de
solvit. Punctul izoelectric este uşor de determinat ca pHul la care molecula este imobilă
într-un experiment de electroforeză (focusare izoelectrică). Punctul izoelectric se apropie
de punctul izoionic la o tărie ionică scăzută, când legăturile ionice sunt inactivate. La
punctul izoelectric, moleculele amfotere se agregă şi devin insolubile deoarece nu există
repulsie electrostatică între molecule cu aceeaşi încărcare netă.

Electroforeza reprezintă o metodă de analiză și separare bazată pe migrarea particulelor

solide dispersate într-un lichid sub acțiunea unui câmp electric. Denumirea de
electroforeză provine din greaca veche şi latină, unde cuvântul electron (electric)
combinat cu cel latin phore (purtător), evidenţiază astfel rolul esențial al câmpului
electric în procedeul descris.
Deși este cunoscută încă de la sfârșitul secolului XIX, electroforeza se afirmă ca o
metodă analitică de separare abia în urma lucrărilor referitoare la stadiul unor proteine
(1937) elaborate de Arne Tiselius, laureat al premiului Nobel, numit și “părintele
electroforezei”.

Electroforeza este o metodă standard utilizată în studiile de biologie moleculară.

Principiul metodei se bazează pe migrarea în câmp electric a moleculelor încărcate
negative în funcție de dimensiunea și forma lor. Astfel moleculele de dimensiuni mici vor
migra mai rapid spre polul pozitiv (anod) comparativ cu moleculele de dimensiuni mai
mari.

Electroforeza este o metodă fizico-chimică de analiza ce permite separarea

macromeculelor (proteine sau acizi nucleici) sau a monomerilor specifici (aminoacizi,
nucleotide), pe baza diferenţelor între vitezele de deplasare într-un câmp electric aplicat
mediului respectiv. Ca urmare a caracterului lor amfoter, proteinele posedă o sarcină
electrică ce depinde de natura moleculei, pH şi de compoziţia mediului. Moleculele
încărcate electric, aflate în soluţie şi supuse acţiunii unui câmp electric, vor migra către
electrodul de polaritate opusă.
Electroforeza este o metoda analitică ce permite:
- vizualizarea şi separarea în acelaşi timp, permiţând estimarea rapidă a numărului
de proteine dintr-un amestec sau gradul de puritate al unui preparat proteic
specific;
- determinarea proprietăţilor fundamentale ale proteinelor cum ar fi punctul
izoelectric (pI) sau greutatea moleculară. pI – punctul izoelectric este pH-ul la
care încărcarea netă totală a unei molecule amfotere devine zero şi mobilitatea
este nulă.)

Viteza cu care se deplasează o particulă într-un câmp electric depinde de mai mulţi
factori: densitatea de sarcină electrică la suprafaţa particulei (funcţie de mărimea sarcinii
şi de volumul particulei), densitatea particulei, gradientul de potenţial (reprezentat de
raportul dintre diferenţa de potenţial dintre electrozi şi distanţa dintre acestea), forţa
ionică a mediului, vâscozitatea lui, temperatura. De aceeaşi factori depinde şi gradul de
rezoluţie al unei metode electroforetice, natura suportului folosit şi pH-ul mediului fiind
decisive.

TIPURI DE ELECTROFOREZĂ
De-a lungul timpului s-au folosit mai multe suporturi electroforetice, gelul de agaroză
fiind cel care asigură cea mai bună rezoluţie. Se cunosc mai multe tipuri de electroforeza
în gel de agaroză: tehnica standard, electroforeza în gel de SDS-agaroza (la care
adăugarea SDS - sodium dodecil sulfat în compoziţia suportului electroforetic permite
separarea fracţiunilor pe baza masei moleculare) şi focalizarea izoelectrică
În studiile de biologie moleculară migrarea poate fi efectuată prin utilizarea a două tipuri
de gel: de agaroză și de poliacrilamidă. Pe lângă componentul de bază utilizat, cele
două geluri se diferențiază și prin rezoluția de separare.

ELECTROFOREZA PE GEL DE AGAROZĂ

Agaroza este preferată în cazul moleculelor de acid nucleic mai mari, cu dimensiuni
cuprinse în intervalul 0,5-25 kpb, iar gelul de poliacrilamidă pentru fragmentele de până
la 1000 perechi de baze (bp).

Agaroza este un polizaharid extras din anumite specii de alge care prin polimerizare
formează o rețea neutră. Structura neutră a gelului de agaroză constituie un avantaj
deoarece acesta nu va interacționa
cu moleculele hidrofobe supuse migrării electroforetice. Dimensiunea porilor diferă în
funcție de concentrația de agaroză utilizată, între cele două existând o relație de invers-
proporționalitate. (Clarck, 2010)
- Prepararea gelului de agaroză 2%:
o gelul de agaroză se obține prin dizolvarea agarozei într-o soluție tampon
prin încălzire
o după răcire, câteva minute, soluția de agaroză se toarnă într-o tăviță
specială
o se fixează pieptenele pentru formarea godeurilor și se lasă la răcit.
o în urma răcirii, gelul de agaroză se va prezenta sub forma unei rețele cu
pori de dimensiuni cuprinse între 100 și 300 nm.
o încărcarea probelor: în fiecare godeu se depune o cantitate de 5μl AND
amestecată cu 1μl de tampon de încărcare. Tamponul de încărcare utilizat
conține un amestec de doi coloranți, albastru de brom fenol și xilen cianol.
Cei doi compuși au masă moleculară determinată ceea ce permite
observarea evoluției electroforetice a probelor încărcate.
o condiții de migrare: s-a utilizat ca tampon de migrare TBE 1x (Tris-Borat-
EDTA) și s-a aplicat o tensiune de 5 V/cm.
o vizualizare: pentru vizualizarea fragmentelor de ADN se foloseşte
colorația cu bromură de etidiu. Bromura de etidiu este un agent intercalant
fluorescent care se fixează între bazele azotate ale moleculelor de ADN.
Prin expunerea la lampa UV moleculele de ADN apar sub forma
unor benzi de culoare portocalie. Utilizarea bromurii de etidiu presupune
 o serie de măsuri de protecție deoarece este considerată a fi un puternic
agent mutagen.

Fig. 1 Etapele electroforezei în gel de agaroză. Agaroza se dizolvă într-o soluție tampon
prin încălzire și se toarnă într-o tăviță specială (a, b) Pentru formarea godeurilor se
fixează un pieptene astfel încât probele să migreze de la același nivel (c). După răcire,
gelul se depune în cuva de migrare, în care se află tamponul de migrare în cantitate
suficientă cât să acopere gelul. Probele sunt încărcate în godeuri separate după ce au fost
amestecate în prealabil cu un colorant - loading dye (d.). După încărcarea probelor se
pune capacul la cuva de migrare, se fixează anodul la capătul opus godeurilor cu probele
de analizat și se setează la un voltaj de 5 V/cm (e.)
ELECTROFOREZA ÎN GEL DE POLIACRILAMIDĂ (PAGE)
Migrarea electroforetică în gel de poliacrilamidă este preferată pentru separarea
fragmentelor de ADN de mici dimensiuni datorită puterii de rezoluție mare, care permite
diferențierea fragmentele ce se deosebesc chiar și printr-o singură pereche de baze.
Gelul de poliacrilamidă se obține în urma reacției de polimerizare dintre
acrilamidă,unitatea de bază și N,N-metilen-bis-acrilamidă, agentul de reticulare.
Reacția de polimerizare este catalizată de: TEMED (N,N,N’,N’-tetra-metilen-diamină) și
APS (persulfat de amoniu).
În urma reacției se formează o rețea de pori. Dimensiunea porilor este invers
proporțională cu concentrația de acrilamidă: bis-acrilamidă din soluție.

Electroforeza în gel de agaroza prezintă câteva avantaje, cele mai importante fiind:
 gradul mare de rezoluţie, specificitate şi sensibilitate
 rapiditatea, conferită de posibilitatea analizei simultane a mai multor parametri, ca
urmare a independenţei totale a celor două module (de migrare şi colorare)
 gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minimă a factorului uman la
metodele manuale)
 diversificarea parametrilor investigaţi (proteine, lipoproteine, izoenzime,
hemoglobine normale şi patologice)
Aplicabilitatea în cazul mai multor lichide biologice (ser dar şi urină, LCR şi altele),
precum şi faptul că pentru aceste lichide nu mai este nevoie de concentrarea lor, fiind
astfel înlăturat un neajuns important care făcea, de multe ori, impracticabila metodă
pentru electroforeza proteinelor urinare, din LCR şi din alte fluide hipoproteice