UNIVERSITATEA DE VEST TIMIȘOARA

FACULTATEA DE CHIMIE- BIOLOGIE- GEOGRAFIE

DEPARTAMENTUL BIOLOGIE-CHIMIE
SPECIALIZAREA: "TEHNICI DE ANALIZĂ CHIMICĂ CU APLICAȚII ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ, COSMETICĂ
ȘI FARMACEUTICĂ"

Tehnici de analiză termică cu

aplicații în biologie

MASTERANDĂ:
STOICA LAURA

Timişoara, 2012
 Cuprins

Introducere………………………………………………………………………………….
2
I. Metode de analiza termică………………………………………………………..3
I.1. Termogravimetria (TG/TGA)…………………………………………….3
I.2. Termogravimetria derivată (TGD/DTG)…………………………………5
I.3. Analiza termodiferenţială (ATD/DTA)…………………………………..6
I.4. Calorimetria diferenţială (CD/DSC)……………………………………...7
II. Tehnici de termoanaliză pentru probe biologice……………………………9
II.1.Avantajele analizei termice în studii biologice…………………………...9
II.2.Analiza termică a membranelor biologice………………………………..9
2.2.1. Lipide bistratificate……………………………………………….10
2.2.2.Calorimetria diferentială a celulelor, membranelor și a lipidelor
bistratificate…………………………………………………………………………………...13
2.2.3. Interacțiuni lipidice-protidice…………………………………….14
2.3. Studiile termice asupra lipoproteinelor plasmatice……………………...15
2.4. Analiza termică a proteinelor…………………………………………....17
2.5. Analiza termică a acidului nucleic dezoxiriboză (ADN)………………..20
2.6. Analiza termică a țesutului conjunctiv…………………………………..21
2.7. Analiza termică a calculilor biliari.……………………………………...23
2.8. Analiza termică a melaninei……………………………………………..25
2.9. Studiile structurale și funcționale ale proteinelor din mușchi…………..27
2.10. Analiza termică la plante…………………………………………….....29
2.10.1. Analiza termică pe plante întregi și țesuturile plantelor……......30
2.10.2. Termografia IR…………………………………………………33
Concluzii……………………………………………………………………………………36
Bibliografie………………………………………………………………………………...37

Introducere
1
 Metodele de analiză termică se ocupă cu studiul stării termice a
substanţelor şi a shimbărilor care se produc în funcţie de temperatură.
Tehnicile de termoanaliză, deși nu sunt tehnici de rutină utilizate în cadrul
anchetelor biologice, atunci când au fost aplicate în biochimie și biologie s-au
obținut unele rezultate importante.
Cercetările pot fi efectuate prin două metode termice: statică și dinamică.
La metoda statică temperatura sistemului variază discontinuu, măsurarea
parametrului realizându-se după stabilirea echilibrului. La metoda dinamică
măsurarea se realizează continuu, odată cu creșterea sau scăderea continuă a
temperaturii sistemului.
Pentru a determina proprietățile termo-fizice sunt utilizate mai multe
metode în mod obișnuit: analiza termică diferențială (DTA), calorimetria de
scanare diferențială (DSC), analiză termogravimetrică (TGA), dilatometrie
(DIL), analiza dinamică mecanică (DMA), analiza dielectrică (DEA).
Echipamentul de laborator comun are o combinație de două tehnici de analiză
termică.
Aplicațiile analizei termice în domeniul biochimic și biologic s-au extins
în mod dramatic în ultimii douăzeci de ani și au avut contribuții valoroase în
determinările structurale și conformaționale ale compușilor biologici. Analiza
termică a sistemelor biologice este în continuă dependență de alte tehnici non-
termice.

I. Metode de analiză termică

2
 Analiza termică face parte dintre metodele de analiză fizico-chimică. Ea
se bazează pe urmărirea temperaturilor de transformare fizică, atât pure cât şi la
amestecuri formate din doi sau mai mulţi componenţi, în scopul stabilirii
diagramelor de fază.
Un procedeu simplu al analizei îl constituie urmărirea vitezei cu care
variază temperatura în funcţie de timp, la răcirea topiturii unui aliaj binar. Cu
ajutorul curbelor de răcire, trasate pentru diferite compoziţii ale aliajului, se
trasează diagrama de fază a aliajului. Curbele de răcire prezintă forme
caracteristice pentru componenţii puri şi pentru amestec. În cazul unui
component pur, în porţiunea iniţială are loc o scădere uniformă a temperaturii,
prin răcirea componentului pur în stare lichidă.
În termenul general de analiză termică sunt întrunite mai multe tehnici în
funcţie de temperatura proprie. În afară de masă şi temperatură se mai studiază
termic şi alte proprietăţi dependente de temperatură (mecanice, optice, electrice,
magnetice, etc.).
Metodele termice de analiză se ocupă cu studiul stării termice a
substanţelor şi a shimbărilor care se produc în funcţie de temperatură. Astfel o
substanţă A în fază solidă poate suferi diferite transformări prin încălzire.

1.1. Termogravimetria (TG/TGA)

Analiza termogravimetrică urmăreşte variaţia masei substanţelor solide la

diferite temperaturi şi intervale de timp, prin cântărirea lor după fiecare etapă.
Aparatul este reprezentat în figura 1.

3
 Fig.1. Aparatul pentru analiza termogravimetrică

Instrumentele moderne cântăresc proba continuu în timp ce este încălzită

într-un cuptor în care creşterea temperaturii se realizează cu viteză constantă.
Termobalanţele moderne înregistrează variaţia masei probei în funcţie de
temperatură m=f(T) automat. Se obţin astfel indicaţii asupra transformărilor
însoţite de pierderi de masă, mai rar creşteri (oxidare), pe care le-a suferit
substanţa cercetată pe fiecare interval de temperatură şi de timp.
Curbele TG prezintă paliere (tronsoane orizontale) în intervalele de
temperatură în care nu au loc pierderi de masă (transformare) şi pante de diferite
unghiuri, în funcţie de viteza de încălzire şi de variaţia de masă înregistrată.
O contribuţie importantă în analiza TG au adus-o Clement Duval şi
colaboratorii (1943), care au studiat termogravimetric peste 1000 de precipitate,
corespunzătoare aproape tuturor elementelor care se pot doza gravimetric
(,,inorganic thermogravimetric analysis,,).
Din studiul termogravimetric rezultă că temperatura de uscare sau
calcinare a precipitatelor pentru diferite elemente, depind de natura substanţei
care se tratează termic şi în unele cazuri, de reactivul folosit pentru precipitare,
precipitatul fiind aceeaşi.

1.2. Termogravimetria derivată (ATGD/DTG)

4
 Curba TG (reprezentarea grafică a variaţiei masei în funcţie de
temperatură) este reprezentarea grafică a relaţiei m=f(T) care caracterizează
analiza termogravimetrică.
Curba DTG este reprezentarea grafica a derivatei masei dm/dT, în funcţie
de temperatură. Curba DTG este diferită de curba TG obişnuită.

masa

T (0C)

dm/dT

T’ (0C)
Fig.2. Curba termogravimetrică şi curba termogravimetrică derivată a unei singure
transformări termice

Curba DTG se aseamănă cu curba DTA, dar fenomenele înregistrate sunt

diferite. Dacă se suprapun curbele DTA şi DTG ale aceleaşi substanţe, executate
în aceleaşi condiţii termice, se constată că efectele termice implicând modificări
de masă se suprapun.

1.3. Analiza termodiferenţială (ATD/DTA)

5
 Analiza termică diferențială (DTA) a fost construită la scurt timp după
dezvoltarea termocuplului (1887, Le Chatelier). Acesta a fost făcut pentru
examinarea materialelor diferite.
Analiza termică diferenţială este o tehnică în care diferenţa de temperatură
dintre o probă şi un material de referinţă, este măsurată în funcţie de
temperatură, în timp ce substanţa şi materialul de referinţă sunt supuse unui
program de temperatură controlată.
Temperatura referinţei va creşte proporţional cu temperatura cuptorului.
La fel se întâmplă şi cu proba. În plus, în probă apar variaţii de temperatură când
au loc procese exo- sau endoterme. Procesele exoterme se reprezintă
convenţional ca pozitive, iar cele endoterme ca negative.

Tref./probă (0C) proba referinţa

Proc.exo

Proc.endo

Tcuptor (0C)

Fig.3.Reprezentarea grafică a temperaturii probei şi referinţei în funcţie de

temperatura cuptorului. Curba termică diferenţială (curba DTA)

Curbele DTA pot înregistra transformările în cazul în care căldura este fie
absorbită fie eliberată (deshidratare, decarbonatare, arderea materiale, comanda,
etc).
DTA este utilă pentru o mai bună înțelegere a rezultatelor date de
difracție de raze X, analize chimice și microscopie. Cele mai importante

6
avantaje ale DTA sunt simplitatea sa și o posibilitate pentru a crea condiții
experimentale diferite (presiune înaltă sau vacuum).

1.4. Calorimetria diferenţială (CD/DSC)

Calorimetria de scanare diferențială (DSC) este o tehnică de înregistrare a

energiei necesare pentru a menţine nulă diferenţa de temperatură între o cupă în
care se află proba şi o cupă de referinţă, ambele fiind încălzite sau răcite
simultan cu o viteză controlată.
Se disting trei tipuri de bază ale DSC:
• fluxul de căldură DSC (HF-DSC),
• puterea de compensare DSC (PC-DSC),
• hiper-DSC.
Tipurile de bază sunt primele două. În figura 4 sunt reprezentare aceste
două tipuri ale aparatului DSC.

(a) (b)
Fig.4. Reprezentarea schematică a aparatului DSC: PC-DSC (a) și DTA cantitativ
(Boersma) sau DSC-HF (b).

Dacă proba trece printr-o stare de tranziţie, procesul fiind endo- sau
exoterm, aceasta sau cupa de referinţă vor primi o energie echivalentă astfel
încât să se menţină temperatura egală pentru cele două cupe (probă respectiv
referinţă). Deci rezultatele analizei reprezintă variaţia fluxului termic în timp sau
7
raportat la variaţia temperaturii. Precum analiza termică diferențială (DTA),
scanarea diferențială (DSC) este de asemenea, o tehnică alternativă pentru
determinarea temperaturii fazei de tranziție, cum ar fi punctul de topire, debutul
solidificării, debutul recristalizării, temperatura de evaporare. Cu analiza termică
diferențială (DTA), care este o tehnică mai veche decât calorimetria de scanare
diferențială, rezultatul este o curbă DTA.
Rezultatul lui DSC este o curbă dependentă de fluxul de căldură în funcție
de timp sau de temperatură și prin urmare, este folosit, de asemenea, pentru
determinarea entalpiei, căldurii specifice.

II. Tehnici de termoanaliză pentru probe biologice

2.1. Avantajele analizei termice în studii biologice

8
 Situația recentă din literatură privind metodele termice (ca și tehnici) și
aplicarea lor la problemele biologice este de așa natură încât există o mulțime de
monografii în care se descriu principiile de lucru ale diferitelor tipuri de analiză
termică și calorimetrie.
Comportamentul termic al țesuturilor, spre deosebire de componentele
țesutului, poate fi ușor studiat prin analiza termică. Nu sunt necesare proceduri
de pregătire și astfel structura moleculară de bază poate fi conservată pentru
analiză. Această trăsătură a fost folosită pentru a stabili faptul că calculii biliari
care au fost depozitați în apă la 4° C diferă de cei din organism, întrucât curba
DTA pentru calculii biliari examinați imediat după îndepărtarea chirurgicală
diferă de curbele celor care au fost stocați. Acest lucru arată că rezultatele
obținute de la alte analize de calculi biliari nu pot fi de încredere.
Inițial, tranzițiile termice au fost folosite numai pentru a obține o
perspectivă în structurile de compuși, dar ulterior cererile au fost extinse pentru
a oferi date fiziologice, la fel ca și în studiul interacțiunii lipide-proteine.
Deși dificultatea este experimentarea în măsurarea unor parametrii
termodinamici, căldura de tranziție este ușor măsurată prin DSC.

2.2. Analiza termică a membranelor biologice

Una dintre contribuțiile importante ale analizei termice în biologie a fost

elucidarea structurii de bază a lipidelor bistratificate din membranele biologice.
Studii din anul 1899 a permeabilității suprafețelor celulelor a substanțelor
solubile lipidice conduc la concluzia că aceste membrane au un caracter
predominant lipidic. Folosind jgheaburi nou dezvoltate Langmuir, Corter și
Grendal au propus, în 1925, că membranele biologice sunt bistraturi de molecule
lipidice. Proteinele s-au dovedit a fi un constituent al membranelor și un model,
care este foarte similar cu ceea ce este în prezent acceptat, a membranelor

9
biologice ca bistraturi de lipide cu proteine asociate a fost dezvoltat (fig.1.).
Acest model a fost sprijinit de studii folosind difracție de raze X și microscopie
electronică.

Fig.5. Modelul mozaical membranar

În mijlocul lui 1960, cercetătorii au respins modelul bistratificat al

membranelor biologice sugerând în schimb că acestea au fost compuse din
diferite tipuri de subunități proteice cu lipide asociate. Aplicarea DTA și DSC la
sistemele bistratificate de lipide și la membranele biologice a fost pentru a
dovedi că modelul bistratificat a fost, de fapt, corect.

2.2.1. Lipide bistratificate

Majoritatea lipidelor membranare sunt fosfolipide. Structura acestor
molecule poate fi pur și simplu descrisă ca având o regiune polară, cap, două
lanțuri laterale hidrofobe de hidrocarburi și cozi.

10
 Fig.5. Schema tranzțiilor de fază ale dipalmitoil fosfatidiletanolamină

În apă conformația lor depinde de trecutul istoric, temperatură,

concentrație și tipul de moleculă. În excesul de apă, moleculele formează un
bistrat, cu capetele lor polare spre mediul apos, precum și cozile formând o
regiune hidrofobă în centrul bistratificat. Aceste bistraturi apar în foi concentrice
separate de apă. Ele se comportă ca și particule lichide cristaline, trec printr-o
tranziție reversibilă termic indusă de la o stare cristalină la temperaturi scăzute,
la un lichid dezordonat la temperaturi mai ridicate. Această tranziție termică se
observă ca un vârf endotermic pe o curbă DSC. În funcție de structura chimică a
fosfolipidelor, una sau alta dintre aceste faze este una stabilă la temperatura
camerei. În figura 5, sunt reprezentate două exemple ale schimbărilor care au loc

11
în faza bistraturilor fosfolipidice. Fosfatidiletanolamina (PES) suferă o tranziție
de fază din faza lamelară Lβ la faza Lα. Aceasta nu este un rearanjament pentru
un alt sistem lichid cristalin, dar este în schimb o topire a bistraturilor cu
conservarea conformație lamelare.
Fosfatidilcolinele (PCs), cu lanțuri identice de hidrocarburi saturate, arată
un comportament mult mai complicat deoarece cel puțin două tipuri diferite de
faze cristaline sunt observate.
Temperatura de topire depinde de natura lipidelor și a raportului în care
acestea sunt combinate în membrană. Creșterea numărului lanțurilor duble din
cozile de hidrocarburi scade temperatura de topire, deoarece este perturbată
compactarea moleculelor de lipide. Sistemele care conțin amestecuri de lipide
cu puncte de topire diferite produc tranziții generale.
Efectul raportului în care lipidele sunt combinate în sisteme binare pe
tranziția lichid-cristalin poate fi observat în figura 6.

Fig.6. Scanări DSC asupra amestecurilor de fosfatidilcolină(PC) /

fosfatidiletanolamină (PE)

12
 2.2.2. Calorimetria diferențială a celulelor, membranelor și a lipidelor
bistratificate
Curba DSC (fig. 7a) pentru celule întregi la bacteria Acholeplasma
laidlawii și curba extrasului de membrană (Fig. 7b), care s-au dovedit a fi 50%
lipide și 50% proteine, sunt foarte asemănătoare. Temperaturile endotermice
cele mai mici sunt reversibile. Acest lucru este similar în organisme vii,
preparate cu membrană și la dispersii apoase ale lipidelor membranare extrase.
Este aproape neafectat de denaturarea termică a proteinei, digestia enzimatică a
membranelor, sau chiar de către lipsa de proteine.

Fig.7. Scanări ale DSC la A. laidlawii. (a) celule întregi, (b)membrane înainte de
denaturare termică, (c) membranele după denaturarea termică de proteine, (d) extras al
lipidelor membranare

Similitudinea între curbele de la prima tranziție de membrane și curbele

de dispersii ale fosfolipidelor sintetice sugerează că tranziția este în esență
aceeși tranziție ordonată / dezordonată. Aceasta este, așadar, o dovadă directă a
prezenței unui bistrat. Temperatura primei tranziții poate varia aproximativ 70°
C, de la -20 - 50 ° C, prin includerea acizilor grași în lipidele membranare la A.
laidlawii. Acest lucru nu a avut nici un efect asupra celei de a doua tranziții,
care este ireversibilă și provine din denaturarea proteinelor.
13
 2.2.3. Interacțiuni lipidice-protidice
Membranele biologice sunt compuse din lipide și proteine, lipidele își
construiesc biomoleculele circulare, care este bariera de permeabilitate majoră și
proteinele furnizează funcțiile esențiale biologice. Proteinele pot fi fie proteine
intrinseci înglobate în bistraturi lipidice și având suprafețe polare accesibile la
ambele capete ale bistratului sau sunt în principal legate de suprafața bistratului
prin interacțiuni electrostatice.
Au existat mai multe comentarii privind interacțiunile proteine-lipide.
Faza de tranziție lipidică lichid-cristalin în membranele naturale este de
obicei foarte îndelungată, deoarece bistratul este format dintr-un amestec
complex de lipide si proteine. Studiile DSC pot oferi informații cu privire la
tipul de interacțiuni între proteine și lipide. Acest lucru presupune înregistrarea
vârfurilor de tranziție ca și o funcție a conținutului de proteine în bistratul
lipidic. Dimitrie Papahadjopoulos a sugerat că pot aparea trei tipuri de
interacțiuni de bază. Aceste interacțiuni rezultă din modificările caracteristice în
picurile DSC. Legarea proteinelor la suprafața membranelor prin interacțiuni
electrostatice duce la o creștere a entalpiei de tranziție, ΔHcal și temperatura de
tranziție, Tm. Suprafața de legare a proteinelor și pătrunderea lor parțială în
bistrat scade ΔHcal și Tm, datorită reducerii de hidrocarbon în interacțiunile în
lanț. Al treilea tip de interacțiune de proteine, numit interacțiuni hidrofobe ale
proteinelor membranare integrale, conduce la o scădere liniară a ΔH cal cu
conținut de proteine în creștere, o lărgire a tranziției și o mică schimbare în Tm.
Situația actuală este, cu toate acestea, mult mai complexă deoarece va fi o
combinație a acestor interacțiuni și ar putea exista o suprapunere de alte picuri
DSC.[3]

2.3. Studiile termice asupra lipoproteinelor plasmatice

14
 Lipoproteinele plasmatice sunt particule compuse din lipide solubilizate
de către asocierea cu proteine. Ele constituie o componentă majoră a plasmei din
sânge. Niciuna dintre stările lipidelor fără particule și nici unul dintre modurile
de asociere a lipidelor cu proteinele nu este bine înțeles. Funcția principală a
lipoproteinelor pare a fi transportul și schimbul de lipide. Ele ajută la
menținerea aproximativ 500 mg a lipidelor solubilizate la 100 ml sânge.Au fost
propuse să joace un rol în arteoscreloză.
Lipoproteinele serice sunt de obicei împărțite în patru clase majore
definite de către intervale de densitate. Chilomicronii sunt 98% lipide și 2%
proteine; lipoproteine de densitate foarte scăzută (VLDL), acestea sunt de 90%,
lipide; lipoproteine de densitate scăzută (LDL) sunt 75% lipide și lipoproteinele
cu densitate ridicată (HDL), sunt 40-60% lipide.
Scanările DSC (fig. 8) de ser uman LDL ne dezvăluie o tranziție
reversibilă, centrată la aproximativ 30°C determinând temperatura corpului, care
este neafectată de denaturarea termică a proteinelor. Picul proteinei, la
aproximativ 70 ° C, este ireversibil.

Fig.8. (a) Scanarea DSC al lui LDL nativ, (b) scanarea DSC al lui LDL supus
caldurii, (c) scanarea DSC al lui LDL nativ, (d) dicroismul circular al lui LDL
15
 Superficial, comportarea LDL în curba DSC se aseamănă cu cea a
membranelor biologice. În ciuda conținutului de fosfolipide LDL, picul
temperaturii joase apare cu corelarea tranziției temperaturii de esteri
cholesterolici extrași , decât cu temperatura estimată pentru bistratul
fosfolipidic. Datele calorimetrice și difractia X-ray identifică această tranziție ca
fiind cooperativă, pelicula lichid-cristal la schimbarea fazei lichide, implicând
esterii colesterolici in lipoproteine. Nici o tranziție a bistratului lipidic nu se
poate detecta.[3]
Curbele analizei termice la LDL si HDL, arătate în figurile 8 si 9, diferă
considerabil una faţă de cealaltă. Prin DSC nu au fost detectate tranziţii ale
esterilor colesterolici sau ale bistraturilor în HDL.

Fig. 9 (a) scanare DSC de HDL nativ, (b) scanare DSC a căldurii denaturate HDL,
(c)scanare DSD a lui HDL nativ, (d) dicroismul circular al HDL-ului

Aparent, în ciuda faptului că esterul colesterolic este totuşi considerabil

(50% din lipide în LDL şi 30% în HDL), nu este prezentă o bază suficient de
mare pentru a fuziona.
Dacă toţi esterii colesterolici din LDL contribuie la căldura tranziţiei
lipidelor, LDL şi HDL pot reprezenta în intregime structuri diferite, dacă doar
jumătate contribuie, jumătatea termică inactivă poate exista în aceeaşi stare la
ambele. Proteinele din LDL şi HDL de asemenea se comportă diferit. În timp ce
denaturarea proteinelor din LDL este ireversibilă, în HDL picul proteinic
reversibil rămâne după încălzire, dar are loc la o temperatură mai scăzută decât
în materialul nativ.Majoritatea proteinelor din HDL si LDL diferă chimic şi
16
studiile de DSC ale proteinelor fără lipide din ambele clase ar trebui să clarifice
dacă curba denaturării specifice în HDL este caracteristică pentru proteine sau
este un rezultat al interacţiunii lipidice-protidice.

2.4. Analiza termică a proteinelor

DSC este o tehnică puternică pentru studierea inducerii termale a tranziției

conformaționale a biopolimerilor, asemeni proteinelor și acizilor nucleici. Curba
tipică DSC permite evaluarea parametrilor termodinamici ai procesului de
denaturare. Dependența de temperatură a capacităților căldurii ale proteinelor
native și denaturate, deasupra și dedesubtul regiunii de tranziție, modificarea
capacității de căldură la trecerea, schimbarea entalpiei calorimetrice (ΔHc al),
entalpia efectivă, precum și temperatura de tranziție pot fi obținute din curbă.
Nu există ipoteze bazate pe mecanismul de. Datele termodinamice obținute din
experimentele DSC sunt , prin urmare, fiabile și pot testa mecanismele de
reacție propuse și pot oferi detalii despre aspectele moleculare și despre reacțiile
implicate. O comparație a entalpiei calorimetrice și a entalpiei efective permite
formularea de ipoteze cu privire la natura procesului de denaturare.
Un start important pentru succesul experimentului DSC este prepararea cu
grijă a tuturor soluţiilor. Soluţia tampon trebuie filtrată. Soluţia simplă trebuie să
nu conţină oxigen în special dacă sunt prezente cisteine libere în proteine. Dacă
sunt prezenţi şi liganzi, concentraţia lor trebuie ajustată cu grijă.
Proteina trebuie dializată intens împotriva soluţiei tampon înainte de
masurători. Concentraţiile proteinei tipice care pot fi măsurate prin instrumente
DSC actuale sunt între 0,1 mg/ml la 10 mg/ml.
În cel mai simplu caz curba de căldură a proteinei constă în trei părţi. Sunt
două regiuni care arată în mod evident o temperatură liniară dependentă de
capacitatea căldurii (Cp) separate de un punct (fig. 10). Acest pic reflectă o
primă tranziţie între cele două stări ale proteinelor, aşa numitele stări nativă şi
17
denaturată. Starea nativă este starea funcţională biologică care este populată la
condiţii fiziologice. Aceasta este de asemenea caracterizată de o structură
tridimensională definită. Regiunea de tranziţie este marcată de un pic de
absorbtie a căldurii. Punctul de mijloc al temperaturii tranziţiei este denumit T 1/2
şi a fost denumit punctul la care 50% din molecule au fost denaturate.

Fig. 10. Curba simularii capacitatii caldurii a proteinei. In regiunea de tranzitie

apare punctul caracteristic T1/2 .Capacitatile caldurii extrapolate in stare nativa (Cp,N) cat si
in stare denaturata (Cp,D) sunt indicate prin linii punctate

Din datele termodinamice obţinute de DSC la T 1/2 poate fi făcută o

extrapolare a cantităţilor termodinamice şi la alte temperaturi. Pentru o
extrapolare validă, acurateţea Cp,N (T) si Cp,D (T) este critică. De obicei parametrii
termodinamici la temperaturi sub T1/2 sunt de interes. Capacitatea caldurii a starii
denaturate a fost estimata de-a lungul intervalului larg de temperatura folosind
informatii peste T1/2. Totusi nu reprezinta o problema daca, la temperaturi
scazute, starea denaturata rece devine observabila si permite masurarea
capacitatii caldurii a starii denaturate ca si in cazul mioglobinei la un pH scazut.
Functia Cp,D trebuie sa fie determinata de proceduri alternative.
O astfel de metoda este pentru a estima capacitatea caldurii, a starii
denaturate prin folosirea compusilor cu greutati moleculare mici care modeleaza
structura proteinica si lantul amino acidic. Astfel de compusi pot fi molecule

18
organice mici cu structuri care sunt similare cu acelea ale sistemului. De
exemplu, este necesarea folosirii CH3OH pentru modelarea structura serinei.
Probabil cele mai bune estimari ale structurii sunt date de utilizarea unor peptide
mici. Intrucat schimbarea capacitatatii caldurii asociata cu denaturarea proteinei
este proportionala cu cresterea ariei accesibile a solventului. Curba Cp,D (T) ar
trebui sa fie mai mare decat functia capacitatii caldurii starii native C p,N (T), dar
mai mica decat curba calculata a capacitatii caldurii .
Un exemplu al unei proteine la care valoarea calculata si masurata C p,D (T)
sunt foarte asemanatoare a fost dat de catre Schoppe (fig.11).

Fig.11. Capacitatea caldurii al proteinei barstar wt si capacitatile estimate din doua

sisteme model: molecule organice mici (linie punctata) si peptide (linie punctata mare)

2.5.Analiza termică a acidului nucleic dezoxiriboză (ADN)

Informația genetică extracromozomială a multor bacterii este stocată în

structura plasmidelor.
Plasmidele sunt molecule esențiale circulare a ADN-ului, respectiv
duplexul ADN închis circular covalent. Acestea sunt responsabile pentru
anumite proprietăți adiționale ale celulei, de exemplu rezistența la medicamente
sau abilitatea de a produce bacteriocizi. Plasmidele nu apar ca un dublu helix
circular în celulă, dar manifestă răsuciri superhelicale negative. Replicarea de
19
ADN necesită desfășurarea dublului helix care rezultă din introducerea
superrăsucirii pozitive în fața bifurcației replicării.
Variațiile cu temperatura a capacității căldurii aparent specifice și
absorbției la 260 nm, au identificat aceleași tranziții. Schimbările
conformaționale induse de temperatură au loc la temperaturi diferite pentru
molecule circular deschise și superrăsucite. Inițial au fost observate una din
tranzițiile cooperative mici la 79°C și începutul unei tranziții aparent majore la
90°C. Picul la 79°C este cauza impurităților ADN-ului deschis circular în ADN-
ul circular închis covalent. Forța ionică a soluției a fost scăzută pentru a
destabiliza ADN-ul prin creșterea repulsiei electrostatice a grupurilor fosfatice.
Tranziția temperaturii ADN-ului deschis circular a fost scăzută la 68°C, dar a
doua tranziție a fost în jurul temperaturii de 100°C. Ionii perclorați au fost
adăugați pentru a cauza destabilizările viitoare. Efectul net al scăderii forței
ionice a soluției amortizoare și adiția ionilor perclorați a fost descreșterea
temperaturii de tranziție închise circular la 56°C și tranziția ADN-ului circular
închis covalent la 89°C.
Temperatura Tm si T1/2 a excesului maxim al capacității căldurii la 50%
hipercromicitate, coincide pentru fiecare dând seturi de condiții dar dependente
de forțele ionice ale soluției tampon folosite. Valorile cele mai înalte obținute
pentru Tm și T1/2 la forma covalent închisă relativă pentru forma deschisă,
demonstrează stabilitatea rezultată pentru constrângerea impusă la ADN de către
închiderea inelului.

2.6.Analiza termică a țesutului conjunctiv

Țesutul conjunctiv poate fi clasificat ca un gel semifluid pentru a

explica funcțiile și proprietățile sale. Acesta înconjoară elementele celulare și
fibrilare de lungimi diferite, forma și număr care alcătuiesc corpul. Substanța de
bază este compusă în principal de proteoblicani. Aceștia sunt macromolecule
20
având conținutul format din lanțuri de glicozoaminoglicani (GAG) atașați la
miezul proteinei. Colagenul și elastinul din proteine formează componente
fibrilare. Analizele termice ale materialelor nu necesită alte proceduri de
preparare. Materialul poate fi studiat fără proceduri de purificare complicate
ceea ce înseamnă că structura moleculară de bază poate fi depozitată (fig.12 şi
fig. 13).

Fig. 12. Structura țesutului conjuctiv / Fig. 13. Curbele termice alte monstrelor de țesut
conjunctiv

Bihari-Varga a fost conducătorul unui studiu asupra schimbărilor care

apar în componentele extracelulare ale ţesutului conjunctiv, cu utilizare continuă
si sub induceri experimentale si condiţii patologice. Studiul a arătat că ataşarea
structurală a apei şi a concentraţiei glicozaminoglicanilor descreşte semnificativ

21
cu vârsta în diferite tipuri de ţesut conjunctiv. Compoziţia GAG se alterează
gradat. Există o corelaţie între acumularea de înlănţuiri încrucişate în proteinele
structurale de îmbătrânire şi stbilitatea termică a ţesutului mostră.
DTA, DTG și TG au fost folosiți pentru a studia efectul unora dintre
compușii nucleofili când s-au administrat pe animale experimentale. Acești
compuși au fost găsiți pentru a inhiba maturarea proteinelor fibrilare nou
sintetizate. Elastinul și colagenul defectivi pot fi demonstrați, întrucât curbele lor
termale diferă de acelea ale proteinelor non-defective corespunzătoare.

2.7. Analiza termică a calculilor (pietre) biliari

Vezica biliară este o extindere a ductului biliar extrahepatic care reține,

concentrează și descarcă bile micelare în duoden de-a lungul perioadei digestive.
Orice debalansare prelungită între colesterol, fosfolipide și componente ale
acidului biliar conjugat duc la formarea pietrei biliare. Aceste pietre rămân
neobservate până când sunt forțate să treacă în circuitul cistic. Când obstrucția
circuitului cistic este prelungit, poate rezulta o inflamare sau cistită acută.
Există trei tipuri majore de pietre biliare, numite pietre mixte de
colesterol, pietre de colesterol și pietre pigmentate. Cele mai comune sunt
pietrele mixte de colesterol și conțin cel puțin 70% colesterol.
Termogravimetria poate fi folosită pentru a determina rații diferite de
colesterol, carbonat de calciu și oxalat de calciu deoarece fiecare se descompune
la temperaturi diferite semnificative (fig. 14 - 17).

22
 Fig. 14.Curba termogravimetrică a colesterolului

Fig. 15. Curba termogravimetrică a oxalatului de calciu

Fig. 16. Curba termogravimetrică a carbonatului de calciu

23
 Fig. 17. Curba termogravimetrică a unui mix de colesterol (20%), oxalat de calciu
(40%) și carbonat de calciu (40%)

TG poate fi folosit pentru a determina tipul pietrelor. Alexander a

studiat douăzeci de pietre și fiecare conținea colesterol ca și componentă majoră.
La acestea, cinetica degradării nu a fost afectată de prezența altor constituienți și
de determinarea compoziției pietrelor.
Caracteristicile colesterolului anhidru (ACh) și colesterolului
monohidrat (ChM) cristalizat din soluțiile de acetonă cu apă sau soluție de
etanol 95%, au fost studiate folosind măsurători cu DSC, TG, DTA, difracția X-
ray și infraroșu.Van Putter a raportat în 1968 faptul că colesterolul anhidru
emană o fază de tranziție reversibilă la aproximativ 35°C cu o tranziție a
entalpiei la aproximativ 2,9 kJ mol-1 . Tranziția este atribuită pentru a
ordona/dezordona fenomenul în lanțul lateral al lui C(17). Dubler and Kamber
au raportat faptul că colesterolul monohidrat arată o tranziție ireversibilă și
endotermică la aproximativ 80°C și intensifică eliberarea apei la 121°C în curba
DSC. A fost sugerat faptul că doar colesterolul monohidrat se găsește în solidele
biogenetice. Aceasta a implicat faptul că faza de tranziție se găsește în
colesterolul anhidru la 35°C dar se poate să nu fie relevant pentru colesterolul
precipitat în mediu biologic.

24
 Curbele DSC ale pietrelor biliare măsurate imediat după îndepărtarea
chirurgicală totuși arătând clar tranziția la 35°C. Examinarea valorilor entalpiilor
corespunzătoare, care sunt mult mai mici decât în colesterolul anhidru pur,
indică faptul că ambele tipuri de colesterol există în pietrele biliare.

2.8. Analiza termică a melaninei

Termogravimetria a arătat că melanina homopolimera- un tip aromatic,

este stabil termic până la 31°C. Există o degradare între 31°C și 106°C cu o
pierdere masivă de 11,9%. Palierul curbei TG (probabil în aer) între 106°C și
114°C sugerează existența unui intermediar al compoziției definite. Creșterea
temperaturii până la 298° duce la descompunerea unei molecule intermediare.
Peste această temperatură pierderea masei este abruptă dar devine foarte lentă
după 332°C. La 396°C este o pierdere de masă finală de 8,66% ceea ce arată o
combustie incompletă.
Degradarea melaninei peste 31°C, care este mai mică decât
temperatura corpului sugerează că această moleculă nu poate exista ca atare în
condiții fiziologice. În shimb, este probabil asociată cu peptidele, ca de exemplu
lipoproteinele din celulele keratinocite, printr-o rețea masivă de lanțuri de
hidrogen (fig. 18). Aceasta rezultă în formarea unei structuri complexă stabilă
termic (melanolipoproteina). Aceasta exfoliază keratinocitele și ascunde stratul
cornean. Culoarea pielii poate fi detectabilă până la condiția viabilă a
melanolipoproteinei din epidermă.

25
 Fig. 18. Melanolipoproteina- împărțirea structurii în piele

Mărirea temperaturii în boala numită vitiligo, boală a pielii, schimbă

starea fiziologică a melanolipoproteinei. Aceste schimbări pot cauza
degenerarea acestei biomolecule complexe rezultând depigmentarea pielii. Acest
fenomen rar nu poate fi un rezultat direct al opririi bruște a melanocitelor în a
produce pigmenți de melanină. În mod contrar, dispariția preformării culorii
pielii trebuie să fi rezultat din degenerarea melaninei.[3]

2.9. Studiile structurale și funcționale ale proteinelor din mușchi

DSC este metoda cea mai eficientă și frecvent folosită pentru a studia
desfășurarea termică de proteine. În ultimii 15 ani a fost un succes abordarea
DSC pentru studiile structurale şi funcționale de miozină, actină și tropomiozină
- proteinele principale ale diverselor sisteme biologice de motilitate - inclusiv
toate tipurile de mușchi. Interacțiunea ciclică între capetele de miozină cu
filamentele de actină, care este însoțită de hidroliză de ATP în capete și
reglementate de tropomiozină, este baza mecanismului molecular al unui număr
de evenimente în motilitatea biologică, de la transportul intracelular la contracția
musculară.

26
 Miozina este un reprezentant al studiului considerabil din ultimii ani
asupra "motoarelor moleculare", adică proteine care iau naștere în celulele vii în
transducția energiei chimice de hidroliză ATP în lucru mecanic. Miozinele sunt
foarte diverse, atât în funcție de structura lor cât și în funcție de rolul lor în
celulă. Pe baza analizei filogenetice toate miozinele sunt împărțite în 17 clase.
Trăsătura caracteristică a tuturor miozinelor este prezența unei părți globulare
foarte conservate (așa-numitul domeniu motor) responsabil pentru legarea și
hidroliza de ATP, interacțiunea cu actina, și transducția de energie chimică în
lucru mecanic.
DSC a fost folosit pentru studiile structurale pe miozină de la sfârșitul
anilor 1970. Cu toate acestea, până la sfârșitul anului 1980 a fost folosită această
metodă tot mai exclusiv pentru studii de desfășurarea termică a părții tijei
helixului a miozinei musculare și fragmentele sale izolate. În 1979 Potekhin a
descris pentru prima dată denaturarea termică a părții tijei izolate a miozinei
musculare scheletice de la iepure și unele fragmente, studiate de DSC. Tija de
miozină s-a desfășurat într-o gamă largă de temperatură, de la 35 la 65°C și
patru maxime au fost clar revelate pe curba calorimetrică. După deconvoluția
curbei calorimetrice pentru tija de miozină într-o tranziție termală diferită, șase
astfel de tranziții au fost demonstrate, cu maxime de la 43, 46, 49, 51, 54 și
60°C. Topirea fragmentelor izolate sunt corelate foarte bine cu tranziții termale
bine definite ale capetelor de miozină. Ca urmare a utilizării DSC, regiunile
independente de topire (domenii calorimetrice) au fost descoperite în tija
scheletică de miozină.
DSC a fost folosit cu succes pentru sondarea schimbările structurale
care au loc în capul miozinei datorită legării sale puternice la F-actină în
prezența ADP. Aceasta a demonstrat că legarea structurii S1 la F-actină în mod
semnificativ, intensifică stabilitatea termică a structurii miozinei S1 prin
deplasarea tranziție termice a lui S1 cu aproximativ 5°C la o temperatură mai
mare. Pentru o mai bună separare a tranzițiilor termice ale F-actinei și actina-
27
capul miozinei pe curba DSC, s-a folosit în experimente recente ale DSC,
stabilizarea F-Actinei cu ajutorul faloidinei, o peptidă toxică care provine din
unele ciuperci otrăvitoare. În acest caz, F-actină se topește la temperatură foarte
ridicată, la aproximativ 80°C, care permite un studiu mai detaliat al parametrilor
desfășurării termice a capului miozinei atașat la F-actină (Fig. 19). Fixarea
actinei induse la capul miozinei este exprimat în schimbarea pronunţată a
tranziţiei sale termice spre temperarură ridicată. Se utilizează această schimbare,
ΔTm, ca şi o măsurătoare relativă pentru modificările structurale din capul
miozinei. Mărimea ΔTm depinde de sursa miozonei: variază de la 5 la 6°C la
scheletul de iepure S1 (fig. 19B).

Fig.19. (A) Curbele DSC experimental al scheletului de iepure S1, F-actină

stabilizată prin faloidină și complexul acestora obținut în prezență de ADP. (B) Excesul
capacității căldurii al lui S1 în prezență și absență de F-actină

Abordarea DSC oferă noi oportunități unice pentru studiile structurale și

funcționale asupra proteinelor musculare. Aceasta permite demonstrarea foarte
clară și cercetarea detaliată a schimbărilor structurale globale care au loc în
28
capul miozinei în timpul reacției ATP-azei corespunzătoare interacțiunii cu
actina.

2.10. Analiza termică la plante

Analiză termică a plantelor - în atenția generală a comunității științifice,

deși nu sunt comparabile cu microorganisme, animale mici și animale sau
țesuturi umane și celule izolate – nevertebratele oferă o mare varietate de
aspecte. Acestea înlocuiesc diviziunea de la țesutul plantei peste organe la plante
întregi, de la termometrie simplă sau termografie peste combustie și calorimetrie
de scanare diferențială la experimente adiabatice și izotermale, de la germinarea
semințelor la reglementarea biochimică a producției de energie termică.

2.10.1. Analiza termică pe plante întregi și țesuturile plantelor

Calorimetria plantelor a fost întotdeauna presupusă a fi o știință dificilă,
deoarece plantele sunt entități poichilotermice vii cu o suprafață nefavorabilă a
raportului de volum.
Plantele au nevoie de lumină de lungimi de undă speciale pentru a fi
fotosintetice active. Ratele metabolice sunt - cu câteva excepții – puțin
comparative cu cea a animalelor și în special a microorganismelor. Mai mult
decât atât, evaporarea cu gradul său ridicat de consum de energie joacă un rol
esențial în viața plantelor și poate ascunde toate celelalte semnale calorimetrice
dacă nu sunt atent ajustate. Tabelul 1 oferă o listă a ratei fluxului de căldură de
la diferite plante sau părți de plante, împărțit în non-termogenice și termogenice.
Tabelul 1. Câteva dintre țesuturile selectate, organe și plante întregi și masa lor
specifică, ratele de producție a căldurii (p) per greutate umedă exprimată în grame (d.w. =
greutate umedă) la temperatura ambientală Ta sau cea a organului (*).Prima parte: Plante
non-termogenice, partea a doua: Plante termogenice în stadiul normal. În câteva cazuri
producția de căldură a fost calculată prin consumarea O2 sau producția de CO2

29
 Dacă senzorul de temperatură este luat ca o parte reală a analizei termice
și afirmațiile calitative sunt permise, JBA Lamarck a fost primul care a
contribuit la investigații termice pe plante. Specia Arum (rodul pământului)
aparține familiei plantelor termogenice care arată o explozie metabolică în
timpul înfloririi.
Probabil primele rezultate calorimetrice au fost publicate de Rodewald la
sfarșitul anului 1880. El a investigat plante de formă sferică (mere, gulie, ceapă)
și prin distribuirea unui termopil de 12 sau 36 de cupluri peste suprafață pentru a
determina diferența de temperatură dintre eșantionul biologic și mediu constant
(fig.20). Fluxul de căldură corespunzătoar a fost calculat cu regula de răcire a lui
Newton, după o calibrare sofisticată.

30
 Fig.20. Distribuția cuplurilor termofile în tandem cu suprafața unui măr. În primul
experiment au fost folosite 12 termocupluri, în celălalt 36

În ciuda succesului experimentelor pe plante cu calorimetrul fiolă, Școala

Lund a dezvoltat un instrument de perfuzie de gaz pentru țesuturi de plante în
condiții de întuneric, o combinație de două calorimetre gemene de flux de
căldură cu 4,5 ml de perfuzie. Prima unitate găzduiește proba biologică, iar a
doua CO2 captivant de lichid care disipă -97 kJ mol-1 de căldură.
Plantele brute comerciale, materiale constând din frunze, flori, rădăcini,
rizomi și scoarță de copac, au fost încălzite până la 900 ° C, la o rată de 5 K min -
1
și s-au obținut curbele DTA, TG și DTG. Mai mult, elementele non-metalice și
elementele metalice din probe au fost determinate. A devenit evident faptul că în
majoritatea cazurilor în care monstrele prelevate de la aceleași specii de plante
dau rezultate similare în cadrul celor cinci tipuri de material vegetal enumerate
mai sus. Figura 21 prezintă un tipic set de curbe (T: temperatura probei) pentru
trei flori diferite.

31
 Fig. 21. Curbele DTA,T,TG, DTG obținute în timpul descompunerii termice a 3 flori:
A:Iarbă neagră (Calluna vulgaris); B: Podbeal (Tussilago farfara L.); C: Coada șoricelului
(Achilla millefolium L.). Dimensiunea eșantionului aproximativ 100 mg, rata de încălzire 5 K
min-1. Curba DTA constă dintr-un pic slab endotermic și două picuri exoterme pronunțate

Datele spectrometrice de masă simultane furnizează informații despre

produsele volatile cu greutate moleculară mică a pirolizei, ca funcție a
temperaturii și astfel, împreună cu curbele DTG dau de asemenea, informații
despre mecanismul de degradare care stă la bază. Acestea sunt esențiale pentru
înțelegerea și optimizarea diferitelor tehnici de conversie a biomasei.

2.10.2. Termografia IR
Termografia infraroșie de culori-artificiale este bine introdusă în diverse
domenii de industrie, cercetare și medicină (inclusiv medicină veterinară), dar
doar recent s-a folosit mai intens pentru investigații de suprafață la plante.
Radiația IR detectată este proporțională cu distribuția temperaturii pe suprafața
obiectului. Camera transformă această imagine IR într-o imagine de culori-
artificiale în spectrul vizibil.

32
 Unul dintre cel mai mare stres la plante este înghețul, un efect de
importanță enormă pentru plantele sălbatice, precum și pentru culturi și astfel,
pentru agricultură.
Congelarea la plante este însoțită de o eliberare de căldură (exotermă)
și temperatura crește până la 1 K, care poate fi ușor de detectat de către
termografie (figura 22).

Fig. 22. Frunze de Ilice (Ilex sp.) în timpul înghețării prezentate în culori nestatornice
la un interval de temperatură de 2 K. Poza B a fost luată la aproximativ 3 min după poza A.
Albastrul pal în zonele albicioase (A, B) indică un efect inițial exotermic de intensitate
scăzută, culorile gălbui (B) indică un efect exotermic mai puternic. Săgețile de la apă indică
picături puse pe frunze înainte de începerea răcirii.

În cursul investigațiilor termoanalitice de seră pe crinul tropical gigant

de apă Victoria cruziana, termografia IR a fost aplicată intens, pentru flori,
precum și pentru structura de frunze plutitoare uriașe. V.cruziana și V.
amazonica cresc temperatura florii lor de până la aproximativ 10 K față de
mediul înconjurător și eliberează un miros dulce atractiv de ananas sau salată de
fructe. Cel mai termogenic țesut se găsește în rezistența interioară, care nu este
direct vizibil din exterior. Astfel, imaginea în infraroșu (fig. 24) prezintă partea
33
caldă (33,5 ° C) în jurul "tunelului", care duce prin paracarpele în camera de
flori și care a fost închis în momentul în care fotografia a fost făcută. Ca floare a
fost de 10 cm deasupra apei; contează diferența de temperatură față de aer (24.0
° C) și nu față de cea a apei (31.0 ° C).

Fig.24. Acvtivitatea termogenică a florii seara a gigantului nufăr V. cruziana în

culoare artificială. La temperatura aerului și a apei de 24,0 și 31.0 ° C, respectiv, centrul
inflorescenței prezintă o temperatură de la 30.9 la 33.5, cu mult peste temperatura aerului.
Zona albă în colțul din stânga sus reprezintă brațul de investigat.

În ultimii ani, calorimetria la plante și-a terminat inactivitatea, care a

durat mai mult sau mai puțin continuu de la începutul secolului trecut. Noul
calorimetru sofisticat permite investigații care au fost excluse înainte, iar
împreună cu alte instrumente specifice oferă mai multe informații decât
colectarea anterioară doar prin calorimetrie.

Concluzii

34
 În aplicațiile analizei termice în biochimie și biologie, limitele științelor
fizice, chimice și biologice se îmbină.
 Procesele biologice, cum ar fi procesele biochimice, sunt guvernate de
importanța energiei și multe informații valoroase pot fi obținute prin
studii termodinamice.
 Analiza termică a fost aplicată la mai multe sisteme biologice diferite, cu
diferite grade de succes.
 Odată cu dezvoltarea tehnologiei informatice și a modelelor matematice,
soluția profilelor de degradare a complexului termic devine posibil și
orizonturile aplicațiilor analizelor termale ale sistemelor biologice sunt
lărgite.
 Analiza termică a sistemelor biologice va continua să fie dependentă de
alte tehnici non-termice.
 Schimbările de temperatură în cadrul mediului natural sunt, de obicei,
prea mici pentru a iniția schimbări în pierderea de masă, astfel încât
informația obținută este, de obicei, utilizată doar ca o indicație a
stabilității compușilor.

Bibliografie

35
1. Institute of biological sciences University of Wales Edward Llwyd building
aberystwyth, “Handbook of thermal analysis and calorimetry”, vol. 4, “From
macromolecules to man”, Elsevier, Uk, 1999;
2. Grega Klančnik, Jožef Medved, Primož Mrvar, “Differential thermal analysis
(DTA) and differential scanning calorimetry (DSC) as a method of material
investigation”, Materials and Geoenvironment, Vol. 57 (2010) 127–142;
3. L. A. Collett, M. E. Brown, “Biochemical and biological applications of
thermal analysis”, Journal of Thermal Analysis, Vol. 51 (1998) 693-726;
4. Dѐnes Lӧrinczy, “The nature of biological systems as revealed by thermal
methods”, vol.5, Ungaria;
5. Institute for Building Materials, “Thermal analysis techniques applied in
concrete science”, 2000.

36