Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
LP 6. Examenul Microscopic Al Bacteriilor
LP 6. Examenul Microscopic Al Bacteriilor
coloratii.
Tehnica execuţiei frotiului din produse patologice si culturi.
Coloraţia cu albastru de metilen, coloraţia Gram, coloraţia Ziehl-Neelsen.
1
sau cultura este orientată în sus; ca o modalitate de control, atingem dosul mâinii cu
lama flambată iar temperatura atinsă prin flambare nu trebuie să fie mai mare decât pe
care o putem suporta
- frotiul fixat este gata pentru colorare
Executarea frotiurilor din p.p. cu consistenţă solidă sau din culturi microbiene
realizate în mediu de cultură solid
- după ce am flambat lama, o aşezăm cu partea flambată în sus
- cu ajutorul flaconului cu picurător sau cu ansa bacteriologică sterilizată şi răcită
depunem în centrul lamei o picătură de soluţie salină fiziologică sau apă distilată
- sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească
- prelevăm aseptic p.p. / un fragment din colonie şi depunem produsul în picătura de
fluid de pe lamă
- omogenizăm foarte bine p.p. / fragmentul de colonie în picătura de fluid
- procedăm ca mai sus pentru întinderea, uscarea şi fixarea frotiului
Executarea amprentelor de organ / alte p.p.
- flambăm lama
- cu partea flambată atingem suprafaţa de secţiune a organului respectiv
- lama se poate aplica şi pe suprafaţa de secţiune a unor prelevate bioptice sau obţinute
prin necropsie
- procedăm ca mai sus pentru uscarea şi fixarea frotiului
Colorarea frotiurilor
În vederea colorării avem nevoie de o trusă pentru colorare (stativ de colorare, coloranţi
conform “reţetei” de colorare, apă distilată sau apă curentă pentru spălare, stativ de uscare).
Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent coloraţiile cu
albastru de metilen (A.M.), Gram şi după caz, Ziehl-Neelsen.
În cazul multora dintre coloraţiile uzuale au fost realizate diferite modificări în funcţie de
experienţa autorilor şi scopul urmărit. De ex. coloraţia cu A.M poate avea următoarele
variante:
- albastru de metilen Löffler pentru cele mai multe coloraţii simple sau ca un al doilea
colorant în coloraţia Ziehl-Neelsen
- albastru de metilen policrom pentru evidenţierea Bacillus anthracis în p.p., pentru
corynebacterii sau înlocuind coloraţia de mai sus
- albastru de metilen (varianta Wayson) pentru p.p., cu o sensibilitate mai bună decât
utilizarea A.M. Löffler etc.
Coloraţia cu albastru de metilen
- acoperim frotiul cu soluţie de albastru de metilen, pentru 3-4 minute (nu are rost să
acoperim cu colorant lama în întregime)
- spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
- aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare
cu sugativă sau hârtie de filtru
- examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm
Coloraţia Gram
- diluăm într-un recipient fucsina (9 părţi apă distilată / 1 parte fucsină)
- acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de genţiană din punct de
vedere istoric), pentru 1-3 minute (nu are rost să acoperim cu colorant lama în
întregime)
- îndepărtăm colorantul
- acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute
- îndepărtăm lugolul
2
- acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonă (1 parte acetonă / 3 părţi alcool de
96º) pentru un timp foarte scurt, 7-8 secunde
- spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet
- acoperim frotiul cu fucsina diluată 1/10 pentru 1 minut
- spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
- aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare
cu sugativă sau hârtie de filtru
- examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm
Coloraţia Ziehl-Neelsen
Este o coloraţie utilă în identificarea prezenţei de bacili acid-alcool rezistenţi (BAAR),
solubilizând peretele bacterian prin creşterea temperaturii, facilitând penetrarea colorantului.
- punem frotiul uscat şi fixat pe un suport situat deasupra tăviţei de colorare
- acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată (filtrată extemporaneu)
- trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperită de fucsină, până începe emiterea de
vapori (nu atingem temperatura de fierbere). În cazul în care lama nu mai este
acoperită complet cu fucsină, adăugăm colorant. Timpul de lucru este de 10 minute,
perioadă în care repetăm de 3 ori operaţia de încălzire a lamei până la emiterea de
vapori.
- spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet
- adaugăm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml
alcool etilic 90-95º), pentru 2-3 minute
- spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
- recolorăm cu albastru de metilen, 1 minut
- spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
- aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare
cu sugativă sau hârtie de filtru
- examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm.