Adaugarea fluorului in compozitia materialelor dentare de restaurare influenteaza

formarea biofilmului oral?

Andrei Ionescua, Eugenio Brambillaa, Sebastian Hahnelb,∗

a Department of Biomedical, Surgical and Dental Sciences, University of Milan, Italy

b Poliklinik für Zahnärztliche Prothetik und Werkstoffkunde, Leipzig University, Leipzig, Germany

Abstract

Obiective. Investigarea influenței reîncărcării materialelor de restaurare dentare cu fluor în formarea

biofilmului. Metode. Specimenele produse dintr-un ciment ionomer de sticlă cu vâscozitate ridicată
(HVGIC), un ciment ionomer din sticlă modificat cu rășină (RMGIC) și un compozit pe bază de rășină
(RBC) au fost alocate aleatoriu incubării în salivă artificială fie pentru o săptămână (AS-1) ), timp de cinci
săptămâni (AS-5), timp de cinci săptămâni, inclusiv perierea de două ori pe zi cu pastă de dinți NaF de
1450 ppm (perie AS-5), sau expunerea o singură dată la 5000 ppm NaF după cinci săptămâni de incubare
(AS-5 -exp). S-a utilizat ca referință smalțul uman. A fost determinată rugozitatea suprafeței și eliberarea
de fluor din epruvete; Formarea biofilmului a fost simulată folosind modele microbiologice mono- sau
multispecie și analizată folosind o abordare bazată pe MTT și microscopie confocală cu scanare laser.
Rezultate. Formarea biofilmelor monospecie a fost redusă semnificativ pe HVGIC în comparație cu
RMGIC și RBC. De asemenea, a fost redus la HVGIC și emailat după tratamentul cu fluor în grupurile AS-
5-brush și AS-5-exp în comparație cu AS-5. Aceste efecte s-au manifestat în special după 24 de ore și mai
puțin pronunțate după 48 de ore de formare de biofilm. În modelul microbiologic multispecie, observații
similare au fost identificate pentru HVGIC, în timp ce pentru smalț s-a observat o reducere semnificativă
a formării biofilmului în grupele AS-5-brush și AS-5-exp. Nu a fost identificat niciun efect semnificativ al
tratamentelor cu fluor pentru RMGIC și RBC, indiferent de modelul microbiologic aplicat. SEMNIFICAŢIE.
Aceste date indică faptul că formarea biofilmului pe suprafețele unui ciment ionomer de sticlă și smalt
poate fi influențată în mod relevant de tratamentul cu fluor. Smaltul poate servi drept rezervor de fluor,
care necesită reîncărcare periodică.

Cuvinte cheie: biofilm, bioreactor, compozit pe bază de rășină, fluor, ciment ionomer de sticlă,
Streptococ

1. Introducere

Indiferent de materialul de restaurare folosit, caria secundară este încă unul dintre cele mai frecvente
motive de eșec pentru restaurările dentare. Este strâns legat de prezența biofilmelor cariogene pe
suprafața unei restaurări dentare [1]. O parte relevantă a cercetării stomatologice contemporane se
referă la dezvoltarea și analiza materialelor de restaurare cu susceptibilitate scăzută la aderarea
microorganismelor cariogene; care are ca scop îmbunătățirea ratelor de supraviețuire a restaurărilor
dentare. Cimenturile cu ionomer de sticlă (GIC) aderă micromecanic și chimic la țesuturile dinților și
eliberează fluorură și alți ioni precum sodiu, fosfat și silicat [2–5]. În timp ce GIC-urile au fost inițial
folosite ca materiale de restaurare provizorii, GIC-urile moderne cu vâscozitate înaltă pot fi de asemenea
folosite pentru fabricarea restaurărilor permanente. Datorită proprietăților chimice, GIC-urile
interacționează atât cu țesuturile naturale ale dinților, cât și cu biofilmul de pe suprafața lor, motiv
pentru care pot fi considerate materiale bioactive. În ceea ce privește influența fluorului eliberate din
materialele de restaurare asupra formării de biofilm pe suprafața lor, GIC-urile prezintă un efect de
explozie de fluor, ceea ce presupune că eliberarea de fluor din aceste materiale este inițial ridicată și
scade rapid cu timpul [6]. Acest fenomen sugerează că materialele de restaurare pot inițial să dezvolte
inițial și proprietățile biofilmelor pe suprafața lor. Deși s-a discutat în mod controversat dacă nivelurile
de fluor eliberate din GIC sunt prea mici pentru a avea un impact relevant asupra biofilmelor orale [7],
mai multe studii de laborator și clinice au identificat o formare mai mică de biofilm la suprafață sau în
apropierea directă a GIC [8,9]. Un studiu recent a sugerat o corelație semnificativă între valorile de fluor
eliberate din GIC și proprietățile biochimice și fizice ale biofilmelor Streptococcus MUTANS pe suprafața
acestor materiale [10]. Cu toate acestea, investigațiile de la grupurile noastre au indicat că corelația
dintre aceste variabile nu este la fel de simplă, deoarece eliberarea de fluor nu este singurul parametru
care modulează formarea biofilmului S. MUTANS pe aceste materiale. Cu toate acestea, studiile noastre
au coroborat impactul fluorului eliberat din GICs asupra biofilmelor și au indicat că impactul fluorurii
asupra formării biofilmului de S. MUTANS a fost deosebit de pronunțat în primele perioade de formare a
biofilmului. Corelațiile cu proprietățile suprafeței, cum ar fi rugozitatea sau energia fără suprafață, care
sunt utilizate în mod obișnuit pentru a explica formarea biofilmului, au fost slabe [11,12]. Studiile
anterioare au evidențiat faptul că GIC-urile pot fi reîncărcate în mod eficient cu soluții sau pastă de dinți
conținând fluor [13,14], totuși efectul reîncărcării materialelor de restaurare dentare cu fluor pe
formarea biofilmului pe suprafața lor nu are niciodată, la cunoștința autorilor, niciodată a fost adresat.
Astfel, obiectivul prezentului studiu de laborator a fost de a cerceta impactul reîncărcării mai multor
materiale dentare de restaurare cu fluor asupra S. MUTANS și formării biofilmului multispecie. Ipotezele
studiului au fost că (1) reîncărcarea materialelor de restaurare cu fluor scade formarea biofilmului pe
suprafața lor și (2)

acest efect depinde de timp, biofilm și material.

2. Materiale și metode

Pregătirea exemplarului

Probele standardizate au fost preparate dintr-un GIC cu vâscozitate ridicată (HVGIC), un GIC modificat cu
rășină (RMGIC) și un compozit pe bază de rășină convențional (RBC) (tabelul 1). Pentru prepararea unui
singur eșantion, o cantitate standardizată din fiecare material a fost introdusă într-o matriță din oțel
fabricată la comandă, cu un diametru de 6,0 mm și o înălțime de 2,0 mm, acoperită cu o bandă de acetat
de celuloză (Mylar®) și condensată împotriva unei farfurie de sticlă până la întărire. Probele RMGIC și
RBC au fost tratate ușor in contact direct timp de 40 de secunde folosind o unitate de întărire a luminii
de mână (SDI Radii plus, SDI, Bayswater, Australia; 1500 mW / cm2). Dintii umani anteriori care au fost
extrasi din motive clinice au fost obtinuti de la Unitatea de chirurgie orala de la Departamentul de Stiinte
Biomedicale, Chirurgicale si Dentare (Milano, Italia), imediat inghetate dupa extractie si decongelate
inainte de utilizare. Plăcile rotunde de smalț cu un diametru de 6,0 mm și o grosime de 2,0 mm au fost
tăiate de pe suprafețele labiale folosind un burd cu diamant de trefină răcit cu apă (INDIAM, Carrara,
Italia) și au fost apoi depozitate în salivă artificială. Toate eșantioanele au fost supuse unui protocol
standardizat de lustruire, inclusiv lustruirea cu hârtie de șlefuire de 1000/4000 granule (Buehler, Lake
Bluff, IL, SUA) într-o mașină de lustruit (Motopol 8; Buehler, Düsseldorf, Germania) și au fost sub -
depozitate în condiții de rezistență la lumină în salivă artificială timp de o săptămână la 37 ± 1 ° C înainte
de prelucrarea ulterioară; această procedură a permis maturizarea cimentului și efectele potențiale
minimalizate ale unei explozii de fluor inițial și scurgerea reziduurilor de monomeri pe proceduri
microbiologice. Saliva artificială a simulat compoziția medie de electroliți a salivei umane întregi și a fost
preparată de la 0,1 L de 150 mM KHCO3, 0,1 L de 100 mM NaCl, 0,1 L de 25 mM K2HPO4, 0,1 L de 24
mM Na2HPO4, 0,1 L de 15 mM CaCl2, 0,1 L de 1,5 mM MgCl2 și 0,006 L acid citric de 25 mM. Volumul a
fost de până la 1 L și pH-ul a fost ajustat la 7,0 prin pipetarea soluțiilor de NaOH 4 M sau HCl 4 M sub
agitare viguroasă [15]. Toate epruvetele au fost apoi curățate folosind apă distilată și vârfuri de perie
aplicatoare (3 M ESPE, Seefeld, G).

Design de studiu

Probele au fost alocate aleatoriu la patru grupuri cu protocoale de tratament diferite (a se vedea Fig. 1).
Saliva artificială din grupele AS-5, AS-5-brush și AS-5-exp a fost schimbată de două ori pe zi pentru a
simula un efect de îmbătrânire prelungită și o spălare continuă de fluor. Ulterior, eșantioanele au fost
transmise către analiza suprafeței și simularea de biofilm.

Caracteristicile suprafeței

Rugozitatea suprafetei

Rugozitatea suprafeței de la vârf la vale (Ra) a fost determinată pe cinci exemplare alese aleatoriu
pentru fiecare material și grup de tratament utilizând un dispozitiv profilometric de măsurare a
suprafeței de contact (Surtronic 3+, Taylor-Hobson, Leicester, Marea Britanie). O distanță de 1,75 mm a
fost măsurată pe trei linii alese aleatoriu scanează perpendicular pe canelurile de șlefuire așteptate
folosind un vârf de diamant standard (raza vârfului 2 µm, unghiul de vârf 90 °) și un nivel de tăiere de
0,25.

SCANARE microscopie electronică ȘI spectroscopie X-rAy cu dispersie electronică (SEM-EDS)

Analizele SEM-EDS au fost efectuate pe cinci exemplare pentru fiecare grup folosind un microscop
electronic de scanare pe tablă (TM4000Plus; Hitachi, Schaumburg, IL, SUA) echipat cu o sondă EDS (Q75,
Bruker, Berlin, Germania). Probele uscate au fost montate pe tije folosind bandă conductivă și au fost
analizate fără acoperire prin pulverizare, folosind atât un detector secundar de electroni (SE), cât și o
tensiune de accelerație de 5 kV în sarcină de suprafață
Table 1 – Materials used in the current study.
Name Type Abbreviation Manufacturer Composition
Ionostar plus high-viscosity glass HVGIC F – Al - Si glass; polyacrylic acid,
ionomer cement tartaric acid
VOCO, Cuxhaven,
Resin-modified glass
Germany F – Al - Si glass; polyacrylic acid, resin
Ionolux RMGIC
ionomer cement monomers
GrandioSo Resin-based RBC Resin: Bis-GMA, Bis-EMA, TEGDMA,
composite
camphorquinone, butylated
hydroxytoluene.
Filler: glass ceramic filler with an
average
particle size of 1 micrometer;
functionalized silicon dioxide
nanoparticles with a size of 20 −40
nm;

pigments (iron oxide, titanium

dioxide)

Human Enamel N/A

enamel

Fig. 1 - Diagrama de flux a proiectului de studiu.

în modul de reducere a încărcării la suprafață, pentru a furniza informații de la un strat superficial de
500 nm și un detector de electroni retras (BE) și o tensiune de accelerație de 15 KV în condiții normale
de vid. Ultimele condiții au fost, de asemenea, utilizate pentru analizele EDS. Trei câmpuri selectate
aleatoriu au fost achiziționate pentru fiecare specimen în modul SE (300 ×, 5000 ×), în modul BE (300 ×,
5000 ×), și cu sonda EDS la 300x în modul cadru complet folosind un timp de achiziție de 150 s.
Distribuția elementară la suprafață a fost obținută în modul hartă (2000 × –10.000 ×) folosind un timp de
achiziție de 600 s. Datele EDS au redat compoziția elementară a stratului superficial al specimenului
analizat (-1,5,5 µm).

Proceduri microbiologice

PREPARAREA SALIVEI

Saliva integrală a fost colectată de la cinci voluntari sănătoși, în conformitate cu un protocol publicat
anterior [16]. Voluntarii și-au dat consimțământul informat să participe și să se abțină de la igiena orală
timp de 24 de ore, nu au avut boală dentară activă și nu au avut antibioterapie timp de cel puțin 3 luni
înainte de experimente. Pentru colectarea salivei s-au folosit eprubete refrigerate. Pentru simularea
formării de pelicule salivare, saliva de la diverși donatori a fost reunită, încălzită la 60 ° C timp de 30 min
și centrifugată (12.000 × g, 4 ° C, 15 min).

Supernatantul a fost transferat în tuburi sterile, păstrat la −20 ◦C și decongelat la 37 ° C timp de 1 oră
înainte de experimente. Pentru a furniza un inocul pentru modelul microbiologic multispecie, saliva a
fost colectată și colectată în mod analog de la cei cinci donatori, dar a fost imediat folosită pentru a
inocula bioreactorul.

BACTERII

S. MUTANS ATCC 35668 a fost cultivat în conformitate cu un protocol publicat anterior [17]. Pe scurt,
plăcile de agar inoculate cu Mitis, Salivarius Bacitracina au fost incubate într-un mediu de 5% CO2
completat la 37 ° C timp de 48 de ore. Un total de 1% în greutate zaharoză a fost adăugată la o suspensie
pură a microorganismului în Brain Heart Infusion obținută din aceste plăci după incubarea peste noapte
într-un mediu de 5% CO2 suplimentat la 37 ° C. Celulele S. MUTANS au fost recoltate prin centrifugare
(2200 × g, 19 ° C, 5 min), spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și resuspendate.
Suspensia a fost supusă ulterior energiei ultrasonice de joasă intensitate (modelul Sonifier B-150;
Branson, Danbury, CT, SUA; care funcționează la o putere de 7-W timp de 30 de secunde) pentru a
dispersa lanțurile bacteriene. Suspensia a fost apoi ajustată la o valoare de 1,0 pe scala McFarland,
corespunzând unei concentrații microbiene de aproximativ 6,0 × 108 celule / mL.

FORMAREA biofilmului

Un total de 30 de exemplare pentru fiecare material și grup (AS-1, AS-5, AS-5-perie, AS-5-exp) au fost
alocate aleatoriu la trei modele microbiologice diferite (n = 10 pentru fiecare material și grup. , un model
rotund / microbiologic), incluzând un model microbiologic monospețial cu S. MUTANS și fie 24 h sau 48
h de incubare, fie un model microbiologic multispecie care utilizează salivă întreagă și 48 h de incubație.

Pentru simularea formării de biofilm, a fost utilizată o modificare a unui reactor de scurgere prin
picurare disponibil în comerț (DFR 110; Bio- Surface Technologies, Bozeman, MT, SUA). Proiectarea
modificată a permis plasarea eprubetelor personalizate pe fundul celulelor de curgere și imersarea
completă a suprafețelor epruvetei în mediul curgător din jur [18]. Exemplarele au fost distribuite
aleatoriu pe opt tăvi de teflon, care au fixat specimenul strâns și și-au expus suprafețele la mediul
înconjurător; tăvile erau montate cu presă pe partea de jos a fiecărei celule de curgere a reactorului.
Toate tăvile care conțin speciile și eprubetele au fost sterilizate înainte de experimente folosind un
chimioxid cu tehnologia plasmatică cu peroxid de hidrogen (Sterrad; ASP, Irvine, CA, SUA). Au fost
evitate deteriorarea provocată de căldură a eprubetelor prin limitarea temperaturii maxime la 45 ° C.
Întregul reactor a fost asamblat în interiorul unei hote sterile și transferat într-un termostat pentru a
funcționa la o temperatură standardizată de 37 ° C.

Pentru simularea formării de pelicule salivare, suprafețele epruvetelor din fiecare celulă de curgere au
fost expuse la salivă sterilă dezghețată timp de 24 de ore. Simularea formării de biofilm monospecie a
fost inițiată prin inocularea a 10 ml suspensie de S. MUTANS în fiecare celulă a primelor două
bioreactoare. Pentru simularea formării de biofilm cu mai multe specii, 10 mL de salivă întreagă umană
reunită au fost imediat inoculate în fiecare celulă a celui de-al treilea bioreactor. După 4 ore de incubare
în condiții statice pentru a permite aderența și colonizarea inițială a suprafețelor, a fost utilizată o
pompă peristaltică controlată pe computer multicanal (RP-1; Rainin, Emeryville, CA, SUA) pentru a
asigura un flux constant de bulion de nutrienți prin toate celulele de curgere pentru timpul de incubație
specificat. Bulionul de nutrienți sterili a fost îmbogățit cu 10,0 g / L zaharoză și a constat în 2,5 g / L
mucină (tip II, porcin gastric), 2,0 g / L peptonă bacteriologică, 2,0 g / L triptonă, 1,0 g / L extract de
drojdie, 0,35 g / L NaCl, 0,2 g / L KCl, 0,2 g / L CaCl2, 0,1 g / L clorhidrat de cisteină, 0,001 g / L hemin și
0,0002 g / L vita- min K1. Debitul a fost stabilit la 9,6 ml / h [17].

EVALUAREA BIOMASEI VIABILE

După o incubare de 24 de ore sau 48 de ore în modelul microbiologic mono- sau multispecie, biomasa
viabilă aderentă suprafețelor specimenului a fost evaluată cu un test bazat pe MTT [18]. Pe scurt, soluția
de stoc MTT a fost preparată prin dizolvarea a 5 mg / ml 3- (4,5) -dimetiltiiazol-2-il-2,5-difeniltetrazoliu
bromură în PBS steril; Soluția de stoc de metosulfat de fenazină (PMS) a fost preparată prin dizolvarea a
0,3 mg / ml de N-metilfenazinium metil sulfat în PBS steril. Soluțiile au fost stocate la 2 ° C în flacoane
rezistente la lumină până în ziua experimentului, când a fost preparată o soluție proaspătă de măsurare
(FMS) prin diluarea a 1:10 v / v de soluție stoc MTT și 1:10 v / v de soluție stoc PMS în PBS steril. S-a
preparat o soluție de lizare (LS) dizolvând 10% v / v de   sulfat de sodiu dodecil și 50% v / v
dimetilformamidă în apă deionizată. După incubarea de 24 h sau 48 h în modelul microbiologic mono-
sau multispecie, s-a oprit fluxul de bulion de nutrienți, s-au deschis celulele de curgere, iar tăvile care
conțin exemplarele au fost îndepărtate cu grijă și plasate imediat în vasele Petri. cu PBS steril la 37 ° C.
Probele au fost îndepărtate ulterior ușor din tavă, trecute într-o altă farfurie cu PBS steril la 37 ° C pentru
a îndepărta celulele neaderente și, în final, transferate în plăci cu 48 de godeuri. S-au adăugat 300 ul de
soluție FMS în fiecare godeu și plăcile au fost incubate timp de 3 ore la 37 ° C în condiții de izolare a
luminii. În timpul incubării, transportul de electroni pe membrana plasmatică microbiană și, într-o
măsură mai mică, sistemele microbiene redox au transformat sarea galbenă în cristale de forzanan violet
insolubile. Conversia la nivelul membranei celulare a fost facilitată de acceptorul intermediar de
electroni (PMS). Soluția FMS nereacționată a fost îndepărtată ușor și cristalele de forgan au fost
dizolvate prin adăugarea a 300 ul de LS la fiecare godeu. Plăcile au fost depozitate timp de o oră
suplimentară în condiții de rezistență la lumină la temperatura camerei; 100 pL de soluție au fost apoi
transferate în godeurile plăcilor cu 96 de godeuri. Absorbanța soluției a fost măsurată folosind un spec-
tropotometru (Genesys 10-S, Thermo Spectronic, Rochester, NY, SUA) la o lungime de undă de 550 nm,
iar rezultatele au fost afișate ca unități de densitate optică (OD).

Microscopie LASER-SCANARE Confocală

Un total de două exemplare pentru fiecare material și grup de tratament au fost îndepărtate ușor din
celulele de curgere, clătite de două ori cu PBS steril, colorate folosind kitul de viabilitate Biofilm
FilmTracerTM LIVE / DEAD® (Invitrogen Ltd., Paisley, Marea Britanie) și analizate folosind confocal
microscopie cu scanare laser (CLSM; Leica TCS SP2, Leica Microsystems, Wetzlar, Germania). Patru
secțiuni de stivă de imagini selectate aleatoriu au fost înregistrate pentru fiecare specificitate și timp de
incubație. Imaginile confocale au fost obținute folosind un obiectiv uscat (20 ×; NA = 0,7) și digitalizate
folosind Leica Application Suite Advanced Fluorescence Software (LAS-AF, Leica Microsystems) la o
rezoluție de 2048 × 2048 pixeli, cu un factor de zoom de 1,0 și o viteză de scanare de 400 Hz. Au fost
achiziționate trei canale; unul a prezentat o excitație la 405 nm și emisie la 420-470 nm pentru a scăpa
digital autofluorescența potențială. Celelalte două canale au avut o lungime de undă de excitație de 488
nm și emisia a fost dobândită la 500–570 nm (canal verde, bacterii vii) și 610–760 nm (canal roșu,
bacterii moarte). Pentru fiecare secțiune de stivă de imagini, reconstrucțiile de redare 3D au fost
obținute folosind ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA) și Drishti (Ajay Limaye,
Australian National University, CAN, AUS http://sf.anu.edu.au / Vizlab / drishti /).

Determinarea eliberării de fluor

Eliberarea de fluor din fiecare material a fost determinată înainte de simularea formării biofilmului.
Mediul de stocare a salivei artificiale de la fiecare grup de tratament a fost colectat pe parcursul unei
săptămâni, ceea ce a reprezentat un total total de patru măsurători pentru grupurile AS-5 și AS-5-perie.
Măsurile din grupul AS-1 au produs valori de bază pentru toate grupurile după prima săptămână de
păstrare în saliva artificială.Datorită protocolului de stocare analog în grupul AS-5-exp ca în grupul AS-5,
AS-5-exp nu a fost măsurat separat. Reîncărcarea cu fluor în eșantioane din grupul AS-5-exp a fost
identificată prin analizarea soluțiilor de fluorură de 5000 ppm în urma expunerii la diferite exemplare.
Cantitatea de fluor care a fost absorbită de epruvete a fost calculată pe baza diferenței dintre cantitatea
originală și cea reziduală de fluor din soluție. Cantitatea absorbită de fluor a fost calculată și afișată în
ppm / mm2 din suprafața materialului corespunzător. Această procedură a permis calcularea unei
funcții cinetice privind eliberarea de fluor din HVGIC și RMGIC în saliva artificială înainte și după
tratamentul cu fluor în grupele AS-5-brush și AS-5-exp. Toate analizele au fost efectuate folosind o
micro-metodă de selecție ionică, descrisă anterior [11]. Pe scurt, o soluție stoc cu o concentrație de fluor
de 1000 ppm a fost diluată în mod corespunzător cu salivă artificială pentru a obține standarde de fluor
cu concentrații de fluor cuprinse între 0,0019 și 64 părți pe milion (ppm). O curbă de calibrare a fost
obținută prin măsurarea standardelor de fluorură folosind un contor digital de pH / mV (SA-720, Orion
Research Inc, Boston, MA, SUA). Amestec de acetat de sodiu 20% v / v cu EDTA ca ajustator de rezistență
ionică a fost adăugat la fiecare standard înainte de analize. S-a preparat un standard de referință negativ
(fluorură de 0 ppm) adăugând 20% v / v de tampon de acetat de sodiu cu EDTA la saliva artificială;
această soluție a fost folosită și pentru clătirea electrozilor între măsurători unice.

Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate utilizând software-ul JMP 10.0 (SAS Institute, Cary, NC, SUA).
Distribuția normală a datelor a fost verificată folosind testul Shapiro – Wilk și omogenitatea variabilelor
a fost verificată folosind testul lui Levene. Mijloacele și erorile standard au fost calculate din datele
brute. Datele privind duritatea suprafeței au fost transformate în jurnal înainte de analiza statistică
pentru a aborda distribuția normală. Analiza bidirecțională a varianței (ANOVA) a fost utilizată pentru a
analiza rugozitatea suprafeței, EDS și datele viabile ale biomasei, considerând „materialul” și
„tratamentul” ca factori fixi. Eliberarea de fluor a fost analizată folosind ANOVA cu trei căi, stabilind
„material”, „tratament” și „punct de timp” ca factori fixi. Testul lui Tukey a fost aplicat pentru analize
post-hoc. Nivelul de semnificație (a) a fost stabilit la 0,05.

3. Rezultate

Analize de suprafață

Detalii despre rugozitatea suprafeței diferitelor materiale și eprubete sunt afișate în Fig. 2. Au fost
identificate diferențe semnificative între materiale (HVGIC> RMGIC (p = .035), RMGIC = email (p = .113),
email> RBC ( p = .005). Diferitele tratamente nu au influențat rugozitatea RMGIC, în timp ce depozitarea
în saliva artificială a crescut ușor rugozitatea suprafeței HVGIC și RBC și a scăzut rugozitatea suprafeței
smalțului. Periaj cu pastă de dinți în grupul AS- 5 perii au condus la o ușoară scădere a rugozității
suprafeței pentru RBC și HVGIC în comparație cu celelalte grupuri. HVGIC și RMGIC au apărut foarte
asemănătoare în analizele SEM (Fig. 3, AS-1), cu particule ascuțite de câțiva microni încorporate într-o
matrice mai ușoară. RMGIC părea să aibă mai multe particule de umplutură foarte strânse și mai puține
fisuri și bule decât HVGIC. Pentru toate materialele, au fost identificate canelurile paralele cauzate de
procedurile de lustruire. RBC a arătat o suprafață foarte omogenă, cu particule de umplere care variază
de la micro-nano-scară încorporate într-o matrice de rășină. Structuri prismatice caracteristice au fost
identificate pentru smalț în modul electronic retras.

După 5 săptămâni de depozitare (AS-5), au fost identificate mai puține fisuri pe suprafața HVGIC și
RMGIC. Tratamentul cu soluție de fluor puternic concentrată (grup AS-5-exp) nu a produs diferențe
relevante în morfologia suprafețelor. Periajul dinților (peria de grup AS-5) a produs schimbări distincte în
aspectul suprafeței de HVGIC și, în special, RMGIC. Pentru RMGIC, periajul a îndepărtat particulele de
umplutură pe suprafață ceea ce a determinat o expunere a matricei. Pentru suprafețele RBC și email, nu
au fost identificate modificări.

Tabelul 2 indică compoziția suprafeței diferitelor materiale după diferitele tratamente, astfel cum au
fost obținute de EDS. Timpul de stocare s-a corelat cu o scădere semnificativă a nivelului de fluor de
suprafață pentru HVGIC și RMGIC. Tratamentul cu fluorhidrat în grupuri AS-5-brush și AS-5-exp a coincis
cu o creștere semnificativă a fluorurii de suprafață pentru aceste materiale, precum și a smaltului.
Tratamentul în grupul AS-5-exp a produs niveluri mai mari de fluorură de suprafață în HVGIC în
comparație cu valoarea inițială și cu peria AS-5, în timp ce tratamentul în peria AS-5 a produs niveluri
mai mari de fluorură de suprafață în smalț în comparație cu AS-5 -exp. Tratamentul în peria grupului AS-
5 a produs acumulare de titan pe suprafața de HVGIC, RMGIC și smalt.

Deoarece titanul este unul dintre ingredientele pastei de dinți (Tabelul 2), hărțile EDS (Fig. 4) au dovedit
un transfer de titan de la pasta de dinți la suprafața HVGIC, RMGIC și a smalțului după periaj (grupul AS-
5-perie) ; nu a fost identificat niciun titan pe suprafețele RBC.

3.2. Formarea biofilmului

Fig. 5a afișează rezultatele pentru formarea de biofilm monospecie S. MUTANS după 24 de ore. Ambii
factori, material și tratament, au influențat semnificativ formarea biofilmului (p <0,001). Biomasa viabilă
pe HVGIC a crescut ușor după incubația extinsă în saliva artificială (grupul AS-5) în comparație cu
valoarea de bază (grup AS-1); în grupul AS-5-brush și AS-5 exp
a dus la o reducere semnificativă a biomasei viabile în comparație cu grupul de referință AS-1 (p <0,05).
Nu au fost identificate diferențe semnificative în biomasă viabilă pentru RMGIC și RBC, ceea ce indică
faptul că tratamentele din peria AS-5 și AS-5-exp din grup nu au avut niciun efect relevant asupra
formării biofilmelor monospecie pe suprafața acestor materiale. Pentru smalt, ambele grupuri AS-5-
brush și AS-5-exp au arătat o scădere semnificativă a biomasei viabile (p <0.005). Fig. 5b afișează
rezultatele pentru formarea biofilmului monospecie S. MUTANS după 48 de ore. Au fost identificate mai
puține diferențe de biomasă viabilă între materiale și grupuri decât după 24 de ore și nu s-a observat
niciun efect al materialelor care eliberează fluor asupra biomasei viabile. Cu toate acestea, efectul
tratamentului cu fluor în grupurile AS-5-brush și AS-5-exp a fost încă evident. Ambii factori, material și
tratament, au influențat semnificativ biomasa viabilă (p = 0.009 și, respectiv, p = 0.005), deși nu au fost
identificate interacțiuni semnificative. Pentru HVGIC și RBC, s-a observat o biomasă viabilă ușor mai mică
decât în cazul smalțului (p <0.05). Ambele tratamente cu fluor (grupuri AS-5-brush și AS-5-exp) au arătat
 că biomasa semnificativ mai puțin viabilă a fost identificată în comparație cu celelalte două grupuri (p
<.01).

Table 2 – Surface elemental composition (wt%) of the various materials immediately after polishing procedures (T = 0) and
after the different treatment protocols as identified by energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS). Data identified for O, Na,
Mg, and K are not displayed. Different letters indicate statistically significant differences between groups (Tukey test, p <
0.05).
C F Al Si P Ba Sr Ca Ti Inorg.
T=0 20.97 c,d, 7.13 a, 8.22 a 8.00 c, 1.44 f,g, 0.00 e 8.97 b,c, 0.00 e 0.00 b 34.82 d,e
(1.26) e (0.21) b (0.30) (0.63) d (0.07) h,i (0.00) (0.90) d (0.00) (0.00) (1.88)
AS-1 20.22 b,c, 5.15 c 8.44 a 8.76 c 1.44 f,g, 0.00 e 9.17 a,b, 1.69 c,d 0.00 b 34.11 d,e,f
(0.35) d,e,f (0.10) (0.07) (0.06) (0.03) h,i (0.00) (0.15) c,d (0.16) ,e (0.00) (0.02)
HVGIC AS-5 18.98 c,d, 3.93 c 8.22 a 7.12 d, 3.70 d,e 0.00 e 9.95 a,b, 4.61 c,d 0.00 b 34.10 d,e,f
(2.30) e,f,g (0.30) (0.37) (0.79) e (1.49) (0.00) (0.05) c (1.58) (0.00) (0.06)
AS-5- 18.17 c,d, 5.84 b, 8.25 a 9.14 c 1.91 e,f, 0.00 e 8.24 c,d 2.89 c,d 0.27 a, 34.49 d,e,f
brush (0.24) e,f,g (1.02) c (0.21) (0.28) (0.24) g,h (0.00) (0.01) (0.77) ,e (0.05) b (0.74)
AS-5- 19.68 c,d, 8.30 a 8.00 a 7.37 d, 2.48 d,e, 0.00 e 9.28 b,c, 4.87 c 0.00 b 36.59 c,d,
exp (1.69) e,f (1.28) (0.36) (0.54) e (0.54) f (0.00) (0.24) d (1.49) (0.00) (0.94) e
T=0 28.40 a,b 5.62 b, 7.76 a 8.13 c, 2.05 e,f, 0.00 e 9.77 a,b, 0.30 e 0.00 b 34.13 e,f
(0.77) (0.51) c (0.17) (0.23) d (0.16) g (0.00) (1.07) c (0.15) (0.00) (1.51)
AS-1 25.64 a,b, 5.82 b, 8.01 a 7.97 c, 2.37 d,e, 0.00 e 10.14 a,b, 0.49 e 0.00 b 35.27 c,d,
(0.41) c,d (0.07) c (0.07) (0.09) d (0.05) f,g (0.00) (0.14) c (0.08) (0.00) (0.35) e,f
RMGIC AS-5 23.35 b,c, 5.36 b, 7.55 a, 7.11 d, 4.01 d 0.00 e 10.81 a,b 1.64 c,d 0.00 b 36.09 c,d,
(0.51) d,e (0.22) c (0.23) b (0.21) e (0.18) (0.00) (0.08) (0.68) ,e (0.00) (0.42) e
AS-5- 32.43 a 4.62 c 6.25 b 6.50 e 2.44 d,e, 0.00 e 7.97 d 2.33 c,d 0.58 a 28.59 f
brush (8.93) (1.30) (1.17) (0.62) (0.68) f (0.00) (1.36) (1.05) ,e (0.62) (2.22)
AS-5- 26.57 a,b, 7.16 a, 7.68 a 7.36 d, 2.68 d,e, 0.00 e 10.92 a 1.80 d,e0.00 b 36.92 c,d,
exp (1.12) c (0.66) b (0.32) (0.43) e (0.14) f (0.00) (0.29) (0.53) (0.00) (0.53) e
T=0 13.62 f,g,h 0.00 e 3.44 c 24.35 a 0.00 i 14.02 a 0.00 e 0.09 e 0.00 b 41.81 c
(0.51) ,i (0.00) (0.08) (0.33) (0.00) (0.46) (0.00) (0.06) (0.00) (0.77)
AS-1 13.99 e,f,g 0.07 e 3.69 c 23.94 a, 0.02 h,i 13.20 b 0.00 e 0.16 e 0.00 b 40.91 c,d,
(0.68) ,h,i (0.03) (0.06) (0.66) b (0.02) (0.05) (0.00) (0.07) (0.00) (0.71) e
RBC AS-5 14.77 e,f,g 0.18 e 3.59 c 22.51 b 0.29 g,h, 11.79 d 0.00 e 0.51 e 0.00 b 38.49 c,d,
(0.56) ,h,i (0.00) (0.06) (0.09) (0.31) i (0.72) (0.00) (0.41) (0.00) (0.25) e
 AS-5- 14.15 e,f,g 0.11 e 3.70 c 23.89 a, 0.03 h,i 13.16 b 0.00 e 0.15 e 0.03 b 41.00 c,d,
brush (0.18) ,h,i (0.00) (0.02) (0.19) b (0.04) (0.19) (0.00) (0.03) (0.03) (0.07) e
AS-5- 14.97 e,f,g 0.57 d, 3.61 c 23.71(0 a, 0.03 i 12.45(0 c 0.00 e 0.31 e 0.00 b 40.38 c,d
exp (0.22) ,h (0.05) e (0.03) .16) b (0.02) .24) (0.00) (0.09) (0.00) (0.23)
T=0 7.01 i 0.02 e 0.08 d 0.20 f 14.76 a 0.00 e 0.00 e 35.40 a 0.00 b 50.46 a,b
(0.78) (0.02) (0.04) (0.19) (0.66) (0.00) (0.00) (0.79) (0.00) (1.23)
AS-1 11.69 f,g,h 0.06 e 0.06 d 0.10 f 12.29 b,c 0.00 e 0.00 e 30.24 b 0.00 b 43.24 b,c
(0.83) ,i (0.01) (0.01) (0.02) (0.95) (0.00) (0.00) (2.21) (0.00) (3.27)
Enamel AS-5 17.11 d,e,f 0.01 e 0.09 d 0.30 f 11.00 c 0.00 e 0.00 e 27.19 b 0.00 b 39.52 c,d,
(0.99) ,g (0.01) (0.06) (0.01) (1.62) (0.00) (0.00) (3.23) (0.00) (5.53) e
AS-5- 7.55 h,i 0.89 d 0.08 d 0.38 f 14.05 a,b 0.00 e 0.00 e 34.88 a 0.26 a, 51.09 a
brush (1.07) (0.10) (0.06) (0.18) (0.99) (0.00) (0.00) (1.64) (0.27) b (2.71)
AS-5- 10.29 g,h,i 0.36 e 0.05 d 0.23 f 14.03 a,b 0.00 e 0.00 e 34.25 a 0.00 b 49.47 a,b
exp (1.76) (0.08) (0.03) (0.11) (0.19) (0.00) (0.00) (1.29) (0.00) (1.52)
Toothpa 31.29 0.30 0.02 7.15 0.00 () 0.00 0.00 0.00 1.52 10.05
ste (4.45) (0.29) (0.13) (1.18) (0.00) (0.00) (0.00) (1.61) (1.72)
Fig. 2 - Rugozitatea suprafeței diferitelor materiale după diferitele protocoale de tratament. Litere
diferite indică diferențe semnificative statistic între grupuri (testul Tukey, p <0,05).

Analizele CLSM efectuate pentru biofilme S. MUTANS după 48 de ore (Fig. 6) au indicat că atât
materialul cât și tratamentul au afectat viabilitatea și morfologia biofilmelor. După o săptămână de
stocare (grup AS-1), suprafețele RMGIC, RBC și email au afișat un biofilm complex cu mai multe straturi,
cu un raport foarte mare de celule viabile. Suprafețele HVGIC au afișat un biofilm mai subțire, cu un
raport mai mare de celule moarte, în special în apropierea suprafeței. După 5 săptămâni de păstrare
(grup AS-5), nu au fost identificate diferențe relevante în biofilmele pentru RMGIC, RBC și epruvete în
comparație cu grupul AS-1, în timp ce biofilmele de pe suprafața HVGIC au prezentat un raport mai mic
de celule moarte .

Periajul cu pasta de dinți conținând fluor (peria de grup AS-5) nu a produs nicio modificare a creșterii
biofilmelor pe RBC, în timp ce pentru RMGIC a fost identificată o reducere a biomasei aderente; cu toate
acestea, nu a fost observat niciun efect asupra viabilității sale. Pentru smalț, au fost identificate structuri
de biofilm mai puțin dense cu un raport mai mare de celule moarte, iar HVGIC a afișat biofilme cu cel
mai mare raport de celule moarte. Tratamentul cu soluție de fluor puternic concentrată (grupa AS-5-
exp) a avut un efect similar asupra biofilmelor dezvoltate pe HVGIC ca în peria AS-5. Biofilmurile formate
pe RMGIC și smalțul au arătat un raport mai mare de celule moarte în grupul AS-5-exp decât în grupul
AS-5-brush, în timp ce nu s-au identificat diferențe relevante între biofilme pe suprafețele RBC din toate
grupurile.

Rezultatele după simularea formării de biofilm în modelul multispecie sunt afișate în Fig. 5c. Atât
materialul, cât și tratamentul au influențat semnificativ biomasa viabilă (p <0,001). Nu s-au identificat
diferențe semnificative de biomasă viabilă între grupurile de tratament pentru materialele de restaurare
HVGIC, RMGIC și RBC, ceea ce indică faptul că tratamentul cu fluorescentă nu a avut efect asupra
biomasei viabile de pe suprafața acestor materiale în modelul de biofilm multispecie. Biomasa viabilă pe
email a fost semnificativ mai scăzută după tratament în conformitate cu protocoalele grupului AS-5-
brush și AS-5-exp (p <0.005).

3.3. Eliberarea de fluor

Eliberarea de fluor a fost semnificativ mai mare de la HVGIC decât de la RMGIC; nicio eliberare de fluor
nu a fost observată de la RBC, precum și smalț (Fig. 7a). A fost identificată o explozie de fluor relevantă
pentru HVGIC și RMGIC; pentru RMGIC, eliberarea de fluor s-a apropiat de un platou după o perioadă de
trei săptămâni. Tratamentul cu pastă de dinți în peria de grup AS-5 corelat cu o eliberare semnificativ
mai mare de fluor din HVGIC și RMGIC. Au fost observate efecte de interacțiune semnificative între cei
doi factori, ceea ce indică faptul că eliberarea de fluor depindea atât de material cât și de tratament.
Tratamentul cu fluorhidrat în grupuri AS-5-brush și AS-5-exp a redus semnificativ scăderea eliberării de
fluor din materialele bioactive. Pentru email, s-a observat o eliberare semnificativă și constantă de fluor
în urma tratamentului cu pastă de dinți în peria de grup AS-5. Expunerea la o soluție cu concentrație
mare de fluor în grupul AS-5-exp a dus la un aport mare de fluor de HVGIC și smalț (Fig. 7b). Pentru
grupurile de perii AS-1, AS-5 și AS-5, conținutul ridicat de fluoruri este corelat cu eliberarea mare de
fluor. Corelația este dată de jurnalul ecuației (degajare de fluorură (ppb / mm2)) = −0.505 + 1.048 *
Conținut de fluorură (%), p = 0.744.

Fig. 3 - Analiza microscopică electronică de scanare (SEM) a suprafeței diferitelor materiale. Un câmp
microscopic reprezentativ dobândit în modul de electroni retras (BE), cu o tensiune de accelerație de 15
kV și o mărire de 300 × pentru fiecare material și pentru fiecare grup de tratament. RMGIC a prezentat
caracteristici intermediare ale suprafeței între materialele HVGIC și RBC. Atât pentru HVGIC cât și RMGIC
se pot identifica fisuri și bule încorporate în timpul procedurii de amestecare. Datorită matricei de
rășină, RMGIC a prezentat mai puține fisuri și bule decât HVGIC. Pentru a afișa mai bine schimbările de
suprafață rezultate în urma procedurii de periere, a fost achiziționat un set suplimentar de imagini în
modul electron (SE) secundar, cu o tensiune de accelerație de 5 kV și o mărire de 300 ×. Ca în grupurile
AS-1, AS-5 și AS-5-exp, au fost identificate doar mici diferențe de morfologie de suprafață pentru toate
materialele, imaginile reprezentative ale fiecărui material din grupul de tratament AS-1 au fost
comparate cu peria AS-5. Periajul a afectat în mod relevant suprafața RMGIC și, într-o măsură mai mică,
a HVGIC. Periajul a provocat o abraziune a particulelor de umplutură și, în special pentru RMGIC, a
produs o suprafață formată în principal din matrice. Materialele RBC și email au prezentat suprafețe
foarte omogene care nu au fost modificate de diferitele tratamente.

4. Discutie

Studiul curentului a emis ipoteza că (1) reîncărcarea materialelor de restaurare cu fluor scade formarea
biofilmului pe suprafața lor și (2) efectul depinde de timp, biofilm și material. Rezultatele sugerează
acceptarea primei ipoteze de cercetare, deoarece pentru unele materiale de restaurare a fost identificat
un impact semnificativ al tratamentului cu fluor asupra formării biofilmului. A doua ipoteză de cercetare
poate fi, de asemenea, acceptată, deoarece efectul tratamentului cu fluor a arătat o dependență
relevantă de timp, de material și de modelul microbiologic folosit pentru simularea formării biofilmului.
Deși se depun eforturi noi în noile dezvoltări, nu există în prezent materiale de restaurare directe care să
garanteze înlocuirea cu succes a țesuturilor dinților naturali pentru întreaga viață a pacientului. În timp
ce RBC nanohidratele prezintă mai multe proprietăți favorabile, cum ar fi manevrarea ușoară, precum și
mecanica și estetica avantajoasă, aceste materiale au și unele puncte slabe, inclusiv degradarea
interfeței adezive prin factori endogeni și exogeni. Mai mult decât atât, RBC-urile nu prezintă o
capacitate de tamponare așa cum o fac țesuturile dinților naturale [19], ceea ce promovează formarea
de biofilme cariogene pe suprafața lor. În schimb, GIC-urile sunt materiale bioactive, deoarece
eliberează ioni activi biologic, cum ar fi fluide, sodiu, fosfat și silicat în țesuturile înconjurătoare și pot
absorbi și ioni din salivă. Eliberarea ionilor din GIC produce un strat bogat în ioni în țesuturile dintelui
adiacente, care este foarte rezistent la atacul acid [4]. Mai mult, s-a demonstrat că eliberarea de ioni din
GIC este semnificativ crescută în mediile acide [20], iar un efect tampon al GIC-urilor a fost dovedit [21].
Drept urmare, s-a demonstrat că aceste materiale pot împiedica demineralizarea țesuturilor naturale
dinte adiacente [22,23] și formarea de biofilm cariogen [24]. Cu toate acestea, eliberarea de fluor
urmează un model cinetic special, incluzând o fază inițială cu o eliberare foarte mare (adică efect de
explozie), care este urmată de eliberarea mai mică și constantă a fluorurii cu timpul. S-a raportat că
eliberarea de fluor din materii de restaurare este un proces complex, incluzând difuzarea apei în
material, dizolvarea sau schimbul de fluor în solid, precum și difuzarea fluorurii din material [25 ]. În
general, în studiul de față, a fost identificată o corelație logaritmică între conținutul de suprafață de fluor
și eliberare. Pentru GICs, explozia inițială de fluor a fost explicată prin eliberarea de fluorură legată slab
în matricea cimentului, în timp ce faza următoare este cauzată de eliberarea continuă de fluor din
particulele de sticlă ale cimentului, ca urmare a schimbului de ioni [ 5]. În ceea ce privește viteza de
eliberarea a fluorului din rășina modificată în comparație cu cimenturile ionomerice din sticlă
convenționale, au fost publicate rezultate controversate, care au fost atribuite materialelor selectate,
designului experimental și mediului de stocare [5,26,27 ]. Eliberarea mai mare de fluor din HVGIC în
comparație cu RMGIC observată în studiul curent ar putea fi explicată prin reacția de întărire a RMGIC,
care reduce sensibilitatea la umiditate [28]. Mai mult, ar putea fi posibil ca difuzarea apei în ciment să fie
inhibată de rețeaua polimerică a RMGIC, ceea ce afectează diluția de fluor [29].

Fig. 4 - Hărți cu spectroscopie cu raze X cu dispersie energetică (EDS) care afișează distribuția
elementelor pe suprafața diferitelor materiale din grupul AS-1 (mărire 10.000 ×). Un set de hărți a fost
achiziționat pentru toate materialele din peria grupului AS-5 la o mărire de 2000 ×, care arată depunerea
de elemente străine pe suprafața materialelor. În special, Ti a fost identificat pe fundul bulelor și fisurilor
din HVGIC și RMGIC, precum și a smaltului, care au rezultat din pasta de dinți care conține titan. Pentru
RBC, a fost observată prezența altor elemente precum Ca, P, Na și N, ceea ce indică faptul că periajul
poate modifica relevant compoziția elementară a suprafeței unui material dentar într-un mod foarte
complex.

Rezultatele studiului curent coroborează datele din studiile anterioare, care indică faptul că HVGIC și
RMG-ICs pot fi reîncărcate eficient cu fluor prin periaj cu o pastă de dinți care conține fluor sau
expunerea la soluții cu o concentrație mare de fluor, deși nivelurile de fluor eliberat nu a aproximat
valorile de bază. Corelațiile dintre datele EDS și eliberarea de fluor au indicat că expunerea la o soluție
cu o concentrație mare de fluor a avut un efect mai distinct asupra absorbției de fluorizare pe suprafață,
în timp ce periajul a avut un efect mai accentuat în creșterea eliberării de fluorură de la HVGIC și RMGIC
în timp. Nu este surprinzător, niciun nivel relevant de fluorescență nu a fost eliberat din RBC, iar
tratamentele cu fluor nu au produs niciun efect asupra eliberării de fluor pentru acest material. Aceste
observații coroborează datele anterioare care sugerează că numai RBC-uri care conțin fluor pot fi
reîncărcate cu fluor [14]. Indiferent de modelul microbiologic utilizat, a existat o tendință către o mai
mică formare de biofilm pe HVGIC în comparație cu RMGIC și RBC, în timp ce valorile cele mai ridicate au
fost identificate pentru email. Cu toate acestea, în eprubetele de smalt, tratamentele cu fluor au produs
o reducere semnificativă a formării biofilmului indiferent de modelul microbiologic aplicat. În timp ce o
tendință similară a fost identificată pentru HVGIC și RMGIC, efectul reîncărcării fluorurii asupra formării
biofilmului a fost mai puțin pronunțat decât în cazul smalțului și cel mai proeminent în modelul
microbiologic de 24 h S. MUTANS.

Deși cantitatea de biomasă a crescut semnificativ odată cu timpii de incubație prelungiți, analizele CLSM
efectuate pentru biofilme S. MUTANS după 48 de ore au indicat prezența unui strat de celule bacteriene
predominant moarte adiacente suprafeței de materiale de restaurare care au prezentat o eliberare
relevantă inițial de fluor, în timp ce în straturile externe ale biofilmelor a fost identificată o majoritate de
microorganisme viabile. În ceea ce privește acest aspect, studiile anterioare ale grupurilor noastre au
indicat faptul că prezența biofilmelor la suprafața materialelor de restaurare are un impact semnificativ
asupra eliberării de fluor de la suprafață [12]. Mai mult, sa raportat recent că tratamentul repetat cu
biofilme de S. MUTANS cu fluor a afectat în mod relevant compoziția și virulența lor, în timp ce
biovolumul general nu a fost afectat. Aceste observații au fost atribuite unei inițiative a producției de
polizaharide extracelulare [30]. Un studiu recent a evidențiat faptul că, pentru unele tulpini de S.
MUTANS, fluorul poate inhiba formarea biofilmului la concentrații de 100 ppm [31]. Deși nivelurile de
fluor eliberate din HVGIC și RMGIC au fost mult mai mici decât acest prag, reîncărcarea HVGIC și RMGIC
cu fluor a dus la o scădere semnificativă a formării biofilmului în modelul microbiologic al S. MUTANS
după 24 de ore. În ambele modele microbiologice, diferențele au fost mai puțin pronunțate după 48 de
ore și nu au avut o semnificație statistică. Aceste descoperiri indică faptul că o eliberare de fluor este
deosebit de relevantă pentru fazele anterioare ale formării biofilmului, care coroborează rezultatele
publicate anterior din grupurile noastre [12].

Fig. 5 - Formarea biofilmului (unități de densitate optică) pe diferitele materiale: (a) formarea de biofilm
S. mutans după 24 de ore. (b) formarea de biofilm S. mutans după 48 de ore (c) Formarea biofilmului în
modelul biofilm multispecie după 48 de ore. Diferite scrisori de tip superscript indică diferențe
semnificative statistic între grupuri (testul lui Tukey, p <0.05).
Datele studiului actual sugerează că smalțul poate să fie încărcat cu fluor și produce o eliberare
relevantă de fluor; periajul a fost mai eficient în încărcarea suprafeței emailului cu fluor decât expunerea
la o soluție cu o concentrație mare de fluor. S-a raportat că aplicarea unor substanțe dentifrice
conținând fluor provoacă preputarea materialului de tip fluorură de calciu pe suprafața smalțului, care
servește ca un rezervor de fluor determinat de pH [32]. Titty și colab. a analizat conținutul de minerale al
smaltului demineralizat care a fost periat cu diferite paste de dinți și supus ciclului de pH timp de 4
săptămâni. Autorii au identificat că pastele de dinți care conțin fluor au crescut semnificativ conținutul
de fluor de smalț; cu toate acestea, măsurătorile au fost efectuate o singură dată la sfârșitul perioadei
de tratament [33]. Interesant, în studiul curent, eliberarea de fluor din smalț a crescut aproape liniar pe
întreaga perioadă de tratament la epruvete care au fost periate cu pastă de dinți. Astfel, studiile viitoare
și extinse ar putea aborda în continuare această observație care poate avea o importanță translațională
în sfaturile pentru utilizarea pastelor de dinți care conțin fluor. Cu toate acestea, efectul ambelor
tratamente asupra formării biofilmului a fost la fel de semnificativ după 24 de ore pe biofilmul S.
MUTANS și după 48 de ore pe placa mixtă. Un motiv pentru acest comportament ar putea fi faptul că
biofilmele sunt sensibile la cantitatea de fluor eliberată și s-ar putea specula că eliberarea ar putea
depinde de suprafață și material. Aceste observații indică faptul că smalțul poate servi drept rezervor de
fluor care, dacă este reîncărcat în mod obișnuit, are un impact relevant asupra formării biofilmului.
Fig. 6 - Reconstituiri microscopice (CLSM) cu scanare laser confocal 3D (750 câmp × 750 um câmpuri) de
biofilme S. mutans (48 h) pe suprafața diferitelor materiale după diferitele tratamente. Celulele
bacteriene viabile sunt afișate ca celule bacteriene verzi și moarte ca roșii. Autofluorescența de la
suprafață poate fi identificată în mai multe câmpuri, în special pentru RBC și RMGIC, care este cauzată
de matricea de rășină. Nu au fost identificate diferențe relevante între biofilme pe suprafețele RBC din
toate grupurile. În grupul AS-1, RMGIC, RBC și email au afișat un biofilm complex cu mai multe straturi,
cu un raport foarte mare de celule viabile. Suprafețele HVGIC au arătat un biofilm mai subțire, cu un
raport mai mare de celule moarte, în special în apropierea suprafeței. În grupul AS-5, biofilmele de pe
suprafața HVGIC au prezentat un raport mai mic de celule moarte în comparație cu grupul AS-1. În
grupul AS-5-brush, HVGIC a prezentat biofilme cu cel mai mare raport de celule moarte, în timp ce
RMGIC a arătat o reducere a biomasei aderente, dar nici o reducere a viabilității. Structuri biofilm mai
puțin dense cu un raport mai mare de celule moarte au fost identificate pe email. Tratamentul în grupul
AS-5-exp a avut un efect similar asupra biofilmelor pe HVGIC ca al tratamentului în peria grupului AS-5.
Biofilmurile formate pe RMGIC și smaltul au arătat un raport mai mare de celule moarte în grupul AS-5-
exp decât în grupul AS-5-brush (Pentru interpretarea referințelor la culoare din această legendă, cititorul
este referit la versiunea web a Acest articol).

Nivelurile de fluor eliberate din smalț au fost, totuși, semnificativ mai scăzute decât pentru HVGIC și
RMGIC, ceea ce indică faptul că nu toți factorii care influențează formarea biofilmului pe smalț și
materiale de restaurare au fost încă identificați. Fernández și colab. a investigat impactul pe pasta de
dinți SnF2 și NaF asupra Biofilme S. mUTANS pe email și au arătat că numai tratarea biofilmelor cu pasta
de dinți SnF2 a redus semnificativ masa și grosimea biofilmului [34]. Acest fenomen a fost atribuit unui
efect antimicrobian al ionilor stannosi. Cu toate acestea, rezultatele studiului actual indică faptul că
aplicarea pastelor de dinți conținând NaF poate afecta semnificativ formarea biofilmului pe email.
Hărțile EDS indică faptul că particulele de titan din pasta de dinți sunt transferate pe suprafața diferitelor
materiale. Deși dioxidul de titan nu are efect antimicrobian în absența luminii ultraviolete, datele
sugerează că compoziția de suprafață este modificată în mod relevant prin procedeele de periere a
dinților. Rugozitatea suprafeței a fost identificată ca fiind cel mai important parametru de suprafață care
afectează formarea biofilmului pe materialele de restaurare dentare, iar înțelepciunea convențională
este aceea că formarea de biofilm este crescută pe suprafețe cu rugozitate ridicată la suprafață [35]. În
ceea ce privește acest aspect, în trecut a fost introdusă o valoare de prag la 0,2 µm, ceea ce implică
faptul că valori mai mici pentru rugozitatea suprafeței nu influențează în continuare formarea de biofilm
[36]. În studiul curent, rugozitatea semnificativ mai mare a suprafeței - care a fost semnificativ mai mare
decât pragul de 0,2 um - a fost identificată pentru HVGIC decât pentru RBC, însă biomasa viabilă a fost
semnificativ mai scăzută pe materialul ionomer de sticlă. Această observație subliniază că rugozitatea
suprafeței nu este singurul parametru care afectează formarea biofilmului pe suprafața materialelor de
restaurare și subliniază efectul fluorului eliberat din materiale asupra formării biofilmului.
Fig. 7 - (a) Eliberarea de fluor (ppb / mm2) identificată pentru grupurile de tratament AS-5 și AS-5 perie
după fiecare săptămână. Prima dată se referă la eprubete măsurate după prima săptămână de păstrare
(AS-1), care a fost identică pentru toate eprubete și grupuri de tratament. (b) Eliberarea de fluor (ppb) la
ultimul punct de măsurare înainte de a trimite eprubete la proceduri microbiologice. (c) Introducerea de
fluor în grupul AS-5-exp după tratamentul cu soluția de fluor. Cantitatea de admisie (ppm / mm2) a fost
calculată măsurând diferența de conținut de fluor a soluției de 50 ml conținând 5000 ppm fluorură în
care probele au fost imersate timp de 5 min sub agitare constantă înainte și după tratamentul
epruvetelor. În toate graficele, diferite litere de tip superscript indică diferențe semnificative statistic
între grupuri (testul lui Tukey, p <0.05).

În ceea ce privește tehnica SEM folosită pentru analiza suprafeței materialelor, elementele cu un număr
atomic mare tind să producă o cantitate mai mare de retragere, care este afișată sub formă albă într-o
imagine adusă de modul BE. Compozițiile pe bază de rășină sunt fabricate în mod regulat din materiale
de umplere cu număr mare de atomici (Si, Al, Ba, Sr) care sunt încorporate într-o matrice cu număr
atomic scăzut (C, O). Astfel, este deosebit de interesant să analizăm aceste materiale cu modul BE.
Datorită tipului de interacțiuni electronice, semnalul SE provine de la un strat mai superficial decât
electronii BE. Tensiunile de accelerație joasă (5 kV) furnizează informații dintr-un strat superficial (500
nm sau mai puțin), în timp ce tensiunile mai mari (15 kV) furnizează informații straturi mai adânci (1–1,5
µm). Prin selectarea unei tensiuni de accelerație scăzută în modul SE și corelarea imaginii cu informațiile
sub-suprafeței adunate prin tensiuni de accelerație mai mari în modul BE, este posibil să se identifice
mici modificări ale suprafeței, cum ar fi cele rezultate din periaj în studiul curent. Analiza RMGIC după
periere (perie de grup AS-5-) cu modul BE a arătat prezența unor cantități mari de elemente cu număr
atomic scăzut, probabil de origine organică. Cu toate acestea, imaginile de 5 kV adunate în modul BE au
indicat că periajul a provocat o abraziune a particulelor de umplutură din material, producând o
suprafață formată în principal din matrice de rășină. Deși nu s-au identificat diferențe relevante de
rugozitatea suprafeței, această observație ar putea servi drept o explicație de ce o reîncărcare unică cu o
soluție cu conținut ridicat de fluoruri a redus formarea de biofilm mai eficient decât periajul constant
care a eliminat particulele de umplutură care ar putea fi reîncărcate cu fluor. Autorii sunt conștienți de
faptul că datele din procesul actual trebuie interpretate în limitele unui studiu de laborator. Deși
biofilmele naturale de pe suprafața dinților și a materialelor dentare prezintă o varietate complexă de
microorganisme, modelele microbiologice monospeciale prezintă avantajele condițiilor experimentale
standardizate și reproductibile. S. MUTANS a fost identificat ca unul dintre principalii agenți cauzali ai
cariilor dentare [37,38], ceea ce justifică selecția sa pentru aplicare în modelul biofilmului monospecie.
Un studiu recent a evidențiat faptul că efectul fluorurii asupra formării biofilmului S. MUTANS depinde
de tulpina bacteriană folosită [31], ceea ce indică faptul că un model microbiologic monospecial cu o
singură tulpină de S. MUTANS nu poate aborda în mod adecvat toate aspectele interacțiunii cu fluor
eliberat din materiale dentare. Astfel, a fost în plus utilizat un model microbiologic multispecie care
folosea salivă întreagă de la diferiți donatori voluntari, care răspunde la interacțiunile complexe dintre
mai multe microorganisme din cavitatea bucală și contribuie la semnificația și validitatea datelor culese
din acest studiu. Cu toate acestea, datele studiului curent ar trebui coroborate prin studii clinice,
deoarece nu toate microorganismele pot fi cultivate în mod adecvat pe modelele de laborator.

5. Concluzie

Rezultatele studiului actual evidențiază faptul că tratamentul cu agenți conținând fluor poate afecta în
mod relevant formarea biofilmului pe suprafața cimenturilor și a smaltului ionomer din sticlă cu
vâscozitate ridicată și - într-o măsură mai mică - a cimenturilor cu ionomer din sticlă modificată cu rășină
privind formarea biofilmului pe compozite pe bază de rășină a fost identificată. Deoarece rezultatele au
arătat o dependență de condițiile experimentale și modelele de studii clinice aplicate ar trebui să fie
efectuate pentru a confirma aceste rezultate.

Referinte

[1] Rasines Alcaraz MG, Veitz-Keenan A, Sahrmann P, Schmidlin PR, Davis D, Iheozor-Ejiofor Z.
Direct composite resin fillings versus amalgam fillings for permanent or adult posterior teeth.
Cochrane Database Syst Rev 2014:CD005620.

[2] Skartveit L, Tveit B, Total B, Øvrebø R, Raadal M. In vivo fluoride uptake in enamel and dentin
fluoride from containig materials. J Dent Child 1990;57:97–100.

[3] Mukai M, Ikeda M, Yanagihara T, Hara G, Kato K, Nagagaki M, et al. Fluoride uptake in human
dentine from glass-ionomer cement in vivo. Arch Oral Biol 1993;38:1093–8.

[4] Sidhu SK, Nicholson JW. A review of glass-ionomer cements for clinical dentistry. J Funct Biomater
2016;7:16.

[5] Burke FM, Ray NJ, McConnell RJ. Fluoride-containing restorative materials. Int Dent J 2006;56:33–
43.

[6] Wiegand A, Buchalla W, Attin T. Review on fluoride-releasing restorative materials—fluoride

release and uptake characteristics, antibacterial activity and influence on caries formation. Dent
Mater 2007;23:343–62.

[7] Busscher HJ, Rinastati M, Siswomihardjo W, van der Mei HC. Biofilm formation on dental
restorative and implant materials. J Dent Res 2010;89:657–65.

[8] Brambilla E, Cagetti MG, Gagliani M, Fadini L, García-Godoy F, Strohmenger L. Influence of

different adhesive restorative materials on mutans Streptococci colonization. Am J Dent
2005;18:173–6.

[9] Andrucioli MCD, Faria G, Nelson-Filho P, Romano FL, Matsumoto MAN. Influence of resin-
modified glass ionomer and topical fluoride on levels of Streptococcus mutans in saliva and biofilm
adjacent to metallic brackets. J Appl Oral Sci 2017;25:196–202.

[10] Chau NPT, Pandit S, Cai JN, Lee MH, Jeon JG. Relationship between fluoride release rate and anti-
cariogenic biofilm activity of glass ionomer cements. Dent Mater 2015;31:e100–8.

[11] Hahnel S, Wastl DS, Schneider-Feyrer S, Giessibl FJ, Brambilla E, Cazzaniga G, et al. Streptococcus
mutans biofilm formation and release of fluoride from experimental resin-based composites
depending on surface treatment and S-PRG filler particle fraction. J Adhes Dent 2014;16:313–21.

[12] Hahnel S, Ionescu AC, Cazzaniga G, Ottobelli M, Brambilla E. Biofilm formation and release of
fluoride from dental restorative materials in relation to their surface properties. J Dent
2017;60:14–24.
[13] Gandolfi MG, Chersoni S, Acquaviva GL, Piana P, Prati C, Mongiorgi R. Fluoride release and
absorption at different pH from glass-ionomer cements. Dent Mater 2006;22:441–9.

[14] Naoum S, Ellakwa A, Martin F, Swain M. Fluoride release, recharge and mechanical property
stability of various fluoride-containing resin composites. Oper Dent 2011;36–4:422–32.

[15] Arvidsson K, Johansson EG. Galvanic currents between dental alloys in vitro. Scand J Dent Res
1995;93:467–73.

[16] Guggenheim B, Giertsen E, Schupbach P, Shapiro S. Validation of an in vitro biofilm model of

supragingival plaque. J Dent Res 2001;80:363–70.

[17] Ionescu AC, Brambilla E, Travan A, Marsich E, Donati I, Gobbi P, et al. Silver-polysaccharide
antimicrobial nanocomposite coating for methacrylic surfaces reduces Streptococcus mutans
biofilm formation in vitro. J Dent 2015;43:1483–90.

[18] Ionescu A, Wutscher E, Brambilla E, Schneider-Feyrer S, Giessibl FJ, Hahnel S. Influence of surface
properties of resin-based composites on in vitro Streptococcus mutans biofilm development. Eur J
Oral Sci 2012;120:458–65.

[19] Nedeljkovic I, De Munck J, Slomka V, Van Meerbeek B, Teughels W, Van Landuyt KL. Lack of
buffering by composites promotes shift to more cariogenic bacteria. J Dent Res 2016;95:875–81.

[20] Nicholson JW, Czarnecka B. Role of aluminum in glass-ionomer dental cements and its biological
effects. J Biomater Appl 2009;24:293–308.

[21] Nicholson JW, Czarnecka B, Limanowska-Shaw H. The long-term interaction of dental cements
with lactic acid solutions. J Mater Sci Mater Med 1999;10:449–52.

[22] Cury JA, De Oliveira BH, Dos Santos APP, Tenuta LMA. Are fluoride releasing dental materials
clinically effective on caries control? Dent Mater 2016;32:323–33.

[23] Tedesco TK, Bonifácio CC, Calvo AFB, Gimenez T, Braga MM, Raggio DP. Caries lesion prevention
and arrestment in approximal surfaces in contact with glass ionomer cement restorations—a
systematic review and meta-analysis. Int J Paediatr Dent 2016;26:161–72.

[24] Chau NPT, Pandit S, Jung J-E, Cai J-N, Yi H-K, Jeon J-G.Long-term anti-cariogenic biofilm activity of
glass ionomers related to fluoride release. J Dent 2016;47:34–40.

[25] Yap AUJ, Khor E, Foo S. Fluoride release and antibacterial properties of new-generation tooth-
colored restoratives. Oper Dent 1999;24:297–305.

[26] Kan KC, Messer LB, Messer HH. Variability in cytotoxicity and fluoride release of resin-modified
glass-ionomer cements. J Dent Res 1997;76:1502–7.

[27] Al-Naimi OT, Itota T, Hobson RS, McCabe JF. Fluoride release for restorative materials and its
effect on biofilm formation in natural saliva. J Mater Sci Mater Med 2008;19:1243–8.

[28] Wilson AD. Resin-modified glass-ionomer cements. Int J Prosthodont 1990;3:425–9.

[29] Mathis RS, Ferracane JL. Properties of a glass-ionomer/resin-composite hybrid material. Dent
Mater 1989;5:355–8.

[30] Pandit S, Jung JE, Choi HM, Jeon JG. Effect of brief periodic fluoride treatments on the virulence
and composition of a cariogenic biofilm. Biofouling 2017;34:53–61.

[31] Nassar HM, Gregory RL. Biofilm sensitivity of seven Streptococcus mutans strains to different
fluoride levels. J Oral Microbiol 2017;9:1328265.

[32] Lussi A, Carvalho TS. The future of fluorides and other protective agents in erosion and
prevention. Caries Res 2015;49(Suppl. 1):18–29.

[33] Titty TM, Shrikrishna SB, Rao A, Shenoy R, Natarajan S. Remineralizing effectiveness of calcium
sucrose phosphate and fluoride dentifrices: an in vitro study. Contemp Clin Dent 2018;9:276–82.

[34] Fernández CE, Fontana M, Smaraian D, Cury JA, Rickard AH, González-Cabezas C. Effect of
fluoride-containing toothpastes on enamel demineralization and Streptococcus mutans biofilm
architecture. Caries Res 2016;50:151–8.

[35] Teughels W, van Assche N, Sliepen I, Quirynen M. Effect of material characteristics and/or surface
topography on biofilm development. Clin Oral Impl Res 2006;17(Suppl. 2):68–81.

[36] Bollen CM, Lambrechts P, Quirynen M. Comparison of surface roughness of oral hard materials to
the threshold surface roughness for bacterial plaque retention: a review of the literature. Dent
Mater 1997;13:258–69.

[37] De Stoppelaar JD, van Houte J, Backer Dirks O. The relationship between extracellular
polysaccharide-producing streptococci and smooth surface caries in 13-year-old children. Caries
Res 1990;3:190–9.

[38] Forssten SD, Bjorklund M, Ouwehand AC. Streptococcus mutans, caries and simulation models.
Nutrients 2010;2:290–8.