Sarcinile de pregătire individuală a studentului

1. De descris elementele permanente de structură a celulei bacteriene.

Elementele constante (permanente, obligatorii)
- Peretele celular
Reprezintă un înveliş rigid ce înconjoară protoplastul bacterian.
Lipseşte la micoplasme. Se disting 2 mari grupe de bacterii în funcţie de structura PC:
1. Bacterii gram-negative (G-)
- Grosimea 10-12 nm; Neomogen, Flexibil.
- PG, stratul intern, constituie 1-20% din masa uscată a peretelui celular.
- Acizii teichoici lipsesc.
- Structurile speciale: 80%
- Lipoproteine
- Membrana externă: 2 rânduri de fosfolipide între care sunt intercalate proteine (porine)
- Lipopolizaharid - LPS

2. Bacterii gram-pozitive (G+)

- Uniform, cu pori mici
- Grosimea 20-80 nm (până la 300 nm)
- Componentul major (40-80%) reprezintă PG
Componente minore:
1. Acizii teichoici
2. Acizii lipoteichoici (identic cu acizii teichoici, intervin în adeziunea la celule şi au un efect toxic slab).
3. Proteine asociate peretelui celular: proteina A la Staphylococcus aureus, proteina M la Streptococcus pyogenes
4. La unele bacterii G+ peretele conţine o cantitate importantă de lipide sau ceruri, la altele (ex.: streptococi) peretele conţine
multe glucide.
Elementul comun al ambelor grupe peptidoglicanul
- Membrana citoplasmatică
 Înconjoară citoplasma
 Grosime 5 – 10 nm
 Alcătuită din:
- două straturi de molecule fosfolipidice
- între moleculele de fosfolipide se găsesc proteine
 La bacteriile gram-pozitive MCP formează invaginaţii, mezosomi (septali, laterali).
Funcţiile membranei citoplasmatice
 Reglează presiunea osmotică
 Controlează procesele de difuzie
 Conţine enzime ale metabolismului respirator
 Intervine în creşterea şi diviziunea bacteriei
 Este locul de sinteză al endotoxinelor

- Citoplasma
- Necompartimentată
- Lipsesc organitele celulare
- Formată din apă (80%), conţine nucleoidul, ribosomi (apr. 20 000 per celulă), incluziuni, plasmide, ioni, enzime, deşeuri, etc.
- Consistenţa densă (stare de gel)
- pH acid
Funcţii: sediul tuturor proceselor metabolice

Evidenţierea: prin orice metodă de colorare

- Nucleoidul
- Constituit din ADN bicatenar circular, uneori liniar, plasat liber în citoplasmă.
Funcţii: dirijează activitatea celulei (procesele de sinteză, creşterea, multiplicarea, diferenţierea celulei, replicarea proprie, etc)
 Evidenţierea:
- Microscopia electronica
- Metode speciale de colorare (Feulgen)
Feulgen: HCl….aldehida….react. Shiff….culoare roşie

- Ribosomii
Ribozomii, care sunt alcătuiţi din molecule de ARN şi proteine, au dimensiuni mai mici decât la eucariote şi pot fi localizaţi fie în zona
membranară fie în matrice, alcătuind reticulul ribozomal;

- Mezosomii
Mezozomii sau corpii membranoşi, care rezultă prin invaginări ale membrane plasmatice şi au un rol funcţional important în
creşterea suprafeţei şi în diviziunea celulară. Contribuie la sinteza peretelui celular, în procese secretorii ale metaboliţilor şi în
procesul de respiraţie;

Lucrul individual al studentului la partea practică:

1. De însușit colorația Gram:
Scopul: Această coloraţie împarte bacteriile în două grupe: bacterii Gram pozitive, colorate în violet şi bacterii Gram negative,
colorate în roşu. Diferenţa de culoare se datorează deosebirilor de structură, respectiv de permeabilitate ale peretelui celular.
Componentele: soluţie de lugol (soluţie iodo-iodurată de K); acidul ribonucleic celular ; alcool-acetonă sau alcool absolut ; fuxină;
safranină;
Etapele:
1. frotiul fixat la flacără se acoperă cu soluţie de cristal violet timp de 1 minut,
2. se spală lama cu lugol şi se acoperă cu lugol 2 minute (iodul serveşte ca
3. mordant în coloraţie);
4. se îndepărtează lugolul şi se decolorează câteva secunde cu alcool-acetonă sau
 5. 2 minute cu alcool absolut;
6. se spală cu apă;
7. se acoperă lama cu soluţie de fuxină fenicată diluată 1/10 câteva secunde;
8. se spală cu apă, se usucă şi se examinează la microscop cu obiectivul cu imersie.
Rezultatul: Colorația Gram evidențiază prezența microorganismelor, morfologia (forma, mărime,
dispoziție caracteristică), tinctorialitatea (Gram pozitive /Gram negative), frecvenţa PMN,
relația cu PMN neutrofile (intr- / extraleucocitari).
Concluzii: După examinarea directă microscopică a frotiurilor colorate Gram, microbiologul poate face
un raport preliminar pe care îl transmite medicului practician. Acesta va putea lua o decizie
terapeutică până la sosirea rezultatului culturii şi a antibiogramei.

De atașat exemple de imagini cu frotiuri de diferite microorganisme, pregătite de pe diferite medii de cultură, sau din diferite
prelevate clinice.
2. De însușit colorația Ziehl-Neelsen:
Scopul: Coloraţia Ziehl-Neelsen permite diferenţierea acestor bacterii după proprietatea lor de acido-alcoolo-rezistenţă.
Componentele: sursa de caldura (flacara); soluţie de fuxină fenicată Ziehl; o tijă metalică; un tampon
de vată; acid azotic diluat 1/3 sau acid sulfuric 1/5; soluţie de albastru de metilen;
Etapele:
1. se fixează frotiul la flacără;
 2. se acoperă frotiul cu soluţie de fuxină fenicată Ziehl, se încălzeşte până la apariţia vaporilor, repetându-se această încălzire de
3 ori în decurs de 10 minute (pentru încălzire se utilizează o tijă metalică care are montat un tampon de vată la unul din
capete; tamponul se umectează cu alcool şi se aprinde);
3. se decolorează cu acid azotic diluat 1/3 sau acid sulfuric 1/5 până dispare culoarea roşie;
4. se spală cu apă;
5. se recolorează cu soluţie de albastru de metilen 1-2 minute;
6. se spală cu apă, se usucă şi se examinează la microscop.
Rezultatul: Bacilii acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR) (baciul Koch şi bacilul leprei) sunt coloraţi în roşu pe
fondul albastru al preparatului. Restul microbilor prezenţi se colorează, de asemenea, în
albastru. Aceşti bacili nu pierd colorantul la decolorarea cu alcool şi acid datorită prezenţei
acidului micolic şi a proprietăţilor de permeabilitate selectivă a membranei celulare.

Concluzii: BAAR se mai pot colora şi cu substanţe fluorescente cum este auramina sau un amestec de
auramină-rhodamină, cu decolorare consecutivă cu un amestec de alcool şi acid. BAAR reţin
colorantul, ceea ce permite evidenţierea lor la microscopul cu fluorescenţă.

De atașat exemple de imagini cu frotiuri.

3.De însușit colorația Aujeszky:
Scopul: colorarea bacteriilor sporogene.
Componentele: soluţie de acid clorhidric 0,5%; soluţie de fucsină Zeihl; alcool clorhidric (acid sulfuric 5%); soluţie de albastru de
metilen Loeffler;
Etapele:
1. Produsul microbian în picătură groasă este expus la o margine de lamă.
2. Pe frotiul uscat la temperatura camerei se toarnă câteva picături de soluţie de acid clorhidric 0,5% şi se încălzeşte 1-2 minute până la
apariţia vaporilor, după ce se varsă excesul de acid de pe preparat.
3. Preparatul se spălă cu apă, se absoarbe excesul de apă şi se fixează în flacăra arzătorului.
4. Se acoperă lama cu soluţie de fucsină Zeihl. Se încălzeţte în flacăra arzătorului până la emitere de vapori.
5. Se decolorează frotiul repetat cu alcool clorhidric (acid sulfuric 5%) până rămâne incolor (cca 2 min).
6. Se spală abundent lama cu apă de robinet.
7. Se recolorează 3-5 minute cu soluţie de albastru de metilen Loeffler.
8. Preparatul se spălă cu apă, se absoarbe excesul de apă şi se examinează la microscop cu imersia.
Rezultatul: colorarea după AUJESZKY (sporul se colorează în roşu, iar citoplasma în albastru)
De atașat exemple de imagini cu frotiuri